完全性肺静脉异位引流（total anomalous pulmonary venous connection，TAPVC）是指4条肺静脉未能引流至左心房，而是连接至右心房或与右心房相通的静脉异位连接，最终导致携带氧气的动脉血无法经左心系统输送营养物质给体内器官^［1］。由于TAPVC患儿在心房水平没有足够的右向左分流，因此常伴有其他心脏畸形（如房间隔缺损、动脉导管未闭等）来代偿性地维持其生存^［2］。作为一种罕见的发绀型先天性心脏病（congenital heart disease，CHD），TAPVC的发病率占CHD的0.7%~1.5%^［3］，其死亡率高达80%^［4］；若不尽早接受干预治疗，该疾病则较易发展为肺动脉高压和心力衰竭。根据肺静脉异常连接部位的不同，CRAIG等^［5］将TAPVC分为心上型、心内型、心下型及混合型。近年来，随着分子生物学及医疗技术的不断发展，TAPVC的诊断及治疗技术均有所提高，但有关其具体的发病机制尚不明确。自1960年NEILL等^［6］报道了第一例TAPVC病例以来，其病因的相关研究多聚焦于肺静脉的发育异常以及对散发病例行基因测序筛选潜在致病基因方面，其中激活素受体样激酶1（activin receptor like kinase 1，ALK1）^［7］、视黄醇结合蛋白5（retinol-binding protein5，RBP5）、δ-肌聚糖（δ- sarcoglycan，δ-SG）^［8］等基因突变均已被证实与该疾病相关。但由于TAPVC是多基因导致的多表型的复杂疾病，因此探索其新的致病基因并从分子与细胞水平深入研究其所导致的发病机制，对于该疾病的预防及诊断具有重要的临床意义。

胰腺/十二指肠同源域蛋白1（pancreatic and duodenal homeobox 1，PDX1）又称为胰岛素启动因子1，是胰腺早期胚胎发育所必需的转录因子，其在维持β细胞功能中发挥关键作用^［9］。同时，PDX1基因的纯合缺失会导致胰腺发育不全^［10］。早在1970年，GÜRSON等^［11］首次报道了胰腺发育不全合并室间隔缺损病例，后续也有报道几例胰腺发育不全合并CHD的案例^［12-13］，但目前就这2种疾病的关联是偶然还是代表一种新型的胰腺/心脏综合征尚未有更进一步的探究。本研究通过提取TAPVC患儿和健康儿童的血液样本DNA并行全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）以筛选可能的致病基因，同时对该基因的有害突变位点及其可能调控的下游靶基因进行分析，探讨该突变引起的细胞功能变化，以期为TAPVC的发病机制研究提供新的思路。

选择2014—2019年于上海交通大学医学院附属新华医院及上海儿童医学中心心内科就诊的100例TAPVC患儿（患儿组），以及与其年龄、性别相匹配，与患儿无明显血缘关系的120例健康儿童（对照组）为研究对象。TAPVC患儿的入组标准：①年龄为0~8岁。②经超声心动图、彩色超声多普勒、心导管检查、心血管CT三维成像等任意一项检查确诊为TAPVC。排除标准：①存在单心室、法洛四联症、右心室双出口等其他复杂心脏结构畸形。②患有染色体相关疾病。

经过筛选，最终本研究共纳入患儿组78例、对照组100例，并对2组儿童的临床病历资料进行收集，包括辅助检查结果、性别、年龄等。

分别收集2组儿童外周静脉血样本。采用全血基因组DNA提取试剂盒，抽提该2组血液样本的DNA，并行质量监控。

将“1.2.1”部分获取的2组儿童的基因组DNA送上海伯豪生物技术有限公司进行WES。而后，采用GATK（the genome analysis toolkit）软件剔除测序基因的重复序列后，使用BWA工具（Burrows-Wheeler Alignment tool）将测序结果和参考基因组导入，用参数index和mem分别构建基因组的索引和比对算法，即与人类基因组对比；再使用GATK软件检查突变序列、校正碱基质量值后，依次行单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的关联分析、Fisher精确检验及基因负荷检验，以筛选潜在的致病基因。

通过基因组聚合数据库（Genome Aggregation Database，gnomAD）、外显子组聚合联盟（Exome Aggregation Consortium，ExAC）数据库、人类基因突变数据库（Human Gene Mutation Database，HGMD）等人群基因组数据库对“1.2.2”部分获得的致病基因的突变位点进行筛选，筛选条件为最小等位基因频率小于0.01。采用Annovar软件进行基因多态位点的功能注释，并通过Mutation Taster（http：//www.mutationtaster.org/）、SIFT（http：//sift-dna.org）、PolyPhen-2 （genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）网站对致病基因的突变位点进行功能评估：①Mutation Taster网站，预测结果为DC表示Disease causing（有害），结果为N表示Polymorphism（无害）。②SIFT网站，评分为0表明突变是有害的（也可用D表示），评分为1表明突变是无害的。③PolyPhen-2网站，评分越接近1表明危害越大，可严重影响其蛋白质功能，评估可用D表示有害。而后，采用Sanger测序对致病基因的有害突变位点进行检测。

