创面愈合后，瘢痕中一直存在慢性炎症反应^［1］。既往文献多将其归因于无菌性炎症，但近年也有研究^［2-3］指出微生物和瘢痕形成密切相关，亦有报道^［4］指出，使用含抗菌成分的敷料杀菌可以减轻愈合后瘢痕。笔者团队^［5］曾收集瘢痕形成时间介于6~12个月的33例增生性瘢痕组织，以及36例正常皮肤组织，通过高通量测序发现：增生性瘢痕存在“细菌超载”现象，其中金黄色葡萄球菌丰度显著高于正常皮肤，且与温哥华瘢痕量表评分呈正相关。该现象突破了“创面愈合后瘢痕组织内无菌”的传统观念，部分解释了瘢痕内慢性炎症持续存在的原因，以及临床上伴有毛囊炎的下颏、会阴部瘢痕增生异常严重等现象。但是，瘢痕内低丰度的细菌，是否是瘢痕增生的致病因素之一？另外，对瘢痕内细菌进行抗生素治疗，是否可以部分减轻瘢痕增生？本研究拟通过体内外实验，初步阐明细菌对瘢痕形成的影响，以及寻找干预瘢痕增生的新方法。

选取2023年1月——2024年12月于上海交通大学医学院附属瑞金医院烧伤整形与创面修复科住院并行瘢痕切除、自体皮肤移植术的增生性瘢痕患者16例。排除合并瘢痕感染及瘢痕疙瘩的患者。以患者术后残留的正常皮肤组织作为对照组。

取人体正常皮肤和瘢痕组织，去除表皮及真皮浅层，经4%多聚甲醛固定后，于梯度乙醇中连续脱水，二甲苯透明，低熔点石蜡包埋并定向连续切片，厚度5 μm。固定后的组织进行革兰染色（试剂盒购自武汉赛维尔生物技术有限公司），观察并采集图像。兔耳瘢痕组织处理同上，分别进行革兰染色、苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色及Masson染色，操作均参照标准实验流程。

采用组织块培养法，取正常皮肤组织经PBS冲洗后剪碎，加入含10%胎牛血清的DMEM培养瓶中，置于37 ℃、5% CO₂培养箱内孵育。1周后于显微镜下可观察到成纤维细胞自组织块迁出，待细胞融合度达80%时进行传代。本研究采用第2~6代细胞。

将正常皮肤组织中培养的成纤维细胞接种于75 cm²培养瓶中。购买金黄色葡萄球菌菌株，经培养扩增后，于100 ℃条件下灭活10 min，获得含灭活细菌及其代谢产物的菌液。分别按照10²、10³、10⁴ CFU/mL的浓度将其添加至成纤维细胞培养瓶中，孵育48 h后，采用Edu染色法观察细胞增殖情况，同时收集细胞培养上清液，用于酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）；另抽提细胞蛋白质，用于Western blotting检测。

采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测（ELISA试剂盒均购自上海森雄科技实业有限公司）。以白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）为例：将抗大鼠IL-6单抗包被于酶标板上，使标准品和样本中的IL-6与单抗特异性结合；加入生物素化的抗大鼠IL-6抗体，形成免疫复合物并结合于板上；再加入辣根过氧化物酶标记的亲和素使其与生物素结合，最后加入酶底物显色，在450 nm处测定吸光度（D_{450 nm}）值，并计算相应IL-6的浓度。同法检测IL-8、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）浓度。

用RIPA裂解液提取总蛋白，并通过BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS‑PAGE）分离后，转印至硝酸纤维素膜上。用5%脱脂牛奶封闭1 h，随后加入以下分子的一抗，4 ℃孵育过夜：转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（稀释度均为1∶1 000；武汉三鹰生物技术有限公司），血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）（1∶1 000；美国Cell Signaling Technology）。TBST洗膜3次，每次10 min。二抗室温孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min。采用化学发光法显影，使用ImageJ软件对蛋白条带进行灰度值分析。

为检测金黄色葡萄球菌对成纤维细胞增殖水平的调控作用，本研究采用Edu染色法进行检测。具体步骤如下：收集培养后的成纤维细胞，与10 mmol/L的Edu试剂（货号C0075S，上海碧云天生物技术股份有限公司）共同孵育；用4%多聚甲醛固定细胞，加入反应缓冲液孵育；使用Hoechst33342染料对细胞核进行染色，置于荧光显微镜下观察；通过ImageJ软件对红色荧光强度进行定量分析，以此评估细胞增殖水平。

