恶性肿瘤荧光成像的研究进展

doi:10.3969/j.issn.1674-8115.2023.04.010

恶性肿瘤荧光成像的研究进展

王文博^,¹, 张方蓉², 石亭旺¹, 陈云丰^,¹

1.上海交通大学医学院附属第六人民医院骨科，上海 200233

2.西安电子科技大学广州研究院，广州 510555

Advances in fluorescence imaging of malignant tumors

WANG Wenbo^,¹, ZHANG Fangrong², SHI Tingwang¹, CHEN Yunfeng^,¹

1.Department of Orthopaedics, Shanghai Sixth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200233, China

2.Guangzhou Institute of Technology, Xidian University, Guangzhou 510555, China

通讯作者: 陈云丰，电子信箱：chenyf@sjtu.edu.cn。

编委: 邢宇洋

收稿日期: 2022-09-06 接受日期: 2023-02-21 网络出版日期: 2023-04-28

基金资助:

国家自然科学基金.  82172455
上海交通大学“交大之星”计划医工交叉研究基金.  YG2021ZD22
上海市科学技术委员会“科技创新行动计划”生物医药科技支撑专项项目.  22S31900200

Corresponding authors: CHEN Yunfeng, E-mail:chenyf@sjtu.edu.cn.

Received: 2022-09-06 Accepted: 2023-02-21 Online: 2023-04-28

作者简介 About authors

王文博（1999—），男，博士生；电子信箱：Wang-wen-bo@sjtu.edu.cn。 E-mail：Wang-wen-bo@sjtu.edu.cn。

摘要

恶性肿瘤是威胁人类健康的常见疾病，早期诊断并完整切除可显著改善恶性肿瘤患者的预后。目前，临床上用于恶性肿瘤检查的影像学技术多存在灵敏度和时空分辨率差、成像扫描时间长等问题，无法对其行早期诊断，也难以满足手术导航的要求。作为一种具有优异成像特性的新型成像技术，荧光成像能够对生物组织器官的结构和功能进行实时成像，即通过设计高灵敏度、高选择性和特异性的荧光探针，实现对恶性肿瘤的精准检测；其灵敏度主要取决于探针的荧光基团，选择性和特异性则取决于探针是否采取有效的靶向策略。研究显示，发射波长在近红外窗口内的近红外荧光团，尤其在近红外第二窗口内的荧光团，其光学性质优异，可有效提升恶性肿瘤荧光成像的灵敏度；同时，基于恶性肿瘤独特的结构和代谢特性，各种靶向策略也已被开发出来用于设计“常亮”型荧光探针和“激活”型荧光探针，以显著提高恶性肿瘤荧光成像的选择性和特异性。基于此，该文对新近开发的近红外荧光团以及荧光探针靶向恶性肿瘤的策略进行综述。

关键词： 荧光成像 ; 恶性肿瘤 ; 近红外荧光团 ; “常亮”型荧光探针 ; “激活”型荧光探针

Abstract

Malignant tumors are common diseases that threaten human health. Early diagnosis and complete resection can significantly improve the prognosis of patients with malignant tumors. At present, the imaging techniques used clinically for malignant tumor detection have problems such as poor sensitivity and temporal-spatial resolution, long scanning time, etc., which cannot achieve early diagnosis and meet the requirements of surgical navigation. As a new imaging technology with excellent imaging characteristics, fluorescence imaging can perform real-time imaging of the structure and function of biological tissues and organs. It can realize the accurate detection of malignant tumors by designing fluorescent probes with high sensitivity, high selectivity and specificity. The sensitivity of fluorescence imaging mainly depends on the fluorophore of the probe, and the selectivity and specificity mainly depend on whether the probe adopts an effective targeting strategy. Studies have shown that near infrared fluorophores with emission wavelengths in the near infrared window, especially those in the near infrared Ⅱ window, have excellent optical properties, which can effectively improve the sensitivity of fluorescence imaging of malignant tumors; at the same time, based on the unique structure and metabolic features of malignant tumors, various targeting strategies have been developed to design "always-on" fluorescent probes and "turn-on" fluorescent probes, which significantly improved the selectivity and specificity of fluorescent imaging of malignant tumors. In this paper, the newly developed near infrared fluorophores and the strategies of fluorescent probes targeting malignant tumors are reviewed.

