非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是一种常见的肺癌类型，约占所有肺癌病例的85％^［1］。在过去的几十年里，针对NSCLC的研究取得了显著进展，对其发病机制、诊断方法、治疗策略和预后因素都有了深入了解^［2］。通过T细胞受体（T-cell receptor，TCR）组库分析可以了解NSCLC免疫应答和免疫监视的特征，从而揭示T细胞克隆多样性、免疫应答的活性以及肿瘤逃逸机制^［3］，对于指导免疫治疗策略和预测患者预后具有重要意义。TCR组库分析可以评估肿瘤组织中T细胞克隆的多样性^［4］，以反映免疫系统对抗肿瘤的能力；高克隆多样性通常与较好的预后结果相关^［5］。同时，通过比较肿瘤组织和正常组织中的T细胞克隆组成，可以了解肿瘤免疫应答的活性程度，较高T细胞克隆丰度和活性可能意味着更强的抗肿瘤免疫应答^［6］。此外，TCR组库分析可以识别免疫治疗相关的T细胞克隆群体或特定TCR序列，以协助发展个体化的免疫治疗策略^［7］，筛选免疫反应较强的TCR用于患者治疗。

目前，免疫组库测序技术可以较完整地获取患者TCR组库多样性等信息，以促进NSCLC免疫治疗发展^［8］。免疫检查点抑制剂已成为NSCLC的主要治疗策略之一^［9］。这些抑制剂通过阻断肿瘤细胞与免疫细胞之间的抑制信号，恢复T细胞对肿瘤的免疫攻击能力。ROBERT等^［10］研究发现TCR组库多样性变化可预测免疫检查点疗法的有效性。此外，T细胞受体工程化T细胞（T cell receptor-engineered T cells，TCR-T）疗法^［11］、肿瘤疫苗^［12］等方法也逐步应用于NSCLC。ZHU等^［13］的研究将小鼠中特定TCR基因重定向至人类T细胞，并通过体外实验观察到该基因导入对肝癌细胞的杀伤作用，为TCR-T疗法提供了理论基础。本研究组已开发了iTCep^［14］，可用于预测给定抗原肽的TCR结合特异性，为肿瘤疫苗研发提供参考。

目前，已存在一些免疫组库分析工具（如MiXCR^［15］、Imonitor^［16］等），但能实现从原始TCR组库测序数据到下游组库特征分析以及结果可视化完整流程的软件工具还很欠缺。为此，本研究拟构建一套系统的TCR组库分析流程以探究肿瘤相关特征和发掘潜在肿瘤标志物，涵盖从原始数据到质控、过滤、TCR序列的识别和提取等上游分析部分，以及组库克隆分布、克隆分型、V-J基因共享性、互补决定区3（CDR3）分布特征以及克隆追踪等下游分析流程，并将其用于分析NSCLC患者的肿瘤相关特征。通过对免疫组库的深入研究和分析，可以更好地理解免疫系统的工作原理，为免疫治疗和药物研发提供有价值的信息，也为后续封装成软件包并提供网页工具打好前期基础。

从NCBI BioProject数据库获取NSCLC（PRJNA544699）和甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC；PRJNA664708）患者样本TCR测序数据集，用于流程方法测试及生物学特征案例分析和验证。其中，NSCLC数据集包括72例患者的220个肿瘤区域样本、64个匹配的非肿瘤肺组织样本和70个外周血单核细胞样本测序原始数据^［17］；共计包含704个样本，包括T细胞受体α链（T-cell receptor α chain，TRA）样本353例，T细胞受体β链（T-cell receptor β chain，TRB）样本351例。PTC数据集包括2例PTC患者肿瘤样本TCR测序数据^［18］。

使用SRA Toolkit工具将SRA格式原始数据转化为fastq格式文件，作为流程起始输入文件。通过FastQC质量检查，使用Trimmomatic程序去除接头序列、低质量序列、重复序列和低质量克隆，对数据进行过滤以提高数据的准确性。

基于MIXCR分析流程进行TCR序列比对。使用species参数设置物种为homo sapiens，使用receptor type参数设置数据类型为TCR，将质控后测序数据与MiXCR内置参考V、D、J和C基因片段数据库进行比对。

