子痫前期（preeclampsia，PE）可影响妊娠结局，每年造成大量孕产妇死亡和胎儿围生期死亡。除了分娩，PE几乎没有其他治疗方式，但早产本身又容易影响胎儿健康状况^［1］。PE发生于妊娠20周后的孕妇，其症状包括高血压、蛋白尿等，与胎盘功能障碍有关^［2］，特别是子宫螺旋动脉中绒毛外滋养层细胞（extravillous trophoblast，EVT）侵袭和迁移不良，导致血管重塑缺陷和胎盘灌注不足^［3］。

EVT在胎盘植入过程中表现出高度的侵袭、迁移和增殖，这与癌症侵袭过程中观察到的病理效应相似^［4］。转移相关蛋白1（metastasis-associated protein 1，MTA1）在肿瘤中具有调控细胞侵袭和转移的作用，且与MTA1功能密切相关的因素如缺氧、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等均与PE病理发生过程有关。我们推测，内源性MTA1表达可能对胎盘滋养细胞的功能非常重要。本研究拟探讨MTA1在PE胎盘组织中的表达及其对其滋养层细胞功能的影响，以期为妊娠相关胎盘疾病的预防和治疗提供参考。

随机选取2015年3月—2017年9月在中国人民解放军空军军医大学第一附属（西京）医院产科住院分娩的PE孕妇20例（PE组），孕妇年龄22~34岁，平均年龄（31.4±3.5）岁，孕龄（33.4±2.3）周。以同期在该院分娩的健康妊娠孕妇35例作为对照组，孕妇年龄（29.3±4.1）岁，孕龄（39.1±0.6）周。纳入标准：月经周期规律，且具备明确的末次月经时间；经B超证实为宫内单胎妊娠；早孕B超符合停经天数；经剖宫产终止妊娠。排除标准：妊娠期糖尿病、肾病、原发性高血压、甲状腺疾病等，或存在不能用子痫前期解释的血、尿、生化指标异常。所有小鼠由中国人民解放军空军军医大学实验动物中心提供，动物生产许可证号为SCXK2019-001。

妊娠20周后出现收缩压≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和/或舒张压≥90 mmHg，合并以下任意一种不良情况诊断为PE。① 血压不断上升，收缩压≥160 mmHg和/或舒张压≥110 mmHg。② 24 h蛋白尿≥5.0 g，或随机尿蛋白≥（+++）。③ 视觉不良、持续性头痛或其他脑神经症状。④ 上腹持续疼痛，有肝破裂或肝包膜下血肿表现。⑤ 肝脏功能异常：谷丙转氨酶或谷草转氨酶水平上升。⑥ 肾功能异常：血肌酐（Scr）>106 μmol/L，或少尿（每小时尿量少于17 mL或24 h尿量少于400 mL）。⑦ 低蛋白血症合并腹腔积血（或胸腔积液）。⑧ 血液系统不良表现：血小板不断降低且<100×10⁹个/L，血清乳酸脱氢酶（LDH）上调，血管内溶血，黄疸或贫血。⑨ 肺水肿、心力衰竭。⑩ 胎儿生长受限或羊水过少。

孕妇胎盘娩出后避开钙化点，直视下在胎盘母体面中央距脐根2 cm处剪取全层的一小块绒毛组织5份，大小约2 cm×4 cm×1 cm，经生理盐水清洗干净后，放入固定液甲醛中（固定液的体积为胎盘组织的20倍），用于形态学检测；另取胎盘中央部位约1 cm×1 cm×1 cm大小的绒毛组织10份，经生理盐水清洗干净后，存入液氮罐中，用于蛋白质提取。将C57小鼠安乐死后，无菌解剖取出子宫，于冰上剥离胎盘，去除非胎盘组织。

HTR8/SVneo人早孕期胎盘滋养层细胞系获自中国科学院上海细胞生物学研究所。在37 ℃、5% CO₂、20% O₂湿润环境中，用含有10%胎牛血清（Corning，美国）和1%青霉素-链霉素溶液（碧云天，中国）的RPMI1640培养基（Thermo Fisher，美国）培养HTR8/SVneo。

在缺氧条件（37 ℃、5% CO₂、3% O₂）培养48 h，之后复氧，在常规条件（37 ℃、5% CO₂、20% O₂）下培养24 h。

将HTR8/SVneo细胞以1×10⁵个/孔的密度接种于24孔板，培养24 h。分为Scramble sh组与MTA1 sh组，将稀释好的siRNA和Lipofectamine 3000（Invitrogen，美国）轻轻混合均匀，室温孵育20 min以配制转染复合物。待细胞汇合度达到70%~90%后，弃掉旧培养基，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗后，加入新培养基，滴加转染试剂混和液至孔板内。“十”字法摇晃培养板数次，放入恒温培养箱继续培养6~8 h，更换为完全培养基；继续培养48 h，收取细胞，用于后续试验。

