迟发性脊椎骨骺发育不良（spondyloepiphyseal dysplasia tarda，SEDT；OMIM 313400），是一种罕见的遗传性骨软骨发育不良疾病，X染色体连锁隐性遗传，通常儿童中后期起病，发病率约为1.7/100万^［1］。该病引起骨和软骨发育障碍，主要累及骨骺和椎体。临床特点包括短躯干型身材矮小及进行性大关节退行性变，常伴有桶状胸和脊柱侧弯畸形。影像学可表现为胸腰椎椎体扁平，椎体前部上下缘凹陷、中后部呈驼峰状突起以及椎间隙狭窄等^［2-4］。

SEDT由致病基因转运蛋白复合体亚单位2（transport protein particle complex subunit 2，TRAPPC2）突变引起。该基因位于X染色体p22.2约20 kb的基因组区，包含6个外显子，其开放阅读框由第3~6个外显子内的420个核苷酸组成，编码一种140个氨基酸的蛋白质（TRAPPC2，又称sedlin），为转运蛋白复合体的组成成分。目前在人类基因突变数据库（The Human Gene Mutation Database，HGMD；http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac）收录的TRAPPC2突变中最常见的类型为缺失突变，此突变可导致TRAPPC2功能缺陷，影响该蛋白参与内质网至高尔基体间囊泡运输的定位和融合功能^［5］，进一步影响高尔基体完整性或胶原分泌水平，从而导致椎体发育异常^［6］。本研究对一个SEDT家系进行高通量测序，发现其TRAPPC2基因第4~6个外显子缺失，从基因水平鉴定了该家系的致病原因，为该家系成员遗传咨询和产前诊断提供了重要的依据。

先证者（图1，Ⅲ-11），男性，24岁，来自非近亲家系；因身材矮小，脊柱及胸廓异常至兰州慈和堂医院就诊。该患者出生身长正常，儿童期发现生长缓慢，无智力障碍，目前身高155 cm，诉腰背部疼痛，体格检查可见桶状胸、脊柱侧弯。脊柱X光片显示椎体变薄，椎间隙中后部显著狭窄，椎弓根发育正常，下胸椎和腰椎改变明显，椎体中后部上下缘呈驼峰状隆起，前部低下，前后缘延长及椎间隙变窄。患者为进一步明确诊断，至上海交通大学医学院附属新华医院遗传咨询门诊就诊。

先证者舅舅（Ⅱ-2），51岁，身高150 cm，出生情况无异常，身高偏矮，无关节疼痛及活动受限。先证者表哥（Ⅲ-5），31岁，身高135 cm，颈短，短躯干，无关节疼痛。获得知情同意后，共采集该家系6名成员（分别为Ⅱ-4、Ⅱ-9、Ⅱ-10、Ⅲ-5、Ⅲ-10和Ⅲ-11）的外周静脉血进行分析。该家系的图谱见图1。正常对照的样本取自在上海交通大学医学院附属新华医院进行遗传检测的表型正常个体，均获得知情同意。

抽取先证者及其家系其他5位成员的外周血2 mL（EDTA抗凝），采用血液DNA提取试剂盒（德国QIAGEN），按照标准步骤提取基因组DNA。

对先证者样本进行高通量测序。采用Clearseq遗传性疾病试剂盒（美国Agilent）检测，对于探针捕获的DNA片段应用Illumina HiSeq 4000（美国Illumina）进行高通量测序。使用GATK（Genome Anlysis Toolkit，version3.3）软件分析单核苷酸突变和小片段的插入缺失。将高频的变异［在千人基因组项目（1000 Genomes Project，1kGP；http：//www.internationalgenome.org/）、基因组聚合数据库（Genome Aggregation Database，GnomAD；http：//gnomad-sg.org/）和Exome Variant Server（EVS，http：//evs.gs.washington.edu/evs/）中频率>1%或本地6 000人份外显子测序数据库中频率>5%的变异］从候选的变异中删除。随后通过遗传方式显隐性进一步过滤变异数据。应用外显子组隐马尔科夫模型（exome hidden Markov model，XHMM）在该样本中分析拷贝数变异（copy number variant，CNV），另外600个正常个体样本作为对照，比较该样本和对照样本相应划分窗口的拷贝数，获得各窗口拷贝数数据，然后经过注释获得各区域拷贝数分析列表。平均测序深度105.8×，覆盖率97.0%。

根据检测到的基因缺失片段设计3对特异性引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以6名家系成员和正常男性的DNA基因组为模板，根据SYBR^® Premix ExTaq^TM试剂盒［宝生物工程（大连）有限公司］说明书配制反应体系，置于ABI 7500高通量荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems）进行实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测拷贝数改变。

通过GATK生信分析未获得与表型相关的致病变异。随后采用XHMM分析过滤数据，最终发现X染色体存在2.5 kb片段缺失（chrX：13 732 385~13 734 927，参考基因hg19），该区域覆盖TRAPPC2基因的第4~6个外显子。

