乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，在女性高发的恶性肿瘤中其死亡率居第二位，严重威胁着女性的生命和健康^［1］。研究^［2］显示，乳腺癌的转移和复发是患者死亡的主要原因，其具体机制尚未被明确。本课题组的前期研究^［3-5］发现，四次跨膜蛋白（tetraspanin，TSPAN）家族在乳腺癌的转移、耐药和干性维持中发挥了重要作用。TSPAN家族由33个成员组成（TSPAN1~33），其结构含有4个高度保守的疏水跨膜结构域。相关研究^［6］显示，TSPAN家族蛋白可与整合素、主要组织相容性抗原、T细胞受体、生长因子受体等跨膜蛋白组成超模体结构TEM（tetraspanin-enriched microdomain），将胞外信号传导至胞内，以调节乳腺癌细胞的恶性表型；同时，该家族蛋白还可通过外泌体调节乳腺癌细胞与肿瘤微环境的相互作用，以促进乳腺癌的进展。

有研究表明，TSPAN1可在肝癌^［7］、胰腺癌^［8］、结直肠癌^［9］和卵巢癌^［10］等多种癌细胞中高表达，促进恶性肿瘤的发生和发展。然而，鲜少有关其在乳腺癌中的研究报道。Wu等^［11］的研究虽以乳腺癌细胞为对象，但细胞类型相对单一，所获临床数据亦较少，尚不能充分揭示TSPAN1在乳腺癌发生发展中的作用。基于此，本研究结合生物信息学分析，检测TSPAN1在乳腺癌组织中的表达，并通过体外功能实验探究TSPAN1在乳腺癌细胞迁移、侵袭中的作用，从而为TSPAN1作为乳腺癌的治疗靶点提供理论依据。

选择2020年1月—2021年12月的上海交通大学医学院附属第一人民医院的106例乳腺癌手术患者为研究对象，获取其癌组织及癌旁组织，并经石蜡包埋制成组织芯片。收集乳腺癌患者的临床特征信息，包括总TNM分期、M分期、N分期和病理学分级。

从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中下载乳腺癌组织和癌旁组织的转录组测序数据，采用R4.0.1软件对组织中TSPAN1 mRNA表达水平的差异进行分析；下载乳腺癌患者的临床特征信息（包括肿瘤总TNM分期和N分期），分析TSPAN1 mRNA的表达与该临床特征信息的相关性。

人Luminal A型乳腺癌细胞系MCF-7，人三阴性乳腺癌细胞系SUM149PT、SUM159PT、MDA-MB-468、MDA-MB-231，以及人表皮生长因子受体2过表达型乳腺癌细胞系SK-BR-3均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

免疫组化试剂盒（碧云天生物技术有限公司），DMEM培养基、青-链霉素混合双抗（Gibco，美国），转染试剂Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific，美国），TSPAN1 siRNA及阴性对照siRNA（广州瑞博生物公司），兔源TSPAN1抗体、鼠源β-actin抗体、兔源波形蛋白（vimentin）抗体、兔源E-钙黏蛋白（E-cadherin）抗体（Proteintech，美国），鼠源N-钙黏蛋白（N-cadherin）抗体（Cell Signaling Technology，美国），Transwell小室（Corning，美国）。

生物安全柜和细胞恒温培养箱（Thermo Fisher Scientific，美国），光学显微镜（Nikon，日本），水浴锅（拓赫机电有限公司），摇床振荡器（普瑞博仪器有限公司），离心机（Eppendorf，德国）。

采用免疫组织化学染色（immunohistochemistry staining，IHC）检测组织芯片中TSPAN1的表达，即将石蜡包埋的组织经染色、脱水、封片后于光学显微镜下观察组织染色的情况。其中，一抗为TSPAN1抗体（工作浓度为1∶800），对应二抗的工作浓度为1∶1 000。

