肥胖的发病率在全球范围内都在增加。根据中国标准，2015—2019年我国成年人（≥18岁）超重率为34.3%，肥胖率为16.4%^［1］。肥胖威胁着人类的健康，增加了代谢相关疾病、心血管疾病、肿瘤的发病率以及死亡率^［2］。肥胖是由于热量摄入和消耗之间的不平衡造成的，由环境和遗传因素的共同作用导致^［3-4］。单基因肥胖具有明确的遗传性，发病年龄早、进展快、肥胖程度高且伴随多种并发症，因此致病基因的鉴定对单基因肥胖的发病机制以及精准治疗具有重要意义。

目前研究^［5］证实，大部分单基因肥胖致病基因编码的蛋白质都是瘦素-促黑素细胞激素（leptin-melanocyte stimulating hormone，LEP-MSH）能量平衡调节通路的组成部分，可通过改变食欲影响食物摄取和能量分配，从而导致肥胖。此通路由脂肪分泌的LEP所介导，LEP穿过血脑屏障，与下丘脑弓状核中的瘦素受体（leptin receptor，LEPR）结合。SH2B衔接蛋白1（SH2B adaptor protein 1，SH2B1）增强LEP信号转导，后者诱导阿黑皮素原（proopiomelanocortin，POMC）的表达；激素原转化酶1（prohormone convertase 1，PC1）和PC2将POMC切割成促黑素细胞激素α/β/γ（α/β/γ-melanocyte stimulating hormone，α/β/γ-MSH）和促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH），α-MSH和β-MSH分别与黑素皮质素3受体（melanocortin-3 receptor，MC3R）和黑素皮质素4受体（melanocortin-4 receptor，MC4R）结合，并诱导其活性。并且LEP也通过抑制神经肽Y（neuropeptide Y，NPY）/刺鼠相关肽（agouti-related peptide，AGRP）的表达控制摄食行为^［6］。

由于全外显子测序（whole-exome sequencing，WES）对常见和罕见变异均具有高灵敏度的优点，已广泛应用于孟德尔遗传病分子病因的解析。WES在恶性血液病^［7］、遗传性肾病^［8］以及肿瘤^［9］等疾病的基因突变检测中也有所应用，并在单基因肥胖致病基因的鉴定方面发挥巨大的作用。在肥胖的评估中，WES已经在早发性肥胖患者的LEPR基因^［10］、腺苷酸环化酶3（adenylate cyclase 3，ADCY3）基因^［11］和BBIP1（BBSome interacting protein 1）基因^［12］中鉴定出多种罕见变异。但之前的大多数研究仅报道了WES所检测单个肥胖患者的基因突变位点，对于大规模中国肥胖人群的单基因突变检测研究十分有限。

本研究采用WES，对减重手术的肥胖患者ADCY3、AGRP、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）等16个基因进行突变检测，并筛选罕见致病性变异，以期为肥胖的发病机制和个体化治疗提供新的线索。

招募2011年1月—2019年7月在上海交通大学医学院附属第六人民医院接受袖状胃切除术的119名肥胖患者，有2名患者为同父同母的姐妹，其余无亲属关系；男35人、女84人，男女比例为1∶2.4；年龄17~65岁，平均年龄（40.38±13.40）岁；体质量指数（body mass index，BMI）≥34 kg/m²，平均BMI为（39.34±4.70）kg/m²。

抽取研究对象的外周血，提取全基因组DNA。用NimbleGen SeqCap EZ Exome v3.0捕获试剂（捕获目标=64 Mb，Roche）和TruSeq DNA建库试剂盒（Illumina）构建DNA文库。在Illumina Novaseq 6000平台上采用配对末端150 bp读数对样品进行高通量测序。使用BWA软件将测序数据与人类参考基因组（hg19/GRCh37）进行比对，并用GATK3.7进行变异检测，最后利用ANNOVAR软件对变异位点进行注释。