Keywords： fluorescence imaging ; malignant tumor ; near infrared fluorophore ; "always on" fluorescent probe ; "turn on" fluorescent probe

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本文引用格式

王文博, 张方蓉, 石亭旺, 陈云丰. 恶性肿瘤荧光成像的研究进展. 上海交通大学学报(医学版)[J], 2023, 43(4): 474-479 doi:10.3969/j.issn.1674-8115.2023.04.010

WANG Wenbo, ZHANG Fangrong, SHI Tingwang, CHEN Yunfeng. Advances in fluorescence imaging of malignant tumors. Journal of Shanghai Jiao Tong University (Medical Science)[J], 2023, 43(4): 474-479 doi:10.3969/j.issn.1674-8115.2023.04.010

恶性肿瘤严重威胁着人类的生命健康，据统计2020年全球共有1 930万例癌症新发病例和近1 000万例癌症死亡病例^［1］。随着人口老龄化程度的加深和人们生活方式的改变，恶性肿瘤带给人类的挑战愈发严峻。而实现对恶性肿瘤的早期诊断是及早干预、提高该类患者生存率和生活质量的关键。研究^［2］显示，手术切除是恶性肿瘤治疗的基石，高分辨率的成像系统可辅助外科医师准确、完整地移除肿瘤病灶，以提高治愈率、降低复发风险。目前，临床上常用的影像学技术主要有超声成像、X射线计算机断层扫描（X ray-computed tomography，X-CT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和正电子发射断层成像（positron emission tomography，PET）等，它们能够以非侵入性方式获得生物组织的结构或功能图像，在恶性肿瘤的诊断中发挥重要作用；但由于上述成像技术的灵敏度和时空分辨率较差，难以实现对早期肿瘤（特别是微小病灶）的高效检测，同时其成像扫描的时间较长，亦不能很好地满足手术导航要求。作为一种快速发展的分子影像学技术，荧光成像（fluorescence imaging，FLI）具有良好的成像特性（如高灵敏度、高时空分辨率、低检测限制、快反馈）^［3］，能够对生物组织器官的结构和功能进行实时成像，动态监测恶性肿瘤的病理生理微环境变化^［3-4］，从而有望在恶性肿瘤的早期诊断及手术引导中发挥作用。

荧光探针是FLI的核心和基础，通常由荧光基团（fluorophore）、连接体（spacer）和识别基团（receptor）组成^［5］（图1）；其中，荧光基团决定了探针的灵敏度，识别基团决定了探针的选择性和特异性。依据发射波长，荧光基团被分为2类，即可见光波段（400~760 nm）荧光团和近红外波段（760~1 700 nm）荧光团。早期的探针主要使用可见光波段荧光团，成像深度仅为1~2 mm，且信噪比（signal to interference plus noise ratio，SINR）极低，用于恶性肿瘤FLI的灵敏度较差。随着近红外荧光成像技术的发展，研究者们开发了一系列近红外荧光团，有效地提高了恶性肿瘤FLI的灵敏度；同时，通过设计和修饰识别基团，赋予探针靶向恶性肿瘤的能力，显著地提高了恶性肿瘤FLI的选择性和特异性。本文主要就近红外荧光团、荧光探针靶向恶性肿瘤的策略及其应用进行介绍。

图 1

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图 1 荧光探针的组成示意图

Note： The fluorescent probe typically consists of a fluorophore, a spacer and a receptor.