分别由2位实验人员采用双盲阅片的方式，对上述组织染色情况进行评分。于镜下随机选取每例组织的5个视野，按如下规则进行评分：① 阳性细胞占比：≤5%记为0分，6%~25%记为1分，26%~50%记为2分，51%~75%记为3分，>75%记为4分；该占比百分数仅取整数。② 染色强度：淡黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分。③ 将阳性细胞占比得分与染色强度得分相乘，记为免疫组化的总评分。

而后，对TSPAN1表达与乳腺癌患者的临床特征进行相关性分析。

于37 ℃、5%CO₂恒温培养箱中，使用含10%胎牛血清和1%青-链霉素混合双抗的DMEM培养基分别培养MCF-7、SUM149PT、SUM159PT、MDA-MB-468、MDA-MB-231、SK-BR-3细胞，当其生长融合至70%~80%时使用胰酶消化并传代。

使用含1%蛋白酶抑制剂的细胞裂解液分别提取上述6种野生型细胞的总蛋白，采用蛋白质印迹法（Western blotting）检测TSPAN1的表达，并选取TSPAN1表达较高的2种细胞进行后续细胞实验。其中，使用的一抗为TSPAN1抗体，其工作浓度为1∶1 000，对应的荧光二抗的工作浓度为1∶5 000。

分别使用Control siRNA、TSPAN1 siRNA转染“1.4.3”部分获得的2种细胞。转染8 h后换液，继续培养48 h后提取上述4种细胞的总蛋白开展后续相关功能实验。转染实验的siRNA序列见表1。

获取“1.4.4”部分中4种已转染细胞的总蛋白，采用Western blotting分别检测TSPAN1和EMT相关蛋白（E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白和波形蛋白）的表达，以验证转染效率以及下调TSPAN1对EMT相关蛋白表达的影响。其中，使用的一抗为TSPAN1抗体、E-钙黏蛋白抗体、N-钙黏蛋白抗体、波形蛋白抗体，其工作浓度分别为1∶1 000、1∶2 000、1∶800、1∶1 500，对应的荧光二抗的工作浓度均为1∶5 000。

采用细胞划痕实验检测“1.4.4”部分获得的已转染细胞的迁移能力。待上述细胞生长融合至90%时，使用枪头刮划细胞产生划痕，更换无血清DMEM培养基后继续培养24 h，并于显微镜下拍照，观察细胞划痕的愈合率。

采用细胞侵袭实验检测“1.4.4”部分获得的已转染细胞的侵袭能力。在预先铺好基质胶的Transwell小室中分别加入2×10⁵个上述细胞，下室中加入500 μL 10%胎牛血清的DMEM培养基。24 h后取出小室，使用甲醇室温固定细胞15 min，结晶紫染色30 min，再用棉签擦去小室膜上侧的细胞并于显微镜下拍照，随机取3个视野进行细胞计数。

采用GraphPad Prism 8.0软件进行作图，并运用SPSS 26.0软件进行统计分析。符合正态分布的定量资料以x±s表示，使用t检验进行2组间比较，使用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行多组间比较；不符合正态分布的定量资料以M（Q₁，Q₃）表示，使用Mann-Whitney U检验进行2组间比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。

采用IHC对组织芯片中TSPAN1的表达进行分析，结果（图1A、B）显示TSPAN1在癌组织中的表达高于癌旁组织（P=0.000）。随后，对TSPAN1的表达与患者的不同临床特征的相关性进行分析，结果（图1C~F）显示，TSPAN1在较高TNM分期（即Ⅲ~Ⅳ期）的乳腺癌组织中的表达高于较低TNM分期（即Ⅰ~Ⅱ期），在M1期的乳腺癌组织中的表达高于M0期，在较高N分期（即N2~N3期）的乳腺癌组织中的表达高于较低N分期（即N0~N1期），在病理学分级G3级的乳腺癌组织中的表达高于G1、G2级（均P<0.05）。