我们主要关注与LEP-MSH通路相关的16个基因，详见表1。利用WES检测这些基因中的罕见变异。罕见变异的定义为在1000 Genomes（1000G）、Exome Aggregation Consortium（ExAC）和Genome Aggregation Database（gnomAD）数据库中总人群最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）小于0.02且东亚人群（East Asians，EAS）的MAF小于0.01的变异。

根据CADD（Combined Annotation Dependent Depletion）分值（≥20为损害）、DANN（Domain-Adversarial Training of Neural Networks）分值（≥0.98为损害）、MetaSVM（D为损害）、Polyphen2（Polymorphism Phenotyping v2）（D为损害）、SIFT（Sorting Intolerant From Tolerant）（D为损害）、M-CAP（Mendelian Clinically Applicable Pathogenicity）（D为损害）6种突变有害性预测软件来评估变异的损害程度。损害程度定义如下：所有方法都预测为良性则认为这个突变为良性（benign，B），只有1个方法预测为损害则认为这个突变损害弱（deleterious weak，DW），有2~4个方法预测为损害则认为这个突变为损害（deleterious，D），有5个方法预测为损害则认为这个突变为损害较强（deleterious strong，DS），所有方法均预测为损害则认为这个突变为损害非常强（deleterious very strong，DVS）。基因组进化速率分析（Genomic Evolutionary Rate Profiling，GERP）评分高于2.0的基因组位点被认为是保守的；分值越高，位点越保守，那么该位点上突变的有害可能性越高。基于以上所有结果以及患者的临床信息，根据美国医学遗传学和基因组学学院（America College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南对所有变异进行致病性判断。本研究仅对ACMG指南鉴定为“致病的（pathogenic）”“可能致病的（likely pathogenic）”和“意义不明的（variants of uncertain significance，VUS）”变异加以讨论，那些被鉴定为“良性的”或“可能良性的”变异将直接被剔除。

我们利用WES在24名患者中对LEP-MSH通路上16个关键基因检测到26个22种致病、可能致病或意义不明的基因突变，均为杂合突变，其中有12种新发变异。3名患者携带SH2B1基因上的相同变异位点，在LEPR基因和MCHR1基因上分别有2名患者携带相同变异位点。在6名患者中检测到了7个SH2B1基因突变（占总突变数的26.92%），其中1名患者携带2个突变。另外，还检测到了MCHR1基因突变4个（占15.38%），PHIP基因突变3个（占11.53%），ADCY3、LEPR基因突变各2个（各占7.69%），LEP、NTRK2、AGRP、KSR2、MC3R、MC4R、BDNF、PCSK1基因突变各1个（各占3.85%）。本次检测到的具体突变信息见表2，这些突变基因所对应的蛋白在LEP-MSH通路上的位置及此次检测到的致病性突变（根据ACMG指南）见图1。

本研究检测到的SH2B1基因突变有7个，其中患者6、患者17和患者23在SH2B1基因上有相同的突变位点。患者6，女性，58岁，BMI为38.27 kg/m²；患者17，女性，67岁，BMI为67.54 kg/m²；患者23，女性，31岁，BMI为41.41 kg/m²。在chr16：28878040位置发生碱基T>C杂合突变（c.T386C），导致编码的第129号氨基酸由甲硫氨酸变异为苏氨酸（p.M129T）。该突变位点在1000G、ExAC和gnomAD数据库中EAS的MAF为0.005 1。预测该突变对蛋白的损害性为DW，根据ACMG指南鉴定为意义不明的变异。

患者14，男性，63岁，BMI为38.75 kg/m²，检测到其SH2B1基因上的2个不同的变异位点。① 在chr16：28877614位置发生碱基C>T杂合突变（c.C199T），导致编码的第67号氨基酸由精氨酸变异为半胱氨酸（p.R67C）。在1000G、ExAC和gnomAD数据库的EAS中都未检索到该突变位点，此为EAS新发变异。预测该突变对蛋白的损害程度为DS，根据ACMG指南鉴定为致病的变异。② 在chr16：28878223位置发生碱基C>T杂合突变（c.C808T），导致编码的第270号氨基酸由精氨酸变异为色氨酸（p.R270W）。1000G、ExAC和gnomAD数据库中EAS的MAF为0.001 9，预测该突变对蛋白的损害性为DS，根据ACMG指南鉴定为致病的变异。