Fig 1 Schematic diagram of fluorescent probe composition

1 近红外荧光团

FLI是一种新型的成像方法。当荧光团受到外界光照激发时，其可辐射出特定波长的荧光，该荧光经生物组织吸收和散射后被光学探测器捕获，转换为荧光信号，最后经电脑处理产生荧光图像。早期FLI使用的是发射波长在可见光波段的荧光团，生物组织对该波段的荧光可产生显著的吸收和散射效应^［6］，使得成像的背景信号高、穿透性差，同时该波段的荧光波长较短、能量较高，易导致生物组织的光毒性损伤。相比之下，近红外波段的荧光在生物组织中的吸收和散射水平较低，组织穿透性强，自体荧光干扰较弱，在恶性肿瘤的检测中具有明显优势。经过大量的研究，有学者发现了近红外第一窗口（near infrared Ⅰ，NIR-Ⅰ，即760~900 nm）和第二窗口（NIR-Ⅱ，即1 000~1 700 nm）这2个近红外成像波段，并合成了一系列发射波长在NIR-Ⅰ和NIR-Ⅱ的荧光团，有效地解决了用可见光波段荧光团成像的问题^［7］。下面分别就NIR-Ⅰ和NIR-Ⅱ荧光团及其应用进行讨论。

1.1 NIR-Ⅰ荧光团

NIR-Ⅰ是首先发现的近红外成像波段。比之于可见光，NIR-Ⅰ荧光被生物组织吸收和散射的水平均较低，组织自发荧光也较弱。NIR-Ⅰ荧光团主要有花菁类、酞菁类、卟啉衍生物和BODIPY（boron dipyrromethane）类似物等。当前，基于NIR-Ⅰ荧光团构建的荧光探针已在恶性肿瘤FLI领域取得了较广泛的应用^［8］。研究^［9］显示，吲哚菁绿（indocyanine green fluorescence，ICG）是一种典型的花菁类近红外荧光团，也是目前唯一被批准用于临床的近红外荧光团。HE等^［10］对结直肠癌肝转移患者开展的肝脏切除术发现，与传统肝切除术相比，ICG荧光图像引导切除术能够显著提升术者发现的肝内结直肠癌转移灶的数量，缩短患者的术后住院时间，大幅降低其1年内的复发率。

1.2 NIR-Ⅱ荧光团

NIR-Ⅱ是最新发现的近红外成像波段。相比于NIR-Ⅰ，NIR-Ⅱ荧光在生物组织中的吸收和散射作用可忽略不计，组织自体荧光水平较低，这使得NIR-Ⅱ荧光成像具有更深的成像深度，更高的SINR和分辨率，对恶性肿瘤的应用具有更显著的优势^［11］。

NIR-Ⅱ荧光团根据化学结构分为无机［单壁碳纳米管（single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）、稀土纳米颗粒（rare-earth doped nanoparticles，RENPs）、量子点（quantum dots，QDs）］和有机［小分子荧光探针（small molecular dyes，SMDs）、共轭聚合物（conjugated polymers，CPs）、聚集诱导发光材料（aggregation-induced emission fluorogens，AIEgens）］两大类。通常，无机荧光团的表面积较大，光学特性优越，发射波长灵活可调。如LI等^［12］设计并合成了用于术中导航的RENPs@Lips，在NIR-Ⅱ荧光图像引导下，术者可准确识别原位肿瘤血管并实施栓塞。但该类荧光团的生物相容性较低，存在引起生物毒性的风险，这也限制了其临床转化。相比之下，有机荧光团具有更完整的分子结构和更灵活的衍生性能，物理、化学特征可调节，生物相容性较好且毒性低，临床转化的价值更高。比如SMDs的典型代表：ZHOU等^［13］将CH1055与叶酸连接，构建成CH1055-F3荧光探针；该团队发现该探针可主动靶向4T1乳腺癌细胞，并实现了乳腺癌NIR-Ⅱ成像引导下的完整切除。然而，有机荧光团的光稳定性较差，短时间的光照辐射就能使其发生明显的光漂白而失效，后续可考虑优化有机荧光团的摩尔吸收系数、电子跃迁、表面化学性质等以实现对其发光性能的改进。

2 荧光探针靶向恶性肿瘤的策略

相对于正常组织，恶性肿瘤具有独特的结构和代谢特征，这使得设计靶向恶性肿瘤的荧光探针、提高恶性肿瘤FLI的选择性和特异性成为了可能。依据发光特点，荧光探针被分为2类：①“常亮”型荧光探针，即无论是否到达靶点，该探针的荧光强度和波长均保持不变。②“激活”型荧光探针，即该探针仅在与靶点反应后产生荧光。下面分别就该2类探针的靶向策略进行讨论。