为方便下游分析，对前述分析结果进行重注释，筛选出cloneCount（clone数量）、cloneFraction（clone比例）、allVAlignments（V区基因比对）、allDAlignments（D区基因比对）、allJAlignments（J区基因比对）、nSeqCDR3（CDR3区核苷酸序列）、aaSeqCDR3（CDR3区氨基酸序列）、refPoints（序列比对参考位置）等结果。

使用Shannon-Wiener指数、Chao1指数以及Pielou均匀度计算TCR组库中的多样性（diversity）、丰富度（richness）与克隆性（clonality）。

免疫组库的多样性使用Shannon-Wiener 指数^［19］进行评估，该指数是反映免疫组库多样性的经典指标。计算公式如下：

其中，s表示物种数目，P_i 表示该物种个体数占总个体数的比例。

免疫组库的丰富度使用Chao1指数^［20］计算。Chao1指数是丰富度的非参数渐近估计量，计算中低频克隆性权重较高，能较大程度反映免疫组库克隆型丰富度。计算公式如下：

其中，S_obs 表示样本中观察到的克隆型数目，n1表示只有一条序列的克隆型数目（single tons），n2表示只有2条序列的克隆型数目（double tons）。

克隆性指的是一组具有相同或相似免疫受体，即源自同一克隆的免疫细胞。克隆性是反映免疫组库中高克隆型扩增程度的指标，可用于评估免疫系统中的克隆扩增情况和免疫应答的多样性。克隆性可用Pielou均匀度指数^［21］计算：

其中，P_i 表示该物种个体数占总个体数的比例。

为分析免疫组库克隆程度在不同组织间的表达差异，将肿瘤、癌旁和外周血组织根据克隆扩增数目分为低、中、高克隆型，克隆扩增数目区间分别为1~100、101~1 000和1 001及以上。此外，为分析不同年龄对免疫组库克隆分布的影响，将样本按年龄进行分组，其中64岁及以下为中年组（mid），65~79岁为老年组（old），80岁及以上为高龄老人组（eldest）。

克隆分布和克隆分型分析通过R语言（4.2.0版）计算，不同分组样本分布频率比较分析采用t检验， P<0.05表示差异有统计学意义。使用ggsignif包（0.6.4版）对P值进行布尔值转换，P≥0.05表示差异不显著，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异非常显著，P<0.001表示差异极显著。使用ggplot2包（3.4.2版）进行数据可视化。

V-J基因共享性即V、J基因各连接点的频率，可用于探索V、J基因间的关联性对其在不同组织间表达差异的影响。本研究选取P_i =0.001为频率阈值对V-J基因重要共享配对进行筛选，使用R语言（4.2.0版）进行数据处理，并使用circlize包（0.4.15版）进行可视化。在计算V-J基因共享性时，一般需考虑克隆扩增对其频率的影响。本研究为探究肿瘤低频克隆型对V-J基因共享性的影响，采用去克隆扩增权重的V-J基因共享性分析方法。此方法在进行频率计算前使用克隆分型替换克隆扩增数目，以去除克隆扩增权重的影响，能更好地反映低频克隆型的变化特征。

正常情况下，机体免疫组库中T细胞表现为多克隆状态，其CDR3呈均匀的高斯分布。疾病状态下，由于抗原的持续刺激，会导致某一类型的T细胞偏好扩增，从而引起CDR3分布特征的变化。因此，本研究使用VDJtools对免疫组库中TCR可变区基因V以及氨基酸克隆型丰度分布进行分析，以探究克隆型偏态分布与NSCLC的关系。

克隆追踪分析从输入的免疫组库中选择最丰富的克隆型，并对所有免疫组库进行批量追踪，可用于监测癌症免疫学中克隆型频率的变化。此外，以提供的核苷酸或氨基酸序列作为参数，可用于跟踪特定克隆型序列。使用immunarch包（0.67版）对数据进行克隆追踪分析，并使用ggplot2包（3.4.2版）进行数据可视化。

不同组间Shannon-Wiener指数均存在显著差异，其中外周血显著高于肿瘤和癌旁组织，肿瘤组织显著高于癌旁组织（图1A），提示NSCLC可能导致患者TCR组库多样性降低。丰富度上，外周血显著高于肿瘤和癌旁组织，肿瘤组织显著高于癌旁组织（图1B），结果与多样性分析契合，提示NSCLC同样会导致患者肿瘤及癌旁组织丰富度的降低。外周血的克隆性显著高于癌旁组织和肿瘤组织，而癌旁组织和肿瘤组织无显著差异（图1C），提示肿瘤及癌旁组织高克隆扩增程度较低，NSCLC可能通过外周血液形成免疫反应。

