支气管哮喘（哮喘）是儿童时期最常见的慢性气道疾病，具有明显的异质性和复杂的病理生理表现^［1］。其中，重症哮喘表现为控制水平差，严重影响患儿的生活质量。2020年版《儿童支气管哮喘规范化诊治建议》明确了儿童重症哮喘的诊治流程：对于已接受含中剂量吸入性糖皮质激素（inhaled corticosteroid，ICS）的联合用药方案治疗但哮喘仍未达到良好控制的患儿，要全面分析并排除可能的相关影响因素，再结合儿童的症状控制水平和对在用药物治疗效应的评估，最终确定是否为对常用抗哮喘治疗药物不敏感的重症哮喘^［2］。2014年美国呼吸协会和欧洲呼吸学会估计重症哮喘在哮喘人群中占比5%~10%^［3］。目前国内尚无明确的儿童重症哮喘的流行病学资料，但不可否认的是重症哮喘病情持续、反复发作，严重影响儿童的生活和学习，对家庭造成了极大的精神压力和经济负担^［4-5］。

肠道菌群是指定植在人和动物消化道内的一个非常复杂的微生物群落。健康成人肠道菌群的主要种类包括拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、变形菌门和疣微菌门^［6］。研究^［7］表明肠道菌群与儿童的健康及疾病状态相关，肠道菌群失调与新生儿小肠结肠炎、晚发型败血症、湿疹、哮喘、食物过敏、肥胖、糖尿病、自身免疫性疾病、神经精神疾病等的发生和发展密切相关。已有多项研究^［8-13］表明发生在生命早期的肠道菌群失调是导致哮喘发生的关键影响因素，但很少有研究关注肠道菌群与儿童哮喘严重程度的相关性。

基于此，本研究采用观察性病例对照设计，分析不同严重程度支气管哮喘患儿肠道菌群的特征及差异，并构建重症哮喘肠道菌群预测模型，以探讨肠道菌群分析对儿童哮喘严重程度评估的作用，为进一步完善哮喘的多维评估方式、实现哮喘的最佳评估与诊疗提供依据。

选取2020年9月1日—2022年8月31日期间在复旦大学附属儿科医院呼吸科门诊就诊且主要诊断为哮喘（ICD-10诊断编码J45-J46）的5~14岁儿童作为研究对象。最终纳入重症哮喘儿童50例，性别和年龄匹配的轻中度哮喘儿童54例，同时期的性别、年龄匹配的健康体检儿童39例。留取新鲜粪便标本，提取粪便DNA进行肠道菌群16sRNA高通量测序。

患儿入组标准：①年龄5~14岁。②符合2016年版《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》^［1］的哮喘及咳嗽变异性哮喘诊断标准，包括<6岁喘息儿童其临床特点高度提示哮喘者。其中，重症哮喘的诊断符合2020年版《儿童支气管哮喘的规范化诊治建议》^［2］，入组时不符合重症哮喘诊断的其他哮喘儿童纳入轻中度哮喘组。

排除标准：①过去1个月内有严重腹泻或严重便秘者，或合并胃肠道疾病者。②过去1个月内有呼吸系统感染者。③过去1个月内使用过抗生素治疗者。④长期或过去1个月内服用糖皮质激素、免疫抑制剂者。⑤过去2周内使用益生菌等微生态制剂者。⑥合并其他重大疾病如糖尿病等代谢性疾病、肺囊性纤维化、心力衰竭、急性或慢性感染者。

退出标准：①主动要求退出者。②研究者认为不适合继续研究的其他情况。

记录患者个人信息，包括年龄、性别、身高、体质量指数（body mass index，BMI）。

入组后，所有儿童需留取新鲜晨便，用采便勺在大便中部采集4~5勺后装入大便管中，立即放入-80 ℃冰箱储存。提取粪便DNA，并对细菌16S rRNA的V3~V4区域进行PCR扩增，引物序列为5'-TACGGRAGGCAGCAG-3'（343F）和5'-AGGGTATCTAATCCT-3'（798R），而后于上海欧易云平台完成高通量测序。

（1）原始数据质控和可操作分类单元聚类

高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别分析转化为原始测序序列（raw data），对其进行去杂、拼接、进一步的质控和去除嵌合体，得到有效序列（valid tags）。使用Vsearch （version 2.4.2）软件，对质控得到的有效序列按照97%的相似度进行可操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）分类，并选取每个OTU中丰度最大的序列作为该OTU的代表序列。采用RDP classifier Naive Bayesian分类算法对代表序列与Silva（V138）数据库进行比对注释，得到OTU的注释信息。