2.1 “常亮”型荧光探针的靶向策略

为了赋予“常亮”型荧光探针靶向恶性肿瘤的能力，学者们做了大量的探索并最终总结出如下3种策略：①被动靶向策略。基于实体瘤的“高渗透长滞留效应”（enhanced permeability and retention effect，EPR）^［14］，通过改变荧光探针的大小，使探针能被动停留在肿瘤部位。②主动靶向策略。基于抗原-抗体、受体-配体之间的相互作用，将肿瘤特异性抗体与荧光团偶联构建荧光探针，使探针主动靶向至肿瘤部位。③细胞膜仿生靶向策略。基于细胞膜的生物学特性，利用机体内源性细胞膜对荧光探针表面进行包覆修饰，赋予其肿瘤靶向性^［15］。

2.1.1 被动靶向策略

实体瘤的EPR即为肿瘤组织在快速生长的过程中，为摄取营养物质会产生较多疏松的毛细血管，使得直径在100~800 nm的大分子物质更易透过，导致该类物质集中于肿瘤组织；同时，肿瘤组织中缺少淋巴管，使得淋巴引流不足，透过的物质易滞留于该组织。基于EPR，研究者们设计了被动靶向恶性肿瘤的大分子荧光探针。ON等^［16］将ICG荧光团与壳聚糖纳米颗粒（chitosan nanoparticles，CNPs）偶联，制备了直径为261.8 nm的荧光探针ICG-CNPs，并将ICG-CNPs用于兔肺内VX2肿瘤的图像引导手术；结果显示，在ICG-CNPs被静脉注射后的96 h，其发出的实时荧光信号便可以很清楚地将肿瘤的边缘与正常肺组织区分开，从而辅助医师完整切除肿瘤。

2.1.2 主动靶向策略

相比于被动靶向策略，基于主动靶向策略设计的荧光探针具有更强的肿瘤靶向能力^［17］。研究者们将单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）、抗体衍生物、核酸适配体等与荧光团偶联，制备出了一系列能够主动靶向恶性肿瘤的荧光探针。

mAb对靶向抗原具有高度亲和力和特异性，已被广泛应用到恶性肿瘤FLI领域。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗体bevacizumab^［18］、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）抗体cetuximab^［19］、碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydrase Ⅸ，CA Ⅸ）抗体girentuximab^［20］等与相应的荧光团偶联后构建的荧光探针被分别用于直肠癌、头颈癌、肾癌等的体内外成像。由于mAb的生物安全性已得到验证，且成像时使用的剂量较治疗时更低，这使得利用mAb构建的主动靶向型荧光探针在生物安全性上更易通过监管机构审查，方便开展临床试验；但该类探针存在免疫原性较强可能会引起免疫系统反应、体积较大可能会导致渗透肿瘤的能力差、成像时背景信号持续时间长等问题，也限制了其在临床上的应用和推广。

为了解决mAb荧光探针成像时遇到的问题，一系列免疫原性更低、体积更小的抗体衍生物被逐步开发并用于肿瘤靶向成像，如微型抗体、双特异抗体、抗原结合片段、单链可变区片段、纳米抗体、亲和体、短肽等^［21-23］。精甘天冬氨酸环肽（cyclo arginyl-glycyl-aspartic acid，cRGD）是一种由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成的短肽，可与整合素（如αvβ6）相结合；且在侵袭性上皮肿瘤（如结直肠癌）中，整合素αvβ6高表达。DE VALK等^［24］制备了靶向整合素的近红外荧光探针cRGD-ZW800-1，并在12例接受选择性结肠切除术的结肠癌患者中进行了Ⅱ期可行性研究；结果显示，术中的FLI可清晰地显示肿瘤边界，肿瘤背景比（tumor to background ratio，TBR）达到1.6。