对来自TCGA数据库的转录组测序数据进行分析，结果（图2A）显示，TSPAN1 mRNA在乳腺癌组织中的表达高于癌旁组织（P=0.000）。对TSPAN1 mRNA的表达与患者总TNM分期、N分期的相关性进行分析，结果（图2B、C）显示TSPAN1 mRNA在TNM Ⅲ~Ⅳ期的乳腺癌组织中的表达高于TNMⅠ~Ⅱ期（P=0.007），在N2、N1期的乳腺癌组织中的表达均高于N0期（均P<0.05）。

首先，本研究采用Western blotting检测不同乳腺癌细胞中TSPAN1的表达，结果（图3A）显示TSPAN1在MDA-MB-231、SUM159PT细胞中的表达高于其他乳腺癌细胞。随后，向上述2种细胞分别转染TSPAN1 siRNA、Control siRNA，并行Western blotting检测TSPAN1的表达；结果（图3B）显示，与转染Control siRNA相比，转染TSPAN1 siRNA的该2种细胞中的TSPAN1表达有所下降（均P<0.05），即TSPAN1 siRNA转染成功。

分别采用细胞划痕实验、细胞侵袭实验检测上述已转染的MDA-MB-231和SUM159PT细胞的迁移和侵袭能力，结果（图3C、D）显示，转染TSPAN1 siRNA的乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力均低于转染Control siRNA的乳腺癌细胞（均P<0.005）。

使用Western blotting检测已转染的MDA-MB-231和SUM159PT细胞中EMT相关蛋白的表达，结果（图4）显示与转染Control siRNA相比，转染TSPAN1 siRNA的MDA-MB-231和SUM159PT细胞的上皮表型标志物E-钙黏蛋白的表达均较高，间质表型标志物N-钙黏蛋白、波形蛋白的表达均较低（均P<0.05）。

自1970年以来，乳腺癌的发病率呈逐年上升的趋势，已成为威胁现代女性健康的主要疾病^［12］。虽然新型药物的应用已显著提高了该类患者的治疗反应率、无进展生存率和总生存率，但绝大多数患者仍面临着肿瘤转移和复发的挑战^［13-14］。因此，探寻新的分子靶点、开发新型靶向药物对于该疾病的治疗十分重要。

本研究中，我们聚焦四次跨膜蛋白家族成员TSPAN1，研究其在乳腺癌中的作用。通过IHC对临床样本进行分析后发现，TSPAN1在乳腺癌组织中高表达，其表达水平与肿瘤的总TNM分期、M分期、N分期和病理学分级相关，继而提示TSPAN1可作为乳腺癌治疗的特异性靶点。随后，我们结合生物信息学对TSPAN1 mRNA在乳腺癌中的表达行进一步分析，结果显示TSPAN1 mRNA在乳腺癌组织中高表达，且其表达水平与肿瘤的总TNM分期、N分期相关。接着，我们使用TSPAN1 siRNA分别转染MDA-MB-231、SUM159PT细胞后发现，下调TSPAN1可抑制细胞的迁移和侵袭，同时上调E-钙黏蛋白的表达、下调N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达，继而提示TSPAN1可促进乳腺癌细胞的迁移、侵袭及EMT，但其具体机制仍需进一步探究。

尽管有研究^［11］已针对TSPAN1能够促进乳腺癌的进展进行报道，但其研究对象并未涉及三阴性乳腺癌细胞。本研究中，我们探讨了TSPAN1对三阴性乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力的影响，是对前人研究的补充和扩展。另外，本课题组的前期研究^{［4-5，15］}发现，在表皮生长因子的刺激下，TSPAN8可通过核转位调控下游促癌基因的表达并促进肿瘤的发生和发展；继而表明，TSPAN家族蛋白可能具有更加复杂和多样的功能。然而，TSPAN1是否也具有上述功能值得我们进一步研究。

本研究尚存在一定的不足之处：① 选用细胞系种类不足，研究中未能涵盖乳腺癌全部病理类型。② 未开展有关TSPAN1促进乳腺癌细胞迁移、侵袭的作用机制研究。综上，本研究表明TSPAN1在乳腺癌组织中高表达，可促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭，该结果或将为进一步探索乳腺癌的潜在治疗靶点提供参考。