还有2个在1000G、ExAC和gnomAD数据库的EAS中都未检索到的新发变异。患者4，女性，39岁，BMI为34.6 kg/m²。在chr16：28878040位置发生碱基G>A杂合突变（c.G625A），导致编码的第209号氨基酸由缬氨酸变异为异亮氨酸（p.V209I）。预测该突变对蛋白的损害程度为B，根据ACMG指南鉴定为意义不明的变异。患者19，男性，21岁，BMI为34.94 kg/m²。在chr16：28877860位置检测到碱基C>T杂合突变（c.C445T），导致编码的第149号氨基酸由亮氨酸变异为苯丙氨酸（p.L149F）。预测该突变对蛋白的损害程度为D，根据ACMG指南鉴定为致病的变异。

此队列中检测到1个LEP基因变异，该变异位点在1000G、ExAC和gnomAD数据库的EAS中都未检索到，为EAS新发变异。患者8，女性，64岁，BMI为43.12 kg/m²。该突变损害程度预测为D，根据ACMG指南鉴定为可能致病的变异。

有2名患者携带LEPR基因突变，且两者突变位点一致。经病史采集发现2名患者来自同一个家系并且为同父同母的姐妹：患者9，女性，40岁，BMI为34.72 kg/m²；患者10，女性，46岁，BMI为36.73 kg/m²。2名患者均在chr1：66038032位置发生碱基T>C杂合突变（c.T394C），导致编码的第132号氨基酸由色氨酸变异为精氨酸（p.W132R）。在3个数据库的EAS中未检索到该突变位点，为EAS新发变异。预测该突变对蛋白的损害程度为DS，根据ACMG指南鉴定为致病的变异。因此，两者肥胖的原因很可能都是由该突变引起的。

检测到1个MC4R基因上的无义突变：患者22，女性，35岁，BMI为34.72 kg/m²；在chr18：58039062位置发生碱基G>A杂合突变（c.G521A），使编码色氨酸的密码子UGG变为终止密码子UAG（p.W174X）。1000G、ExAC和gnomAD数据库EAS中未检索到该突变，为功能丧失性（loss of function，LOF）新发变异。预测该突变对蛋白的损害程度为D，根据ACMG指南鉴定为致病的变异。

检测到1个MC3R基因突变，该突变位点在1000G、ExAC和gnomAD数据库EAS中都未检索到，为新发变异。患者13，男性，29岁，BMI为41.67 kg/m²。在chr20：54824110位置发生碱基T>C杂合突变（c.T211C），导致编码的第71号氨基酸由丝氨酸变异为脯氨酸（p.S71P）。预测该突变对蛋白的损害程度为D，根据ACMG指南鉴定为致病的变异。

PHIP基因突变的患者有3个。其中患者12，女性，24岁，BMI为41.1 kg/m²；在chr6：79655966位置发生碱基A>G杂合突变（c.A4382G），导致编码的第1461号氨基酸由赖氨酸变异为精氨酸（p.K1461R），为EAS新发变异。预测该突变对蛋白的损害性为D，根据ACMG指南鉴定为致病的变异。

患者18，女性，50岁，BMI为43.82 kg/m²；PCSK1基因突变为chr5：95748060位置上碱基C>T的杂合突变（c.C844T），导致编码的第282号氨基酸由精氨酸变异为色氨酸（p.R282W）。该变异位点在1000G、ExAC和gnomAD数据库的EAS中都未检索到，为EAS新发变异。预测该突变对蛋白的损害性为DVS，根据ACMG指南鉴定为致病的变异。