核酸适配体是一段从核酸分子文库中筛选得到的寡核苷酸序列（DNA或RNA），对目标抗原具有高度亲和力，被称为“人工抗体”。相对于普通抗体，核酸适配体价格低廉、体积小、免疫原性低、易进行化学修饰，用于构建靶向恶性肿瘤的荧光探针具有显著优势^［25］。WANG等^［26］通过体外筛选技术发现了靶向原发性浆液卵巢癌（primary serous ovarian cancer，pSOC）细胞的核酸适配体mApoc46，其对pSOC细胞具有极高的特异性；随后，该团队将荧光团Cy5与mApoc46偶联，构建成荧光探针Cy5-mApoc46用于荷瘤小鼠的体内成像；结果显示，在注射荧光探针后的5 min，荧光信号便在小鼠肿瘤处逐渐积聚，注射后10 min该处荧光信号的强度达到最高，可清晰地显示肿瘤形态。

2.1.3 细胞膜仿生靶向策略

细胞膜仿生靶向是近年来新兴的靶向方式，即利用机体内生物膜（如红细胞膜、血小板膜、巨噬细胞膜、干细胞膜等）对荧光探针进行仿生修饰，赋予荧光探针靶向恶性肿瘤的能力；同时，自体生物膜对探针的包覆修饰可有效降低探针的免疫原性，提高其生物相容性^［27］。RAO等^［28］将巨噬细胞膜（macrophage membrane，MM）涂覆在合成的上转换纳米颗粒（upconversion nanoparticles，UCNPs），以制备MM仿生的荧光探针MM-UCNPs，并在荷瘤小鼠模型中评估该探针的体内成像能力；结果显示，在注射MM-UCNPs后的48 h，小鼠肿瘤部位显示出了高强度的荧光信号（显著高于使用UCNPs进行成像的对照组小鼠），继而表明MM包覆赋予了荧光探针强大的肿瘤靶向能力。

2.2 “激活”型荧光探针的靶向策略

基于“常亮”型荧光探针在与目标组织相互作用时始终会发出荧光信号，学者们设计并开发出了“激活”型荧光探针，用以降低FLI的背景信号，提高成像的特异性和SINR^［29］。即在正常组织中，“激活”型荧光探针通常不发射荧光或仅发射微弱的荧光；而当到达肿瘤部位时，肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中的异常生物标志物可刺激该探针，使其通过分子结构变化实现荧光信号从“关闭”到“开启”。因此，该“激活”型荧光探针以肿瘤异常代谢特征（如低pH、缺氧和高水平表达的酶等）为靶点，实现了仅在肿瘤部位“点亮”荧光进行成像的目的。如下对该荧光探针靶向低pH、缺氧和高水平表达的酶的策略进行介绍。

2.2.1 靶向低pH策略

研究^［30］显示，糖酵解是肿瘤细胞主要的能量来源。为满足肿瘤细胞快速增殖的需求，该细胞的糖酵解过程较正常细胞旺盛，导致大量的乳酸堆积在TME中；此外，许多羧酸盐转运蛋白在肿瘤细胞表面过表达，导致大量的H⁺从细胞质中输出。这些因素致使多数恶性肿瘤的环境pH在6.5~6.8，远低于正常组织。理想的pH激活型荧光探针应在正常组织、周围的血液或间质液中不发荧光，而在肿瘤部位酸性环境中产生高强度荧光。ZHAO等^［31］设计了一种可以被肿瘤酸性pH激活的聚合物胶束荧光纳米探针PINS（pH-activatable indocyanine green-encoded nanosensor），当pH>6.9时，探针在缓冲液中自组装形成稳定的胶束结构，荧光猝灭；当pH<6.9时，胶束解离为单体，荧光恢复。目前，PINS在多种肿瘤（如头颈癌、胰腺癌、乳腺癌、腹膜转移瘤等）的动物模型中被证明具有广泛的肿瘤检测特异性。且在PINS（商品名为ONM-100）的首次临床试验中，其检测肿瘤的平均SINR为3.7，患者均表现出良好的耐受性^［32］。