（2）肠道菌群多样性分析

使用R 4.0.4软件分析样本中肠道菌群多样性情况，包括α多样性和β多样性。α多样性主要衡量样本内物种丰富度和分布均匀度。本研究中使用的度量指标为Chao1指数。β多样性主要评估不同分组样本之间的多样性差异，通常将其与降维方法结合使用。本研究中使用的是主坐标分析法（principal co-ordinates analysis，PCoA），即先基于binary-jaccard算法计算出样本间相似距离，然后对样本间相似距离分别进行PCoA分析及相似性分析（analysis of similarities，ANOSIM）。

（3）群落结构与差异菌属分析

对样本在门、纲、目、科、属等各个不同的分类层级进行注释以及汇总，并将门、属分类水平下丰度排序前10位的物种在各组中的分布绘制成柱状图。使用线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）揭示3组儿童肠道菌群在属水平上的物种差异。

（4）受试者操作特征曲线绘制

根据特征菌群丰度数据，利用10折交叉验证，共分10次随机划分训练集及验证集，先对训练集构建随机森林模型，再用此模型预测验证集，构建受试者操作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC曲线），最后对10次模型结果进行平均处理得到最终ROC曲线。

使用Vsearch、R语言等软件对测序数据进行处理分析。应用SPSS 26.0软件包进行统计数据分析。定量资料采用x±s表示。对服从正态分布、满足方差齐性的数据，3组间比较使用单因素方差分析，两两比较采用least significant difference（LSD）法。对不符合正态分布的数据，采用非参数秩和检验，3组间比较使用Kruskal-Wallis秩和检验，2组间比较使用Wilcoxon秩和检验。定量资料使用率或构成比表示，组间比较使用χ²检验或Fisher确切概率法。P<0.05表示差异有统计学意义。

纳入哮喘患儿共104例，其中，54例为轻中度哮喘患儿，50例为重症哮喘患儿。纳入健康体检儿童39例。重症哮喘儿童、轻中度哮喘儿童、健康体检儿童在性别、年龄、BMI方面进行比较，3组间差异没有统计学意义（表1）。

共对143个样本进行测序，各样本的OTU个数分布在638~3 174之间。各样本丰度等级曲线（图1A）的长短高度不一，说明各样本的物种分布情况不同。如图1B所示，Shannon指数曲线随着抽取序列数的增加而趋于平缓，说明本研究中样本的测序数据量合理，足以反映样本的微生物信息。

在同一个测序深度下，计算得出不同样本的α多样性指数Chao1，并对3组儿童的Chao1指数差异进行分析（图2A），发现与健康对照组相比，轻中度哮喘组和重症哮喘组的Chao1指数下降，且差异具有统计学意义（P<0.05），重症哮喘组和轻中度哮喘组的Chao1指数差异无统计学意义（P>0.05）。对于不同样本β多样性的分析，使用基于binary-jaccard距离的PCoA分析，可将3组儿童明显区分。ANOSIM比较结果（图2B）显示，3组儿童的肠道菌群分布差异存在统计学意义（P=0.001）。

（1）群落结构比较

在门水平上，3组儿童肠道菌群相对丰度最高的4种均为拟杆菌门（Bacteroidota）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota），结果见图3A。在健康对照组、轻中度哮喘组、重症哮喘组中，这4种菌群相对丰度的总和分别占各组所有菌群的98.8%、98.9%、98.8%。此外，健康对照儿童与轻中度哮喘儿童肠道菌群相对丰度位于第5位的为脱硫杆菌门（Desulfobacterota），分别占2组所有菌群的0.055%、0.048%；而重症哮喘儿童肠道菌群相对丰度位于第5位的为螺旋菌门（Spirochaetota），占该组所有菌群的0.047%。

在属水平上，3组儿童的肠道菌群相对丰度最高的5种均为拟杆菌属（Bacteroides）、粪杆菌属（Faecalibacterium）、普雷沃菌属（Prevotella）、Muribaculaceae菌属、另枝菌属（Alistipes）；在健康对照组、轻中度哮喘组、重症哮喘组中，这5种菌群相对丰度的总和分别占各组所有菌群的69.1%、65.8%、63.6%（图3B）。

