结核病（tuberculosis，TB）是一种慢性传染病，由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起，是全球十大疾病死因之一。2023年，在30个结核病高负担国家中，我国发病数估算排第3位，结核病患者占全球结核病患者总人数的6.8%^［1］。巨噬细胞是免疫系统抵御Mtb的第一道防线，在Mtb感染巨噬细胞时，巨噬细胞免疫代谢及抗原提呈功能发生改变，进而影响巨噬细胞存活及胞内Mtb生长^［2］。Mtb在人体内的感染进程与机体的免疫识别及应答机制存在密切联系，宿主对结核病的保护性免疫应答是基于先天免疫细胞反应，并协同活化巨噬细胞与特异性T细胞之间的相互作用^［3］。目前基于免疫调控的结核病治疗策略已成为抗感染研究的重要方向。

传统藏药红景天（Rhodiola rosea），为蔷薇目景天科红景天属多年生草本或亚灌木野生植物，用于治疗肺病古已有之。红景天最早见于藏医经典著作《四部医典》，藏药名为“索罗玛布”，具有“性凉、清热、滋补元气”的功效，能“治血病、赤巴病、疮疖溃烂”^［4］。现代研究表明红景天具有体外抗结核作用^［5］。临床试验表明红景天能明显改变肺结核患者的细胞免疫功能，加快肺部病变的吸收速度^［6］。红景天苷（salidroside， SAL）作为其主要有效成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、调节机体免疫功能等作用^［7］。研究发现SAL可通过调节小鼠体液免疫及细胞免疫发挥免疫佐剂作用^［8］。SAL能够提高巨噬细胞吞噬能力，也可能通过促进诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表达，刺激NO的合成和释放，从而调节免疫，提高免疫细胞的杀伤活性^［9］。SAL调控Mtb感染巨噬细胞免疫功能的机制目前尚未清晰，本研究利用卡介苗（Bacille Calmette-Guérin，BCG）感染的RAW264.7小鼠巨噬细胞模型，探索SAL对BCG感染的巨噬细胞的免疫调节作用及其机制，为评价SAL的抗Mtb作用提供科学依据。

BCG、小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）为本实验室自存。增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的质粒通过电转至BCG构建表达绿色荧光蛋白的BCG（BCG expressing green fluorescent protein，BCG-GFP）。

SAL购自成都瑞芬思德丹生物科技有限公司，异烟肼（isoniazid，INH）购自上海阿拉丁试剂有限公司；Middlebrook 7H9 Broth（以下简称7H9）肉汤培养基、Middlebrook 7H11 Agar（以下简称7H11）琼脂培养基、油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶（oleic acid-albumin-dextrose-catalase，OADC）增菌液购自青岛海博生物技术有限公司；小鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、小鼠γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、小鼠白介素-6（interleukin-6，IL-6）、小鼠IL-10酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒均购自江苏酶免实业有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和DMEM高糖基础培养基均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；Annexin V-APC/7-AAD凋亡试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司（AP105）；噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）均购自北京博奥拓达科技有限公司。

将RAW264.7细胞置于完全培养基（含有10% FBS的DMEM高糖基础培养基）中，在37 ℃、相对湿度为95%以上、5% CO₂培养箱中培养，当细胞密度达到70%~80%时进行传代。将冻存的BCG菌株取10 μL，接种于含10% OADC增菌液的7H9液体培养基中，置于37 ℃恒温摇床，以0.1×g的离心力振荡培养，经2~3周连续培养后可见培养基浑浊。待细菌生长状况良好后，每周液体传代1次。选择对数生长期的菌株进行后续实验。

选择对数生长期的BCG制备BCG单细菌菌液，利用紫外分光光度计计算细菌浓度，用7H9肉汤培养基调零，测细菌悬液的吸光度（D）值，计算菌液菌落形成单位（colony-forming unit，CFU）。D （600 nm）=0.1时，菌液浓度为1×10⁷ CFU/mL。当RAW264.7细胞稳定生长至80%时，确定感染复数（multiplicity of infection，MOI）。以MOI=10（BCG∶细胞=10∶1）对细胞进行感染，充分混匀后置于培养箱中孵育4 h后弃上清，以预温的PBS洗涤3次，每次洗涤5 min以去除未进入细胞内的细菌，荧光显微镜下观察或用无菌水裂解细胞后，取适量裂解液接种至7H11琼脂培养基表面，3~4周后观察是否有菌落生长。在荧光显微镜下看到绿色荧光的BCG或7H11琼脂培养基有菌落生长，感染模型构建即为成功，用此模型进行后续实验。

将SAL和INH用PBS分别配置成16 mmol/L和5 mmol/L的高浓度药物母液，经0.22 μm的滤膜过滤后分装并于-20 ℃保存，1个月内使用。实验前将分装的药物母液于4 ℃平衡1 h，用完全培养基稀释至实验所需终浓度，用于后续实验。