共检测到2个ADCY3基因突变，都是之前报道过的罕见错义突变。其中患者24，女性，27岁，BMI为39.04 kg/m²，在PHIP基因和ADCY3基因各检测到了1个突变位点：PHIP基因上的突变鉴定为意义不明的变异。ADCY3基因的突变为chr2：25042876位置上的G>C杂合突变（c.G3363C），导致编码的第1121号氨基酸由赖氨酸变异为天冬酰胺（p.K1121N），该突变在1000G、ExAC和gnomAD数据库中EAS的MAF是0.000 1，为极罕见变异；预测该ADCY3基因突变对蛋白的损害性为DS，根据ACMG指南鉴定为致病的变异。

患者1，男性，46岁，BMI为39.28 kg/m²；在NTRK2基因检测到1个突变，为chr9：87635191位置上碱基C>T的杂合突变（c.C2195T），导致编码的第732号氨基酸由苏氨酸变异为甲硫氨酸（p.T732M）。预测该突变对蛋白的损害程度为DVS，根据ACMG指南鉴定为致病的变异。该突变在3个数据库EAS中都未检索到，为新发变异。

患者5，女性，32岁，BMI为34.01 kg/m²。在AGRP基因的chr16：67516606位置发生碱基G>A杂合突变（c.G332A），导致编码的第111号氨基酸由精氨酸变异为组氨酸（p.R111H）。1000G、ExAC和gnomAD数据库中EAS的MAF为0.001 0。预测该突变对蛋白的损害性为DS，根据ACMG指南鉴定为致病的变异。

在119名接受减重手术的肥胖患者中，有24名患者检测到相关基因的22种罕见突变；其中有12种突变在1000G、ExAC和gnomAD数据库的EAS中未检索到，为东亚人群新发变异。

本研究所检测基因都在LEP-MSH能量平衡调节通路中发挥作用。PHIP可直接增强POMC的转录^［13］。LEP基因编码的蛋白与其受体结合后抑制NPY/AGRP的合成和释放，并激活POMC，进而产生α-MSH和β-MSH，激活MC3R和MC4R^［14-16］。MC4R和ADCY3特异性地共定位在室旁核神经元亚群的初级纤毛中，特异性抑制ADCY3可使小鼠食物摄入量和体质量显著增加^［17］。MC4R同时也可调节BDNF的分泌，BDNF可与其受体NTRK2结合，影响食物摄入和能量分配。SIM1和MC4R共同存在于下丘脑室旁核中，并且SIM1的缺失导致MC4R和催产素的表达减少^［18］。除了激活POMC，LEP与其受体的结合也可在SH2B1的协助下，激活信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3），后者可在Tubby二分转录分子（Tubby bipartite transcription factor，TUB）的帮助下迁移到细胞核，并激活其与能量平衡相关的靶基因，从而调节瘦素的食欲减退效应^［19］。而黑色素聚集激素神经元直接抑制POMC神经元的电活动^［20］，并通过奖赏系统促进食物的摄入^［21］。另外，KSR2调节AMPK的活性^［22］，并直接与AMPK相互作用^［23］。

SH2B1是与非综合征单基因肥胖相关的候选基因。该基因编码一种参与受体酪氨酸激酶（如LEP、BDNF和胰岛素受体）下游信号转导的细胞内衔接蛋白；这些信号通路在食物摄入控制、能量消耗和/或葡萄糖平衡中起着至关重要的作用^［24］。在本队列中SH2B1基因突变频率最高，为5.88%。其中有3个与肥胖相关联的突变位点在1000G、ExAC和gnomAD数据库中未检索到，分别为p.R67C、p.L149F和p.V209I。根据软件预测以及临床表型，ACMG指南把前2个变异都评判为致病的变异；虽然p.V209I被软件预测为良性（B），但由于患者存在肥胖表型，我们建议需要进一步的功能分析来研究该突变对蛋白质的可能影响，从而判断其致病性，因此根据ACMG指南鉴定其为意义不明的变异。