（2）差异物种分析

随后，本研究对入组儿童的肠道菌群丰度进行LEfSe差异分析。结果显示：在健康对照儿童、轻中度哮喘儿童、重症哮喘儿童组中，密螺旋体属（Treponema）的相对丰度依次增加（P<0.001）；与健康对照儿童组相比，轻中度哮喘组和重症哮喘组乳杆菌属（Lactobacillus）的相对丰度较高（P<0.05）。

在属水平上，重症哮喘儿童肠道菌群中普雷沃菌属（Prevotella）、乳杆菌属（Lactobacillus）、真杆菌属（Eubacterium_eligens_group）、密螺旋体属（Treponema）、纺锤链杆菌属（Fusicatenibacter）的相对丰度较高；轻中度哮喘组巴恩斯菌属（Barnesiella）、霍尔德曼菌属（Holdemanella）、罗姆布茨菌属（Romboutsia）、苏黎世杆菌属（Turicibacter）的相对丰度较高（均P<0.05）；健康对照组未培养细菌（uncultured菌属）、Muribaculaceae菌属的相对丰度较高（图4A）。

同时，我们对3组儿童肠道菌群进行两两比较，发现：与健康对照组相比，轻中度哮喘儿童肠道菌群中F082菌属、毛螺菌科ND3007_group菌属（Lachnospiraceae_ND3007_group）、密螺旋体属（Treponema）、罗姆布茨菌属（Romboutsia）、苏黎世杆菌属（Turicibacter）、乳杆菌属（Lactobacillus）、霍尔德曼菌属（Holdemanella）、埃希杆菌-志贺菌属（Escherichia-Shigella）的相对丰度较高，而普雷沃菌属（Prevotella）、活泼瘤胃球菌（Ruminococcus_gnavus_group）、拟普雷沃菌（Alloprevotella）、Muribaculum菌属、真杆菌属（Eubacterium_eligens_group）的相对丰度较低（图4B）；与健康对照组相比，重症哮喘儿童肠道菌群中普雷沃菌属（Prevotella）、Clostridia-UCG-014菌属、乳杆菌属（Lactobacillus）、真杆菌属（Eubacterium_eligens_group）、毛螺菌属（Lachnospira）、密螺旋体属（Treponema）、纺锤链杆菌属（Fusicatenibacter）的相对丰度较高，而Oleibacter菌属、CAG-352菌属、uncultured菌属、Muribaculaceae菌属的相对丰度较低（图4C）；与轻中度哮喘组相比，重症哮喘儿童肠道菌群真杆菌属（Eubacterium_eligens_group）、密螺旋体属（Treponema）的相对丰度较高，而Muribaculaceae菌属、巴恩斯菌属（Barnesiella）、霍尔德曼菌属（Holdemanella）、Cellulosilyticum菌属的相对丰度较低（图4D）。

根据上述差异物种在各样本间的相对丰度，基于随机森林模型，利用10折交叉验证构建相应的预测重症哮喘模型的ROC曲线，并比较上述差异物种ROC曲线及曲线下面积（area under curve，AUC），得到AUC最大的5种菌属为巴恩斯菌属（Barnesiella）、霍尔德曼菌属（Holdemanella）、真杆菌属（Eubacterium_eligens_group）、苏黎世杆菌属（Turicibacter）、密螺旋体属（Treponema）。结果显示：巴恩斯菌属（AUC 0.713， 95%CI 0.604~0.815）预测重症哮喘的敏感度及特异度均高于其他菌属（图5）。

目前研究^［12］表明肠道菌群失调与哮喘等过敏性疾病的发生密切相关。本研究选取了重症哮喘、轻中度哮喘以及健康对照儿童进行肠道菌群分析，发现不同严重程度哮喘儿童的肠道菌群的丰度和分布均匀度存在差异，并筛选出可预测重症哮喘的特征性肠道菌属。