收集细胞后，以4%甲醛固定，PBS洗涤，室温下用0.1% Triton X-100渗透处理15 min。经1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭后，加入抗α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体（1∶200；ab51520，英国Abcam）室温孵育1 h，再以兔抗小鼠二抗（1∶100；北京索莱宝科技有限公司）室温孵育1 h。最后用4'，6'-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；美国Sigma）染色。采用共聚焦激光扫描显微镜（德国Zeiss）观察并采集图像。

选取10只新西兰白兔［雌雄各5只，月龄4个月，体质量（2.5±0.3） kg］，参照既往文献方法制作兔耳瘢痕模型^［6］。新西兰白兔购自上海甲干生物科技有限公司，生产许可证号SCXK（沪）2025-0007，使用许可证号SYXK（沪）2024-0002。按照《实验动物环境及设施》有关规定，所有新西兰兔单笼饲养，每日12 h光照，相对湿度为40%~65%，温度18~25 ℃，可自由进水及进食。

于每侧兔耳制作4个面积1 cm²的创面，深达软骨表面，随后于创面滴加10³ CFU/mL的金黄色葡萄球菌菌液1 mL。造模后24 d兔耳瘢痕形成，将每侧兔耳的4个瘢痕分为2组，每组2个，最终对照组、实验组各40个瘢痕。处理方法如下：对照组瘢痕内直接注射生理盐水，实验组注射左氧氟沙星注射液（0.75 mg/mL，先声药业有限公司），单瘢痕注射剂量为0.1 mL；分别于造模后第24、31、38日各注射1次，每周1次，共3次；于造模后第60日取材，进行后续实验。并在第24、31、38、45、60日对瘢痕进行温哥华瘢痕量表评分，内容包括色泽、血管分布、柔软度及厚度。

采用链霉亲和素-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法进行免疫组织化学染色，主要步骤如下：石蜡切片常规脱蜡至水，内源性过氧化物酶封闭液处理10 min，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗。BSA封闭15 min后，加入兔抗人IL-6、IL-8、TNF-α及MCP-1抗体（工作浓度1∶100；美国Santa Cruz Biology），4 ℃过夜孵育；PBS冲洗后加入抗兔二抗，室温孵育30 min。PBS冲洗，加入SP试剂，室温孵育30 min。PBS冲洗后，二氨基苯乙胺（diaminobenzidine，DAB）显色10~15 min。流水冲洗、脱水、中性树脂封片。以正常兔血清代替一抗作为阴性对照，出现棕黄色染色判定为阳性表达。

采用SPSS 27.0软件进行数据分析。符合正态分布的定量资料以x±s表示。2组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，当差异有统计学意义时进一步采用最小显著差异（least significant difference，LSD）法进行两两比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。

患者瘢痕生长时间为6个月至2年；其中男性10例，平均年龄（37.6±5.7）岁；女性6例，平均年龄（34.7±4.8）岁。2组性别构成与年龄比较，差异均无统计学意义。

结果显示，在正常皮肤组织内仅见极少量的革兰阳性菌，而在增生性瘢痕组织内可见大量革兰阳性菌，细菌呈现颗粒状，数量显著高于正常皮肤组（P=0.001，图1）。

为验证瘢痕相关细菌对成纤维细胞增殖的影响，采用Edu染色法进行检测。结果显示：与对照组比较，10²和10³ CFU/mL的细菌能够显著促进成纤维细胞增殖（P=0.045，P=0.017）；当细菌浓度上升至10⁴ CFU/mL时，其促增殖作用有所减弱（图2）。提示低丰度细菌可促进成纤维细胞增殖。

收集细胞培养液上清液，采用ELISA检测炎症因子表达水平，结果显示：经10² CFU/mL和10³ CFU/mL热灭活细菌处理后，成纤维细胞分泌的IL-6（P=0.023，P=0.011）、IL-8（P=0.021，P=0.009）、TNF-α（P=0.029，P=0.011）和MCP-1（P=0.023，P=0.008）水平均呈浓度依赖性升高。当细菌浓度升至10⁴ CFU/mL时，上述炎症因子水平有所下降，但仍显著高于对照组（P=0.021，P=0.017，P=0.022，P=0.019）（图3）。提示低丰度细菌能够促进成纤维细胞分泌炎症因子。