不同年龄分组及性别TCR组库的丰富度在TRA和TRB中观察到相似的结果。肿瘤组织中，中年组丰富度显著高于老年组（图1D），提示中年人群与老年人群相比，其TCR组库具备更强的肿瘤免疫潜力。此外，女性丰富度在外周血和肿瘤组织中显著高于男性（图1E），提示女性具有更强的肿瘤免疫潜力。

克隆分型分析结果显示：低克隆分型中，3组之间无显著差异；中克隆分型中，外周血显著低于癌旁和肿瘤组织；高克隆分型中，外周血显著高于癌旁和肿瘤组织（图1F）。该结果提示NSCLC可能引起患者外周血细胞高克隆，激活血液中相关分子的生物学功能，从而形成全局性免疫反应。

为探究V-J基因在不同组织间表达的差异，筛选4例NSCLC患者测序数据分析其TCRα链和β链上V、J基因各连接点的频率，以探索V、J基因共享性的影响。结果显示患者1癌旁组织中存在TRAV21和TRAJ53基因高度共享（图2A），外周血中存在TRBV6-5和TRBJ2-6高度共享（图2B）。同时，在患者2外周血中发现TRAV38-2DV8、TRAV13-2基因与TRAJ42基因的高度共享（图2C）。结果提示上述高共享性的V-J基因可能对NSCLC具有协同调控作用，且该调控可能存在多基因对单基因的协同作用。

在TCR双链中，患者1的TRAV21和患者2的TRBV20.1在肿瘤中高克隆扩增出现非正态分布（图3A、C），提示上述基因可能为NSCLC的潜在肿瘤标志物。此外，患者2肿瘤组织中还出现了TRAV2、TRAV34、TRAV13.2及TRAV24等多个基因片段的非正态高频分布（图3B），进一步验证了NSCLC免疫反应可能存在的多基因协同调控作用。

患者1外周血出现TRBV6.5的非正态高克隆扩增（图3D），提示NSCLC可能引起患者外周血细胞高克隆。进一步分析上述患者外周血高频克隆型CDR3分布，结果发现CASSYLIAGFPSGANVLTF的非正态高克隆扩增（图3E），提示该高频克隆型可作为NSCLC中免疫反应相关的抗原结合参考CDR3序列。

通过CDR3分布特征分析，发现了患者不同组织的高频扩增克隆型。为进一步探究这些高频克隆型在肿瘤发生过程中的动态变化，分别选取了TCRα链和TCRβ链中扩增程度最高的前10种与前12种克隆型进行克隆追踪分析。结果发现，CAATATDTGNQFYF、CIVRVGGGNQGGKLIF和CASSVEGQPTDTQYF在癌旁组织表达量较低，在肿瘤组织中表达量显著增加（图4），提示上述克隆型可作为潜在的NSCLC肿瘤相关抗原识别参考序列。CAVSLLNTDKLIF、CGAVDNQGGKLIF和CSVEWSTGRQETQYF在外周血中高表达，在癌旁和肿瘤组织中表达量显著降低；CAVRPYSGNTPLVF、CASSYLIAGFPSGANVLTF和CASSYSQRYTDTQYF在癌旁组织高表达，在肿瘤组织中的表达量显著降低（图4），提示NSCLC可能抑制上述克隆型的正常表达，进而影响相关生物学功能。CALSEAIKAAGNKLTF和CATSDPTGHQETQYF在癌旁组织几乎不表达，在肿瘤组织中表达量显著增加（图4），提示上述克隆型可作为潜在的NSCLC肿瘤新抗原识别参考序列。

克隆分布结果显示，与外周血相比，患者肿瘤与癌旁组织在多样性、丰富度以及克隆性上均呈显著低表达，提示肿瘤中可能存在较多低频克隆突变。为进一步探索肿瘤相关低频克隆突变，选取2例PTC样本进行去除克隆扩增权重的V-J基因共享性分析。结果发现，患者1与患者2原本表达较低的TRBJ2-5基因在去除克隆扩增权重后表达频率显著增加（图5），提示该基因可能作为肿瘤免疫反应中潜在的低频关键基因。