既往研究显示肠道菌群的多样性降低与儿童哮喘发生相关。例如，ABRAHAMSSON等^［13］发现1月龄时肠道菌群多样性降低与学龄期发生哮喘的风险增加有关，并且患有湿疹、食物过敏等过敏性疾病的新生儿和儿童的肠道微生物群多样性也较低^［14-18］。本研究为进一步明确重症哮喘、轻中度哮喘以及健康对照儿童组间肠道菌群结构差异，对不同组别儿童的肠道菌群进行了α及β多样性分析。α多样性分析发现，3组儿童肠道菌群的Chao1指数差异有统计学意义，哮喘儿童的肠道菌群多样性较健康对照组明显降低；β多样性分析则提示，3组儿童肠道菌群的群落结构存在差异。本研究进一步对3组儿童肠道菌群的群落结构进行分析，发现在门水平上3组儿童肠道菌群相对丰度位于前4位的菌群种类一致，但健康对照儿童与轻中度哮喘儿童肠道菌群相对丰度位于第5位的为脱硫杆菌门，而重症哮喘儿童肠道菌群相对丰度位于第5位的为螺旋菌门（Spirochaetota）。这提示哮喘儿童肠道菌群的多样性与哮喘的严重程度存在某种相关性。

近年来多项研究揭示了特异性肠道菌群在儿童哮喘发病过程中发挥重要作用。例如，哮喘高风险的婴儿肠道中韦荣球菌属（Veillonella）、粪杆菌属（Faecalibacterium）、毛螺菌属（Lachnospira）、罗斯菌属（Rothia）的相对丰度显著降低^［19］；动物体内实验也表明，这4种菌在肠道定植可以显著减轻小鼠的气道炎症^［20］；同时，CHIU等^［21］将哮喘患儿与健康儿童的肠道菌群进行对比分析，发现哮喘患儿肠道菌群中粪杆菌属（Faecalibacterium）和罗氏菌属（Roseburia）的相对丰度明显降低，而梭状芽孢杆菌属（Clostridium）的相对丰度明显提高；而一项针对成年哮喘患者的病例对照研究^［22］发现，哮喘患者组粪便中乳杆菌（Lactobacillus）和大肠埃希菌（Escherichia coli）丰度明显高于健康对照组。我们的研究发现密螺旋体属（Treponema）在健康对照儿童、轻中度哮喘儿童、重症哮喘儿童组的相对丰度依次增加；轻中度哮喘组和重症哮喘组乳杆菌属（Lactobacillus）的相对丰度较健康对照组儿童高。与轻中度哮喘儿童相比，重症哮喘儿童肠道菌群普雷沃菌属（Prevotella）、Clostridia-UCG-014菌属、乳杆菌属（Lactobacillus）、真杆菌属（Eubacterium_eligens_group）、毛螺菌属（Lachnospira）、密螺旋体属（Treponema）、纺锤链杆菌属（Fusicatenibacter）的相对丰度较高，而轻中度哮喘组Muribaculaceae菌属、巴恩斯菌属（Barnesiella）、霍尔德曼菌属（Holdemanella）、Cellulosilyticum菌属的相对丰度较高。值得注意的是，与文献报道的研究结论不同，本研究未发现韦荣球菌、粪肠球菌、罗氏菌、粪杆菌属在3组儿童肠道菌群中分布的差异。我们猜测这一现象有可能与研究地域、样本量的选择、研究对象年龄、哮喘发作情况等因素相关。

此外，本研究绘制差异菌属预测重症哮喘的ROC曲线，发现巴恩斯菌属预测重症哮喘的敏感度及特异度均高于其他菌属。已往的研究^［23-26］发现巴恩斯菌属与人体胆汁酸代谢、血糖代谢等密切相关，其中有研究^［23］指出巴恩斯菌影响肥胖人群的益生菌干预效果，而肥胖正是影响重症哮喘的重要危险因素^［27-29］。考虑到重症哮喘与宿主、环境等诸多因素相关，巴恩斯菌对代谢的影响可能在一定程度上影响了重症哮喘的发生和发展，后续将结合多组学分析探究其作用机制。

综上所述，本研究结合16S rRNA测序探索了不同严重程度哮喘儿童肠道菌群多样性的差异，为未来探索重症哮喘儿童的肠道微生物多态性提供重要的线索。鉴于肠道菌群种类较多，且各菌属对宿主机体的作用机制各异，若能筛选出特异的菌群标志物，将为儿童重症哮喘的发病机制研究，以及哮喘严重程度评估及最佳的诊疗方案的制定提供重要的理论基础，或可为儿童重症哮喘提供临床诊治新靶标。后期可通过扩大样本量、完善多中心研究、结合多组学分析和体内动物实验等进一步明确哮喘患儿特异菌属及其作用机制。