为探究瘢痕相关细菌对成纤维细胞分泌生长因子及胶原的调控作用，采用Western blotting检测VEGF、TGF-β1、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白表达水平。结果显示：与对照组相比，10² CFU/mL和10³ CFU/mL细菌处理可显著上调成纤维细胞中VEGF（P=0.023，P=0.011）、TGF-β1（P=0.029，P=0.031）、Ⅰ型胶原（P=0.032，P=0.025）和Ⅲ型胶原（P=0.019，P=0.027）的蛋白表达；而当细菌浓度升高至10⁴ CFU/mL时，上述因子的表达水平呈现下降趋势，与10³ CFU/mL组相比差异具有统计学意义（P=0.032，P=0.024，P=0.035，P=0.026）。详见图4。上述结果提示：低丰度细菌可有效促进成纤维细胞中与纤维化发生相关蛋白的表达，增强其促纤维化生物学功能。

免疫荧光检测结果显示，对照组仅见极少量α-SMA阳性表达；经10²、10³ CFU/mL细菌处理后，成纤维细胞中α-SMA表达水平显著升高，并与细菌呈浓度依赖性正相关（P=0.042，P=0.002）；当细菌浓度升至10⁴ CFU/mL时，α-SMA表达量有所下降，但略高于对照组（P>0.05，图5）。上述结果提示，低丰度细菌可有效促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。

本研究采用兔耳增生性瘢痕模型，探讨清除细菌对瘢痕形成的干预作用。术后第24日，兔耳增生性瘢痕模型构建成功，瘢痕组织表现为充血发红、质地坚硬且局部隆起。随后于瘢痕局部注射生理盐水（对照组）与左氧氟沙星（实验组）。术后第60日大体观察发现：对照组瘢痕仍呈明显红色，组织增厚；而实验组瘢痕组织趋于平软，颜色变淡，红色浸润区域显著缩小（图6A）。温哥华瘢痕量表评分结果表明，实验组评分在术后第45日和第60日均显著低于对照组（P=0.019，P=0.013；图6B）。上述结果提示：局部应用左氧氟沙星可减少兔耳模型的增生性瘢痕形成。

于观察终点取兔耳瘢痕组织，革兰染色显示：对照组可见较多致密阳性染色，而实验组阳性染色明显减少；HE染色显示：与对照组相比，实验组炎症细胞浸润减少，胶原排列相对疏松，更接近成熟瘢痕或正常皮肤组织形态；Masson染色显示：对照组胶原大量沉积、排列致密，而实验组胶原含量显著降低、结构疏松，与正常皮肤更为接近（图7）。提示局部应用抗生素可减少瘢痕内细菌数量、炎症细胞浸润及胶原沉积。

于观察终点取材，采用免疫组织化学染色检测炎症因子表达。结果显示，对照组中IL-6、IL-8、TNF-α和MCP-1呈高表达，而实验组上述因子表达水平显著降低（P=0.025，P=0.021，P=0.019，P=0.028）（图8）。提示局部应用抗生素可减少瘢痕内炎症因子的产生。

Ogawa^［1］认为，炎症可能是增生性瘢痕发生的重要驱动因素。我们发现：去除表皮及真皮浅层组织后，瘢痕内存在以金黄色葡萄球菌等为主的“细菌超载”现象；这可能是瘢痕中慢性炎症迁延的重要原因^［1］。创面愈合后组织中为何残留细菌呢？结合以往文献分析，可能与细菌耐药、生物膜形成、免疫逃逸等多种因素有关^［7-8］。有文献报道：金黄色葡萄球菌可以刺激中性粒细胞产生衣康酸来抑制中性粒细胞氧化暴发，从而逃避机体的免疫清除^［9］；这些逃逸的细菌最终定植于皮肤，成为瘢痕组织中的共生菌。而成纤维细胞作为瘢痕修复中的关键细胞，其功能主要受到周边微环境的调控。因此，瘢痕中低丰度细菌的存在，可能对成纤维细胞致纤维化功能产生重要影响。