免疫组库的研究可以为免疫学、生物学、医学和药物研发等领域提供很多有价值的信息。免疫组库的分析可以揭示生物体在不同免疫状态下抗体的多样性和特征，包括抗体的结构、亲和力、特异性、功能等。这些信息可以帮助我们更好地理解免疫系统的工作原理，以及在疾病和免疫治疗中的应用。为此，本研究建立了一套系统免疫组库分析流程，包括从原始数据到质控、过滤、TCR及BCR序列识别与提取等上游分析部分到免疫组库多样性分析、基因扩增偏好、V-J基因共享性、CDR3长度分布等下游分析及数据可视化流程。

基于建立的免疫组库分析流程，本研究分析了一套NSCLC数据集，其中包含72例患者的220个肿瘤区域、64个匹配的非肿瘤肺组织样本和70个外周血单核细胞样本。结果发现，NSCLC肿瘤和癌旁组织中，TCR组库多样性、丰富度和克隆性降低。克隆分型分析中，外周血高克隆分型显著高于肿瘤和癌旁组织，提示NSCLC可能引起患者外周血细胞高克隆，激活血液中相关分子的生物学功能从而形成全局性的免疫反应。

已有研究表明，性别与健康有重要关系^［22-24］。性别能影响患者的常用药反应，包括一些抗生素^［22］；在较低血压下，女性心血管疾病风险较男性增大^［23］；死于新型冠状病毒肺炎的男性更多，而女性似乎更易受到一系列持续症状的影响^［24］。因此，本研究分析了癌旁组织、外周血和肿瘤组织样本在不同性别分组间TCR组库丰富度的差异，结果显示女性外周血和肿瘤组织中的丰富度显著高于男性，提示女性具有更强的肿瘤免疫潜力。

为探究V-J基因在不同组织间表达的差异，本研究从NSCLC的TCRα链和TCRβ链分别挑选了4例患者分析其V-J基因共享性。结果发现TRAV21和TRAJ53基因，TRAV38-2DV8、TRAV13-2和TRAJ42基因高度共享，提示这些高共享性的V-J基因可能对NSCLC具有协同调控作用。在CDR3长度分布特征分析中，我们发现了TRAV21和TRBV6.5的非正态高克隆扩增，提示TRAV21和TRBV6.5的高克隆扩增可能是由NSCLC引起的，即上述基因可作为NSCLC的潜在肿瘤标志物。在高频克隆型CDR3特征分布分析中，我们提取了10个TRA高频克隆型和12个TRB高频克隆型用于克隆追踪分析，并在克隆追踪分析中发现了潜在的NSCLC肿瘤相关抗原和新抗原结合CDR3参考序列。最后，为探索肿瘤相关低频基因，本研究选取2例PTC样本分析去除克隆扩增权重后克隆型间的V-J基因共享性，结果发现，患者1与患者2原本表达较低的TRBJ2-5基因在去除克隆扩增权重后表达频率显著增加，提示该基因可作为肿瘤免疫反应中潜在的低频关键调控基因。此外，已有研究^［25］发现乙型肝炎患者中同样存在TRBJ2-5基因的上调，进一步验证了本研究建立的TCR组库的可行性。

综上所述，本研究建立了一套系统的免疫组库分析流程，用于分析NSCLC的肿瘤相关特征，观察到NSCLC患者不同组织间克隆分布程度的差异和特定V-J基因的高共享性表达；随后，通过分析非正态克隆扩增的V基因和高频克隆型，发现了NSCLC潜在肿瘤标志物和抗原结合CDR3参考序列；最后，通过PTC患者去权VJ基因共享性分析发现了TRBJ2-5为潜在的低频关键调控基因。该免疫组库分析流程和肿瘤TCR组库特征分析方法还可以扩展到其他肿瘤和疾病。本研究组已建立流程预测病原体抗原蛋白序列中多肽疫苗候选表位^［26］。本研究流程可从适应性免疫系统特异性识别抗原肽的角度，通过预测高频CDR3序列为抗原表位识别工作提供免疫学参考，从而进一步评估T细胞表位被免疫细胞捕获并引发免疫应答的潜力。总体上，本流程可应用于如下场景：比较不同肿瘤或疾病间的TCR克隆型频率，发现潜在的广谱或特异的肿瘤标志物；分析结合特定抗原如肿瘤新抗原的CDR3结合序列特征，建立TCR-抗原识别预测模型；与其他组学数据如RNA-seq、单细胞测序数据联合，挖掘组学中的免疫组库特征，进行免疫学机制研究。