LEPR广泛分布于中枢神经系统及外周组织，促进了LEP的多效性作用；通过脂肪组织和下丘脑之间的负反馈机制，LEPR在体质量调节中起着重要的作用。在一项研究^［25］中，对25个疑似常染色体隐性早发性肥胖家族的个体使用靶向重测序，结果在2名患者中发现了纯合的LEPR变异体；两者都表现出早发性肥胖、食欲过盛和糖尿病，可见LEPR突变对近亲家庭中严重早发性肥胖病例的影响。巧合的是，本研究发现一对姐妹在LEPR基因上存在相同的突变位点（p.W132R），为EAS新发变异；根据软件预测，再结合2名患者的临床表型，根据ACMG指南鉴定其为致病性的变异。因此，两者肥胖的原因很可能都是由该突变引起的。

MC4R在调节人体的能量平衡中起重要的作用，与β-MSH结合后，食物摄取会减少，能量代谢提高，可起到控制体质量的目的^［14］。本研究检测到1例未报道过的MC4R基因上的无义突变（p.W174X），目前该突变在1000G、ExAC和gnomAD数据库EAS中都未检索到，为LOF新发变异。

目前认为对于极度肥胖的患者，减重手术是最有效的方法，但其在单基因肥胖方面的有效性和安全性仍存在争议。我们之前的一项关于单基因肥胖突变减重手术后的6年随访研究^［26］证明单基因突变影响减重手术的有效性。随着人们对肥胖遗传基础的深入了解，肥胖的治疗也有了新的突破。Setmelanotide是一种MC4R激动剂，用于治疗由POMC、PCSK1或LEPR缺乏引起的肥胖，已获得美国食品药品监督管理局的突破性疗法认定^［27］。对于LEP基因突变导致的肥胖患者，通过皮下注射LEP可有所改善^［28］。

探索肥胖的遗传因素，可为今后的精准诊疗提供重要依据。WES对常见、罕见和低频突变均具较高的灵敏度，能发现外显子区域绝大部分疾病相关变异，而且仅需要对约1%的基因组进行测序^［29-30］，缩短了研究周期。大多数单基因肥胖都符合孟德尔遗传定律。随着基因测序的不断发展，越来越多导致肥胖的基因被发现。PAZ-FILHO等^［31］对2名严重早发性肥胖的儿童进行了WES研究，发现解偶联蛋白2（uncoupling protein 2，UCP2）、活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶（activation-induced cytidine deaminase，AICDA）、序列相似的家族71成员E2（family with sequence similarity 71，member E2，FAM71E2）基因与肥胖相关。THAKER等^［32］报道了一名ROHHAD综合征的病态肥胖儿童，应用WES发现其存在视黄酸诱导蛋白1（retionic acid induced 1，RAI1）突变。

本研究通过WES，共筛选出了12种肥胖相关的EAS新发变异，为肥胖的发病机制和个体化治疗提供了新的线索。本课题组之前的一项研究^［26］利用WES筛选减重手术患者中携带MC4R、MC3R、LEP、LEPR、PCSK1和SIM1基因突变的人群，并对突变携带者与非携带者随访6年，结果显示突变携带者代谢手术后6年的疗效比非携带者差。突变携带者术后的代谢指标，与基线相比虽然都有好转，但改善程度低于非携带者。本研究进一步完善了筛选的LEP-MSH通路基因，但由于随访时间较短，突变携带者与非携带者的术后疗效与代谢指标之间并没有显著差异。后续我们将延长随访时间，观察并比较携带者与非携带者术后的长期疗效，进一步明确我们所鉴定得到的新的致病性突变的临床意义。并且由于经济、时间等因素，目前本研究所纳入的样本量较少；本研究仅仅通过生物信息学分析预测了突变的有害性，并没有进行功能验证，因此还有待进一步的蛋白质结构分析、细胞以及动物实验来验证基因变异位点的致病性。