调整细胞密度至1×10⁵个/mL，每孔分配100 μL细胞悬液，种于96孔细胞培养板中，在37 ℃、5% CO₂、饱和湿度的培养箱中培养24 h。将不同浓度的SAL（1、25、50、100、200、400、800、1 600 μmol/L）和INH（5、10、25、50、75、100、125、150 μmol/L），每孔100 μL，分别加入96孔细胞培养板中，剩余1列不加药物作为空白对照组。培养24 h后每孔加入10 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，继续37 ℃培养箱孵育4 h后，用移液器小心吸弃细胞培养板上清，避免吸取底部甲瓒结晶，每孔加入150 μL DMSO充分溶解结晶，以λ=490 nm处的吸光度测算MTT并分析细胞存活率。

实验分为4组，即空白对照组（BCG组）、红景天苷组（SAL+BCG组）、异烟肼组（INH+BCG组）及红景天苷+异烟肼组（SAL+INH+BCG组）。实验组均在感染前用相应药物预处理巨噬细胞36 h。

在BCG感染4、24 h后吸弃孔内培养基，向细胞培养板中加入0.5％Triton X-100或无菌纯水以裂解巨噬细胞并释放胞内细菌。取裂解液用7H9肉汤培养基分别进行100倍及1 000倍稀释，各吸取100 μL稀释液以无菌玻璃珠滚动辅助铺板，使菌液均匀涂布于7H11琼脂培养基表面，将培养平板用封口膜密封后，置于37 ℃培养箱中培养3周；在BCG感染4、24 h后吸弃细胞培养上清，收集孔内细胞，用预冷PBS清洗2次，用500 μL PBS将细胞重悬于流式检测管中，用流式细胞仪进行检测，用GFP通道检测胞内BCG的存活率。

分别在BCG感染巨噬细胞4、24 h后用移液器轻柔吹打收集细胞，4 ℃、500×g离心5 min，弃上清。使用预冷的PBS溶液对细胞进行2次洗涤，加入500 μL 1×Binding Buffer重悬细胞。设置Annexin V-APC和7-AAD单染组以及未染色细胞组，用于检测时电压参数的调节和后续补偿调节。每管细胞悬液中依次加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7-AAD，涡旋振荡混匀，室温避光孵育5 min后，转移至流式检测管中，使用流式细胞仪进行上机检测，用FlowJo软件进行荧光补偿校正及细胞凋亡定量分析。

分别在BCG感染巨噬细胞4、24 h后收集各组细胞培养上清液，4 ℃，500×g离心5 min，以去除上清中细胞碎片、蛋白质及微小颗粒等。采用ELISA法检测细胞培养上清中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10的水平，严格根据试剂盒说明书要求进行操作。用未加样本和酶标剂的空白孔调零，加入终止剂后15 min内，在λ=450 nm处读取标准品及样本的吸光度数值，使用标准品吸光度绘制标准曲线，统计并分析样本细胞因子水平。

采用GraphPad Prism 9.5.0软件进行统计学分析。符合正态分布的定量数据以x±s表示。2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素/双因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

用不同浓度的SAL（1、25、50、100、200、400、800、1 600 μmol/L）和INH（5、10、25、50、75、100、125、150 μmol/L）处理RAW264.7细胞，MTT法检测SAL和INH对RAW264.7细胞增殖的影响，筛选SAL及INH的安全给药浓度。结果显示：800 μmol/L及以下的SAL对RAW264.7细胞无毒性作用，1 600 μmol/L的SAL使RAW264.7细胞活性显著下降（P=0.043），表明该浓度的SAL对RAW264.7细胞有一定的毒性（图1A）；与空白对照组相比，125 μmol/L及以下的INH对RAW264.7细胞活性无显著影响（图1B）。查阅相关文献^［10-11］并结合本实验结果，选择SAL给药浓度为800 μmol/L、INH给药浓度为10 μmol/L进行后续实验。

为探究SAL在BCG感染巨噬细胞中的作用，首先验证SAL是否有直接抗结核作用，即在BCG感染后24 h检测SAL对巨噬细胞内BCG生长与存活的影响。细菌铺板计数结果发现与Ctrl组相比，在BCG感染前24、36 h用SAL对巨噬细胞进行预处理，均能够显著抑制巨噬细胞内BCG的存活率，且SAL预处理36 h对BCG胞内存活抑制作用更为显著（图2）。基于上述结果，本研究采用感染前36 h药物预处理进行后续研究。

用药物预处理巨噬细胞，再经BCG感染4、24 h，用流式细胞术对各组细胞胞内细菌存活情况进行检测。发现在感染4 h后，给药组与BCG组相比BCG存活率均有所降低，但只有SAL+INH+BCG组差异有统计学意义（P=0.042），表明给药组对巨噬细胞吞噬BCG的作用影响较小。感染24 h后，SAL+BCG组（P=0.041）、INH+BCG组（P<0.001）及SAL+INH+BCG组（P<0.001）与BCG组比较胞内BCG存活均降低，差异有统计学意义；与SAL+BCG组比较，INH单用及SAL+INH联用对巨噬细胞胞内BCG抑制效果更明显（图3）。上述结果表明SAL能够抑制BCG在感染巨噬细胞内的增殖和存活，有利于巨噬细胞清除杀灭BCG，且SAL和INH联用可产生更好的抑制作用。