同时，在NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中输入致病基因，获得各个物种的氨基酸序列文件后将其导入DNAMA软件，进行不同物种之间的保守性分析。

野生型PDX1质粒（pLVX-PDX1）及空载体质粒（pLVX）均购自吉凯基因生物有限公司。以pLVX-PDX1质粒为模板，设计构建突变质粒的引物，序列信息见表1。用KOD-Plus-Neo对模板进行定点突变得到突变质粒C237A、C237G，并对该突变质粒行Sanger测序（由生工生物工程有限公司完成），明确已构建成功后用于后续研究。

人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。于37 ℃、5% CO₂条件下，采用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素混合液的高糖培养基对HUVEC进行培养。待细胞生长至对数生长期时，用Lipo3000转染试剂分别向其中转染pLVX质粒、pLVX-PDX1质粒及突变质粒（C237A、C237G），依次记为空载（Vector）组、野生（Wt）组、CA突变（CA）组、CG突变（CG）组。转染48 h后弃去培养液，并用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）缓慢冲洗细胞3次，向其中加入含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养，以备后用。

采用Trizol分别裂解“1.2.5”部分获得的4组细胞，而后提取细胞总RNA。按照PrimeScript ^TM RT Master Mix说明书将其反转录为cDNA后行实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）检测。反应体系为10 μL，包括cDNA 1 μL，上游、下游引物各0.2 μL，TB Green 5 μL及ddH₂O 3.6 μL。反应条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，64 ℃ 34 s，共40个循环。以β-actin作为内参，采用2^-ΔΔCT法计算PDX1的相对表达量。qPCR的引物序列见表2。

采用RIPA和PMSF（1∶100）的混合液分别裂解“1.2.5”部分获得的4组细胞，收集蛋白样本后用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行浓度测定。而后，采用蛋白质印迹法（Western blotting）对PDX1的表达进行检测，具体操作详见说明书。其中，使用的一抗为PDX1和α-tubulin抗体，工作浓度均为1∶1 000，其对应的二抗工作浓度为1∶5 000。

采用STRING数据库（https：//string-db.org/）对PDX1进行蛋白质-蛋白质相互作用分析，即在上述网站中输入PDX1、已知的肺静脉发育相关以及文献报道的与TAPVC相关致病基因，以预测PDX1与其他蛋白相互作用的网络，寻找PDX1可能调控的下游靶点。同时，将蛋白质相互作用的网络图导入Cytoscape软件，以制作蛋白相互作用示意图。

采用qPCR对PDX1下游靶点基因进行检测，具体步骤方法同“1.2.5”“1.2.6”。设计人类基因SOX17的特异性引物，上游引物为5'-TCGGGGACATGAAGGTGAAG GG-3'，下游引物为5'-GAAAG TACCACACCCGATT CCTGC-3'。

采用SPSS 20.0软件对实验数据进行统计分析，并使用GraphPad Prism 7.0软件进行作图。定量资料以x±s表示，采用one-way ANOVA进行多组间比较。每组数据均进行3次独立的重复实验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

采用WES对患儿组、对照组的基因组DNA进行检测，而后通过GATK软件、BWA工具开展生物信息学分析，结果发现患儿组存在致病基因——PDX1。

采用Mutation Taster、SIFT、PolyPhen-2网站对PDX1的突变位点进行功能评估，共筛选出2个PDX1的有害突变位点。SIFT结果显示其位点的评分均为0（即突变是有害的），Mutation Taster网站预测该2个突变亦为有害突变，PolyPhen-2评分显示其位点评分分别为0.996、0.997分。随后，我们对携带有PDX1有害突变位点的2例患儿及对照组儿童的血液样本行Sanger测序，结果（图1）显示患儿的第237位外显子区c. C237A、c. C237G发生了改变，即第33位氨基酸由脯氨酸（CCC）分别突变成苏氨酸（CAC）、丙氨酸（CGC），且均为罕见的纯合突变；同时，这2个突变在对照组儿童中均未发现。2例患儿的相关突变信息见表3。

保守性分析的结果（图2）显示，该2个突变位点在人类、猩猩、鼠、海豚、斑马鱼等动物中高度保守。

采用qPCR对Vector、Wt、CA、CG组的PDX1表达进行检测，结果（图3A）显示，CA、CG组与Wt组间的表达差异均无统计学意义。Western blotting的结果（图3B、C）显示，与Wt组相比，CA、CG组细胞的PDX1蛋白表达有显著增加，其相对表达量分别为Wt组的2.9倍（P=0.000）、3.4倍（P=0.001）。

通过向STRING数据库输入PDX1、肺静脉发育、TAPVC等相关基因进行蛋白互作分析，并将分析结果导入Cytoscape进行作图，结果（图4）显示PDX1与转录因子SOX17（SRY-box transcription factor 17）、成纤维细胞生长因子10（fibroblast growth factors 10，FGF10）、胰岛素增强子结合蛋白（insulin gene enhancer binding protein-1，ISL1）间存在相互作用。