本研究中，我们使用低丰度细菌刺激成纤维细胞后，发现纤维化相关因子比如VEGF、TGF-β1、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达增加。成纤维细胞产生胶原和分泌生长因子是其根本特征，细胞增殖、成纤维细胞肌化等细胞学事件与瘢痕组织中血管化和纤维化进程密切相关。在这些因素合力驱动下，瘢痕发生充血、增生挛缩等改变。而瘢痕局部形成的纤维化或起到“固定细菌”以防止感染扩散和对组织的破坏等生物学目的，因此细菌和纤维化之间可能存在着相互影响和相互制约的关系。

本研究中我们也发现：细菌刺激后，成纤维细胞分泌IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α等炎症因子增多。传统观念认为：分泌炎症因子是中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞的“专职”，而成纤维细胞产生炎症因子，提示成纤维细胞可能“兼职”炎症细胞的某些功能。近期研究^［10-11］发现，成纤维细胞这种炎症预警功能，与皮肤常驻免疫细胞少、成纤维细胞率先感受炎症信号有关，因而其可发挥“岗哨”细胞的作用。所以成纤维细胞不仅是创面修复细胞，也是炎症的“前哨”细胞，它以多种角色参与创面修复过程中的炎症和纤维化修复。据文献^［12-14］报道，IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α等炎症因子均可参与肝脏、肾脏等多种器官的纤维化病理过程。因此，细菌—炎症—纤维化过程可能是机体纤维化增生的核心病理环节和共性路径。

需要说明的是，体外实验中，在10⁴ CFU/mL浓度细菌作用下，成纤维细胞生长因子和炎症因子表达均下降，可能与细胞受到细菌和毒素的损害有关，细胞内线粒体等动力中心功能受损，生长因子和炎症因子表达下降。因此只有低丰度，即10³ CFU/mL或以下的细菌才能促进瘢痕增生。另外，高丰度的细菌可能导致细胞溶解、组织感染和创面破溃。临床上发现：瘢痕自发性感染，可能与细菌浓度突破阈值、细菌增殖扩散有关。

为了验证减少细菌载量对瘢痕增生的影响，我们在兔耳创面建立后，予创面添加细菌处理，待增生性瘢痕形成后，实验组在瘢痕组织中注射左氧氟沙星，对照组注射生理盐水。左氧氟沙星是一种广谱抗菌药物，对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、变形杆菌属等多种革兰阳性、阴性菌均具有抑制作用。一项针对前列腺纤维化的研究^［15］发现，采用左氧氟沙星治疗大肠埃希菌感染，结果逆转了前列腺的纤维化。本研究结果也发现：左氧氟沙星注射后，实验组瘢痕红色优先减退，瘢痕变平软，温哥华瘢痕量表评分明显降低。组织学进一步验证了瘢痕内细菌含量降低、炎症因子表达下降和胶原沉积变少。该结果证明：抗生素应用可以减少瘢痕形成，再次验证了细菌—炎症—纤维化这一主线存在于瘢痕增生中。

目前针对瘢痕内炎症，激素注射是临床常规治疗手段，且可获得快速、显著的效果，被作为增生性瘢痕的一线治疗^［16］。然而，激素虽然效果好，但容易复发，可能与细菌未被杀灭、炎症源头依然存在有关。一项关于博来霉素和曲安奈德的对照研究^［17］发现：在烧伤后增生性瘢痕内注射博来霉素，其疗效优于曲安奈德，可能与博来霉素是抗生素，对金黄色葡萄球菌等具有杀灭作用有关。

再者，化脓性汗腺炎是一种慢性皮肤病，与免疫异常、金黄色葡萄球菌超载有关，常导致增生性瘢痕形成^［18］。而外用抗生素是其重要治疗方法之一，如克林霉素凝胶、莫匹罗星软膏、夫西地酸乳膏等。特异性皮炎是一种免疫性疾病，也与金黄色葡萄球菌超载有关。目前，夫西地酸乳膏外用，已作为特异性皮炎的常规治疗手段^［19-20］。

综上，瘢痕细菌的存在，突破了我们对瘢痕形成机制的传统认知。本研究结果为瘢痕的细菌治疗提供了理论基础和动物实验依据，但仍缺乏临床对照研究予以验证，期待在后续的研究中进一步推进。