对家系中6名成员TRAPPC2的第4~6个外显子区域进行RT-qPCR分析。先证者（Ⅲ-11）和先证者表哥（Ⅲ-5）均表现为第4~6个外显子区域半合子缺失，拷贝数均为0。先证者母亲（Ⅱ-9）表现为第4~6个外显子区域杂合缺失，拷贝数分别为1.13、1.22、1.14。其他3名成员包括先证者姐姐（Ⅲ-10）、表型正常的舅舅（Ⅱ-4）以及先证者父亲（Ⅱ-10）第4~6个外显子区域均含有正常的拷贝数（图2）。

根据患者临床表现（身体矮小、桶状胸、脊柱侧弯）以及典型的影像改变（椎体“驼峰”状隆起、椎间隙狭窄），结合其母亲携带致病基因、家系中男性患病，可诊断此家系为X连锁SEDT。此类传统的诊断方法主要依据典型的临床表现及影像特征，但该病临床表型异质性高，且儿童期起病，发病年龄为3~12岁，缺少生化代谢异常表现，早期诊断尤为困难^［7］。随着分子诊断技术的飞速发展，高通量测序技术在罕见疾病中的应用日臻成熟。通过与其他测序技术联合，目前人类基因组突变数据库收录了不同种族60余种TRAPPC2基因的突变，包括无义突变、错义突变、缺失、插入和剪接突变等；其中缺失是最主要的突变类型，占比50%左右。

CHRISTIE等^［8］对4个SEDT家系研究后发现了TRAPPC2基因的2个缺失突变和2个无义突变：2个缺失突变分别为750 bp和1 300~1 445 bp缺失，均包含第5个内含子的3′端和第6个外显子的5′端；2个无义突变分别为第4个和第6个外显子的无义突变，均导致TRAPPC2蛋白截断。研究认为这4种突变均为致病突变。日本1例SEDT患者经检测发现了TRAPPC2基因693 bp的缺失，包括第4个外显子和第5个内含子（c.197_324+121del693bp），同样为致病突变^［9］。本研究通过高通量测序及RT-qPCR分析明确了该家系为TRAPPC2基因缺失突变，范围包括第3个内含子的3′端、编码区第4~6个外显子以及第6个外显子非编码区的3′端，约2.5 kb碱基缺失，是目前所知TRAPPC2基因最大的缺失片段，同时与文献报道的缺失突变大多出现在第4~6个外显子区域一致，此区域是蛋白质结合和维持蛋白质三维结构的重要区域^［10-11］。第4个外显子的5′端在TRAPPC2的结构和功能中起关键作用。第4个外显子的缺失突变，可导致蛋白质翻译提前终止，部分生成的多肽被降解，影响细胞TRAPPC功能，导致骨软骨发育不良^［12］。第6个外显子编码的TRAPPC2氨基酸序列111~115在脊椎动物和无脊椎动物中高度保守，是该蛋白的一个功能结构域，蛋白的提早截断将影响C末端的高尔基体靶向域功能，影响囊泡运输^［4］。美国医学遗传学和基因组学学院（America College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南大多将影响外显子序列缺失的突变归类为致病性突变/可能致病突变。此家系中TRAPPC2基因多个外显子缺失突变，几乎影响整个编码区，导致蛋白截断，无法构建正常结构域，严重影响蛋白质功能。结合患者临床表现，鉴定此缺失突变为该家系的致病性突变。

通过TRAPPC2突变的基因型和表型相关性研究^［4，13］发现：突变位点靠近5′端时临床表现较严重，靠近3′端时则临床表现较轻；TRAPPC2基因第5~6个外显子突变的患者常无或有轻微的髋关节疼痛，而第3~4个外显子突变常会引起脊柱畸形，并相对较早出现关节疼痛及较为严重的并发症。GEDEON等^［4］研究了30例SEDT患者，没有发现明确的基因型/表型相关性。本研究家系的TRAPPC2基因变异包含第4~6个外显子缺失，先证者及其表哥均表现为身材矮小，先证者表现出较显著的脊柱畸形，与文献报道一致。而携带TRAPPC2大片段缺失突变的患者在该蛋白缺乏的情况下能够存活的可能原因是假基因的代偿，其中可能性最大的是TRAPPC2B基因，其位于染色体19q13.4，可以编码与TRAPPC2相同的蛋白质^［6］。TRAPPC2基因变异患者若存在假基因表达，临床表型可能相对较轻^［6，14］。

目前高通量测序技术是鉴别遗传性疾病致病突变的有效工具，在临床诊断方面具有巨大潜力，已广泛应用于具有明显遗传异质性疾病的分子诊断中。以往因CNV高度变异，检测技术有限，影响CNV结果判读。随着算法的改进和大数据集的应用，CNV分析更加精确。有学者曾对3 010例样本进行回顾性分析^［15］，证实高通量测序对CNV的高检出率；分析过程应用了3种方式，即XHMM、CNVkit（CNV预测软件，适用于全外显子；https：//github.com/etal/cnvkit）和EXCAVATOR2（利用全外显子测序数据进行CNV分析的软件，http：//sourceforge.net/projects/excavator2tool/）；其中XHMM算法最常用，其在检测临床相关致病性CNV时的总体敏感度为98.7%，表明高通量测序技术联合合适的算法可作为识别此类致病性CNV的首选，成本效益较高、操作简单。本研究应用高通量测序和XHMM算法检测到SEDT患者的多个外显子缺失，再次验证了该方法在检测CNV方面的潜力。