对临床获取的人胎盘组织、绒毛外植体、小鼠胎盘组织分别进行蛋白提取，样品经SDS-PAGE凝胶电泳后转移至PVDF膜，封闭后添加一抗MTA1（Abcam，英国），4 ℃孵育过夜。复温1 h，PBS洗涤5 min×3次，经二抗孵育和洗膜后使用ECL化学发光显色液显影，凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）拍照。以GAPDH作为内参蛋白。

对照组和PE组胎盘组织常规石蜡包埋切片、脱蜡、水合，用PBS洗涤，牛血清蛋白于37 ℃封闭1 h，滴加混合后的MTA1与CK-14（ab7800，Abcam，英国）一抗（1∶400稀释），用非免疫血清代替一抗作为阴性对照，4 ℃孵育过夜。第2日，PBS洗涤5 min×3次后，荧光山羊抗兔、山羊抗鼠二抗混合（1∶400稀释），37 ℃孵育1 h，PBS清洗后，含抗荧光淬灭剂的DAPI封片，激光共聚焦显微镜下拍照并采集图像。

HTR8/SVneo细胞分为Scramble sh组与MTA1 sh组，处理同前。在24孔板中，每孔接种6×10⁴个HTR8/SVneo细胞，待细胞汇合度达到70%~90%，进行转染操作。转染48 h后，用枪头在孔板底部垂直划线，并清洗1次，去除多余细胞。分别在正常培养前（0 h）、培养24 h后，使用倒置显微镜拍照，并通过ImageJ软件计算HTR8/SVneo细胞伤口愈合面积。

HTR8/SVneo细胞分为Scramble sh组与MTA1 sh组，处理同前。使用Transwell插入物（BD Biosciences，美国）进行体外细胞侵袭和迁移测定。Transwell插入物的底部由聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜制成，该膜具有直径8 μm的孔，允许细胞通过。用5 mg/mL基质胶（BD Biosciences，美国）涂覆用于细胞侵袭实验的Transwell插入物的PET膜。将Transwell插入物放入24孔细胞培养板中，将孔分离成上室和下腔。将细胞悬液接种入预处理的Transwell小室中。每组实验均在下室加入600 μL完全培养基，将Transwell小室在37 ℃、5% CO₂湿润的细胞培养箱中培养24 h；随后用PBS洗涤Transwell 小室3次，棉签拭去小室内多余细胞，将细胞在预冷的95%乙醇中固定10 min。用2 μg/mL DAPI（KPL，美国）对留在膜上侧的细胞染色2 min；室温下，用1 μg/mL碘化丙啶（Sigma-Aldrich，德国）对到达膜下侧的侵袭性细胞染色1 min。在倒置荧光显微镜下对细胞进行计数。为了消除负载误差等非特异性因素对Transwell测定结果的影响，将细胞侵袭能力定义为侵袭细胞数与非侵袭细胞数的比值，而不是仅计算膜底面的侵袭细胞数。实验重复3次。将处理过的样本的侵入能力标准化为相应对照的侵入能力。

用TRIzol提取细胞总RNA。使用SuperScript RT（Invitrogen，美国）试剂盒将所提RNA反转录为cDNA。将cDNA与PowerUp™ SYBR^® Green Master Mix（Thermo Fisher，美国）混合，进行定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）。MMP2（NM_008610.3）引物为5′-TTGGCGGACAGTGACACCAC-3′和5′-GGGGCCTCATACACAGCGTC-3′，产物大小为102 bp；MMP9（NM_013599.5）引物为5′-CCTTCA CCTTCGAGGGACGC-3′和5′-GCCGTGCTCCGTGT AGAGTC-3′，产物大小为146 bp。

早孕绒毛组织来自中国人民解放军空军军医大学第一附属（西京）医院妇产科。运输中全程置于冰冷的DMEM/F-12培养基中，并保证在2 h内完成组织处理。用无菌PBS清洗组织，将母体子宫内膜与胎膜剥离去除。剪刀剪取2~4 mm绒毛片段，置于预先包被Matrigel胶（Matrigel∶DMEM=1∶19）的12孔板中，轻轻按压以固定绒毛，37 ℃恒温孵箱中静置聚合30 min，再将孔板转移至37 ℃培养箱。培养4 h后取出孔板，小心加入1 mL完全培养基（含有20% PBS和1%青霉素-链霉素），尽量避免冲起绒毛。培养24 h后，选取含贴壁绒毛的孔进行MTA1 shRNA绒毛外植体转染，转染过程同前。8 h后常规换液，更换为完全培养基，转染24 h。MTA1 shRNA转染96 h后观察绒毛外植体存活和外延情况，用蛋白质免疫印迹法检测绒毛外植体中MTA1蛋白的表达。

从中国人民解放军空军军医大学基础医学院李伟副教授课题组获得Mta1^-/-小鼠（全身敲除）^［5-7］，C57/BL6背景，饲养于SPF级动物房内。剪取小鼠尾部末端组织，碱裂解法提取DNA；PCR扩增DNA片段。引物序列：F-AGGAGGAAGAGGAGGAGG AGAGTGAATATAGGTTA，R-GGCACCAGATCACA TAGTTGTG。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，重复35个循环；72 ℃延伸10 min；扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，通过条带分析小鼠基因型。筛选出Mta1^-/-小鼠。