2.2.2 靶向缺氧策略

TME缺氧主要是由于恶性肿瘤异常血管化导致的低氧供应与肿瘤细胞的高氧消耗之间的不均衡所致，而快速增殖的肿瘤细胞又会加速氧气的消耗，从而进一步耗竭肿瘤组织中的氧气。针对恶性肿瘤这一代谢特点，DOU等^［33］设计并合成了新型荧光探针Q-NO2，其可与肿瘤缺氧环境中的硝基还原酶反应转变为Q-OH，从而恢复其荧光信号；同时，研究者利用该探针对乳腺癌小鼠模型中乳腺癌的连续转移过程进行了监测，并取得了较好的效果。

2.2.3 靶向高水平表达的酶策略

多数肿瘤组织可高表达基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和组织蛋白酶，且该2种酶与恶性肿瘤的侵袭、转移密切相关，因此酶激活型荧光探针大都是基于被该2种酶激活而设计的。AVB-620是一种可被MMPs激活的荧光探针^［34］，主要用于乳腺癌手术中检测和呈现肿瘤阳性切缘，目前正在进行2期临床试验（NCT03113825），以评估其在实际手术中的效用。LUM015是一种可被组织蛋白酶特异性激活的荧光探针，SMITH等^［35］在一项临床研究中评估了LUM015在保乳术中实时检测残留乳腺癌的可行性，结果显示，对于所有成像的乳腺肿瘤切除腔壁表面，FLI检测肿瘤的真阳性率为84%、真阴性率为73%；对于8例行标准切除术后切缘阳性的患者，其残留肿瘤检测的真阳性率为100%，其中2例患者因LUM015荧光信号位于已被切除的病灶组织中而避免了二次手术。该研究表明，LUM015可以快速发现乳腺癌患者的肿瘤切除腔内的残留肿瘤，并减少患者的切缘阳性率。

3 总结与展望

近红外荧光成像技术的发展，尤其是近红外窗口内一系列具有优异光学性质的荧光团的开发，显著提高了恶性肿瘤FLI的SINR和穿透深度，使该成像不仅“看得清”且“看得深”；同时，荧光探针靶向恶性肿瘤策略的发展和应用，也大幅提升了恶性肿瘤FLI的选择性和特异性，使该成像可以“看得准”。因此，这些技术的进步使FLI能够逐渐满足临床的要求，从而也推动了其在恶性肿瘤检测领域的应用。

然而当前，FLI的临床应用仍十分有限。可能的原因如下：①由NIR-Ⅱ荧光团的生物安全性问题所致^［36］。目前开发的NIR-Ⅱ荧光团虽在光学性质上有较大进步，但存在重金属泄露、长期留存于体内等生物安全风险，严重影响了NIR-Ⅱ成像技术的临床转化。②适合普及的NIR-Ⅱ成像系统较为缺乏。现有的NIR-Ⅱ成像系统价格昂贵，仅少数大型医院拥有财力进行采购。③FLI技术的临床应用标准尚未建立。如荧光探针如何注射、注射的剂量、注射后多长时间的成像效果较好等。未来，研究者们可通过优化NIR-Ⅱ荧光团的化学性质，来开发现代化集合的廉价成像系统；同时，建立可靠的FLI技术的应用指南，以推动该技术在临床肿瘤外科中的应用。此外，外科医师还可借助清晰的荧光图像，在术中更准确地识别肿瘤边界，彻底切除残余肿瘤病灶，以最大限度地延长患者的生存期、提高患者的生存质量。

作者贡献声明

王文博、张方蓉、石亭旺参与了论文的起草和写作，陈云丰参与了论文的修改和审定。所有作者均阅读并同意了最终稿件的提交。

AUTHOR's CONTRIBUTIONS

The manuscript was drafted and written by WANG Wenbo, ZHANG Fangrong and SHI Tingwang. The manuscript was revised and finalized by CHEN Yunfeng. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

利益冲突声明

所有作者声明不存在利益冲突。

COMPETING INTERESTS

All authors disclose no relevant conflict of interests.

参考文献

原文顺序

文献年度倒序

文中引用次数倒序

被引期刊影响因子

[1]

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