为了研究SAL对BCG感染RAW264.7细胞免疫反应的潜在影响，在BCG刺激RAW264.7细胞4、24 h后，测定细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10的水平（图4）。结果表明：与BCG组相比，在感染24 h后，SAL+BCG组的TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10水平降低（但差异无统计学意义），SAL+INH+BCG组的TNF-α（P=0.016）、IL-6（P=0.036）及IL-10（P=0.047）水平显著降低，IFN-γ水平有所降低（但差异无统计学意义）。

在BCG感染巨噬细胞4、24 h后用流式细胞术检测细胞凋亡。在4个象限的细胞分布图中，右上为晚期细胞凋亡，右下为早期细胞凋亡，比较各组巨噬细胞总凋亡率（图5）。与BCG组比较，在感染4 h后，SAL+BCG组能够显著抑制巨噬细胞凋亡率（P=0.008），而SAL+INH+BCG组在感染早期的凋亡率与BCG组相近；感染24 h后，SAL+BCG组（P=0.003）、INH+BCG组（P=0.005）及SAL+INH+BCG组（P=0.001）与BCG组相比凋亡率均显著升高。上述结果表明：在感染初期，SAL和INH能够降低BCG感染的RAW264.7细胞凋亡水平，但在感染后期SAL与INH联合应用能够增强BCG感染的RAW264.7细胞凋亡水平。

结核分枝杆菌侵入人体后，主要驻留于肺部，并被肺泡巨噬细胞等免疫细胞吞噬，继而导致免疫细胞活化，并触发机体的免疫调控作用^［12］。然而，Mtb利用其特有的生物特性对巨噬细胞产生免疫逃逸，在宿主体内增殖并长期潜伏，增加了治疗难度和复发风险^［13］。本研究选取BCG感染巨噬细胞以构建体外Mtb感染模型，能够一定程度地模拟体内Mtb感染巨噬细胞。现有研究表明，SAL在免疫调节及多种疾病治疗作用中展现出显著调控作用^［14］，然而目前关于SAL在结核病方向的研究尚不多见。因此本研究通过构建体外实验模型，初步研究SAL对巨噬细胞抗结核的免疫作用机制，为SAL在结核病免疫干预策略提供新的实验依据。

前期实验发现不同浓度的SAL在体外不具有直接抗Mtb活性^［15］。通过统计胞内细菌的存活率，发现SAL能够显著抑制BCG感染巨噬细胞细胞内的BCG，SAL与INH联用对胞内细菌的抑制效果更佳。表明SAL可以通过促进宿主巨噬细胞对胞内Mtb的清除，起到辅助治疗结核病的作用，从而提高结核病的治愈率并降低复发率。

细胞因子在免疫应答和炎症反应中扮演着关键角色，其表达水平变化可以调节细胞的免疫功能。Mtb感染可诱导宿主持续性炎症反应并引发免疫病理损伤，进而导致组织结构破坏。细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6及IL-10能够促进炎症反应、介导细胞凋亡和免疫应答^［16］。本研究结果显示，SAL会影响BCG感染的巨噬细胞中细胞因子的分泌，SAL能够降低TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10的水平，当SAL与INH联合使用时对炎症因子的抑制作用更为显著，提示SAL可调节BCG感染的RAW264.7细胞的免疫功能，从而抑制炎症反应。SAL也可通过抑制NLRP3炎症小体的活化以减轻肺损伤^［17］。王慧莲等^［18］研究发现SAL可以减轻RAW264.7细胞炎性损伤，本研究结果与其一致。由此推断，SAL可以通过抑制感染的巨噬细胞炎性反应发挥抵抗Mtb感染的作用，这为SAL对结核病的治疗提供一定的依据。SAL的抗炎作用不仅有助于减轻结核病患者的炎症反应和组织损伤，还可能通过调节免疫应答，促进疾病的恢复和预后改善。

Mtb感染能够抑制巨噬细胞凋亡、促进巨噬细胞坏死，造成其在体内散播和增殖而致病。而巨噬细胞凋亡是控制细胞内病原体生长的有效策略，在抵御Mtb感染的过程中发挥着重要的作用^［19-20］。本研究发现，SAL在感染初期能够抑制BCG感染巨噬细胞的凋亡，增加BCG在巨噬细胞内的存活时间；在感染后期，SAL及INH均能促使BCG感染的巨噬细胞凋亡，从而促进胞内BCG的清除。SAL作为一种潜在的辅助治疗药物，可能介导巨噬细胞凋亡从而抑制胞内细菌的存活和增殖，加速病灶的清除和疾病的好转；且SAL与抗结核药物的联用可能提高治疗效果，缩短治疗周期。

综上所述，SAL与一线抗结核药物INH联用能更有效地抑制胞内BCG的存活、降低促炎因子的分泌并促进巨噬细胞凋亡，表明SAL在抗Mtb感染中可以通过改善巨噬细胞免疫功能，减轻Mtb诱导的炎症反应，发挥其宿主抗Mtb作用。本研究提供了SAL在细胞层面抗Mtb作用的依据，但作用机制尚未完全清晰，今后将进一步研究。