根据蛋白互作的结果以及相关文献^［14-19］，我们发现PDX1可能是通过SOX17参与肺血管发育。而后，我们通过qPCR对PDX1突变质粒转染的HUVEC细胞中的SOX17表达进行分析，结果（图5）显示，与Wt组相比，CA、CG组细胞的SOX17表达有所下降（均P=0.000）。

TAPVC的临床表现取决于肺血管的梗阻程度和压力；当存在较严重的梗阻时，患者在新生儿时期会出现肺动脉高压、充血性心力衰竭、低氧血症和代谢性酸中毒等症状，若不及时进行手术治疗其会在生后几天内死亡。研究^［20］发现，TAPVC可独立发生，也可合并无脾综合征、猫眼综合征等其他疾病发生。由于TAPVC具有散发性、异质性等特点，该疾病发生的遗传分子机制至今仍未被明确^［21］。近年来，有关TAPVC的研究主要聚焦于对其基因学和遗传学方面的研究，如SEMA3D（一种跨膜蛋白基因）被证明是至关重要的TAPVC相关基因^［22］。

在本研究中，我们分别收集了78例TAPVC患儿和100例健康儿童的血液样本，抽提基因组DNA并行WES。通过对WES数据进行SNP关联分析、Fisher精确检验及基因负荷检验，我们筛选出了TAPVC可能的致病基因——PDX1，这是本课题组前期研究^［23］已报道的致病基因ARHGEF16以外的、新发现的可能与TAPVC相关的候选基因。作为胰腺β细胞分化和成熟所必需的关键调节因子，PDX1是调节β细胞中的胰岛素基因表达的关键因子^［24］，且PDX1的杂合突变与糖尿病的发生有关，包括Ⅳ型成熟期糖尿病（maturity-onset diabetes of the young Ⅳ，MODY Ⅳ）和非MODY Ⅱ型糖尿病。

本研究发现，PDX1的同一位点有2个不同的罕见纯合突变（即c.C237A：p.P33T 和c.C237G：p.P33A）；采用PolyPhen-2、SIFT和Mutation Taster网站对突变位点进行功能评估，发现这2个突变均为“致病性”突变；保守性分析显示，突变位点的基因序列在人类、猩猩、鼠、海豚、斑马鱼等动物中高度保守，提示这一位点的突变可能会影响其蛋白功能。将PDX1的野生型质粒及2个突变质粒转染HUVEC后，qPCR和Western blotting的结果显示，与野生组相比，2个突变组的PDX1 mRNA表达无显著变化，但蛋白表达有显著上调，提示该2个突变可能会影响PDX1转录后翻译。

此外，本研究通过蛋白互作网络分析后发现，PDX1与FGF10、ISL1及SOX17存在密切关系。且有研究^［14］发现，FGF10、ISL1是PDX1的上游调控基因，可在胰岛素基因调节及胰腺发育过程中发挥重要作用。FGF10在多种组织形态中可通过调控间充质-上皮信号通路发挥重要作用，如在胰腺上皮祖细胞中其可通过PDX1来调控祖细胞的增殖^［14］；ISL1可通过结合PDX1来激活胰岛素1启动子，从而调控胰岛素基因的表达^［15］。而针对于转录因子SOX17与PDX1的调控关系，目前尚未明确。SOX17位于8号染色体，由2个外显子构成，可广泛表达于成人的心脏、肺等器官，且能够在胚胎及出生后的心血管^［16］、肺血管^［17］发育中发挥重要作用。近期的研究发现，SOX17是与肺动脉高压相关的多种信号通路的关键参与者，如可参与Notch^［18］、血管内皮生长因子^［19］信号传导等，也可与磷酸化细胞信号转导分子SMAD3相互作用抑制转化生长因子β1介导的转录，从而影响肺上皮细胞和造血细胞的增殖。

随后，本研究针对PDX1及其突变体对SOX17表达的影响进行分析。结果显示，与空载组相比，PDX1过表达可上调HUVEC中SOX17的表达，但PDX1突变则会下调SOX17的表达水平，这与该突变可上调其自身基因、蛋白的表达相反。继而提示，PDX1突变可能不是通过上调其自身蛋白的表达来调节其下游SOX17的表达，或可能通过影响蛋白质的空间构象或存在其他可能的调控机制，而这些推测均需要更进一步的实验加以验证。综上所述，我们的研究发现PDX1的罕见的错义突变c.C237A（p.P33T）和c.C237G（p.P33A）可影响该基因的蛋白表达，且PDX1及其突变体均可调节下游SOX17的表达。结合本研究结果以及上述文献报道，我们推测PDX1很可能是通过调节SOX17的表达来影响TAPVC发生中的血管发育的调节。但目前，有关PDX1和SOX17的具体调控关系尚未见文献报道，仍需进一步更深入的研究，这也将是本课题组接下来要聚焦的研究方向。