将小鼠胎盘组织用4%的多聚甲醛固定过夜，梯度乙醇脱水、二甲苯透明后石蜡包埋，切片。石蜡切片于二甲苯与梯度乙醇复水，柠檬酸钠缓冲液（10 mmol/L，pH值6.0）中微波修复15 min，冷却至室温。PBS清洗后，于0.03%甲醇-0.3%过氧化氢中室温孵育30 min；PBS洗涤，血清封闭30 min；CD31（ab28364，Abcam，美国）一抗4 ℃过夜孵育，对照玻片用非免疫血清代替一抗孵育。次日，切片复温1 h，PBS清洗；二抗室温孵育3 h，PBS清洗；ABC复合物孵育1 h，PBS清洗，DAB显色；自来水冲洗切片，苏木精复染1 min。切片脱水、透明、封片，扫描成像。

以Mta1^-/-雌性小鼠为实验组，C57野生型雌性小鼠作为对照组（Mta1^+/+），每组各15只，均为8周龄。2组小鼠分别与生育力正常的8周龄C57野生型雄性小鼠合笼2周，记录每只雌性小鼠的产仔数。

使用GraphPad Prism 10软件进行统计分析。组间比较采用两样本t检验。所有实验至少重复3次。P<0.05表示差异有统计学意义。

蛋白质印迹法与免疫荧光结果均显示，MTA1在PE组胎盘中的表达水平明显低于对照组（图1A、B）。免疫荧光双重染色结果显示MTA1（绿色荧光）主要定位于滋养层细胞（CK-14，红色荧光）胞核（图1C）。

MTA1 shRNA转染后，蛋白质印迹法检测HTR8/SVneo滋养层细胞MTA1表达，结果显示，与 Scramble sh组相比，滋养层细胞MTA1的表达明显降低（图2A）。伤口愈合实验（图2B）显示，划伤后24 h，MTA1 sh组细胞迁移量明显低于Scramble sh组（P=0.002）；Transwell细胞体外侵袭实验（图2C）显示，MTA1 sh组细胞侵袭能力与Scramble sh组相比显著下降（P=0.015）；该结果提示MTA1能够促进滋养层细胞侵袭及迁移。将滋养层细胞在缺氧环境中培养后复氧，以模拟PE胎盘缺氧环境，进行qRT-PCR检测以明确MTA1对蛋白酶MMP-2、MMP-9表达的影响；结果（图2D）显示，低氧刺激下，与Scramble sh组相比，MTA1 sh组MMP-2和MMP-9的mRNA表达水平均降低（P=0.020，P=0.003）；提示低氧刺激诱导下MTA1对于促进MMP-2和MMP-9的表达有重要作用。

与Scramble shRNA转染组相比，MTA1 shRNA转染组绒毛组织中MTA1蛋白的表达水平显著降低（图3A）。对外植体进行整体绒毛外延检测，倒置显微镜下观察绒毛外植体的生长状态，结果显示，与Scramble shRNA转染组相比，MTA1 shRNA转染组外植体中EVT迁移的距离显著缩短（图3B、C），差异具有统计学意义（P=0.003）。

提取小鼠基因组DNA和胎盘组织蛋白进行基因型与蛋白鉴定。PCR结果显示野生型（Mta1^+/+）小鼠目的片段产物约在800 bp，杂合子（Mta1^+/-）小鼠目的片段在800 bp和408 bp位置呈现2个条带，而纯合子（Mta1^-/-）小鼠目的条带约在400 bp（图4A）。蛋白质印迹法结果显示，纯合子小鼠胎盘组织中无MTA1表达，证实其被成功敲除（图4B）。

通过血管内皮标志物CD31的表达量分析胎盘血管生成过程。免疫组织化学结果表明（图4C），MTA1^-/-组小鼠的CD31⁺微血管密度显著低于对照组（P=0.004），MTA1^-/-组小鼠胎盘血管生成受到损害。

生育力测试结果显示，Mta1^+/+组小鼠产仔数分别为7、8、8、8、8、9、9、9、9、10、10、10、10、12、12只；MTA1^-/-组小鼠产仔数分别为0、0、2、2、3、3、4、4、5、5、6、6、7、7、8只。与对照组相比，Mta1^-/-雌鼠产仔数显著降低（P=0.000）。

目前，主流理论认为胎盘发育异常是引起PE的主要原因^［8-9］。在人类早期妊娠期间，EVT侵入子宫壁并完成螺旋动脉的重塑。如果滋养层细胞入侵失败或血管上皮缺失，将导致子宫螺旋动脉重塑不足，胎盘血供显著减少，进而导致胎盘缺血和氧化应激，引发PE。血管生成因子的异常释放，进一步改变胎盘血管体积密度。氧梯度在诱导滋养层细胞迁移、增殖和分化中发挥重要作用，因此胎盘快速生长期存在低氧环境。

MTA1在人滋养层细胞中表达水平较高，揭示了MTA1在正常人滋养层细胞中具有潜在作用^［10］。MTA1是一个与肿瘤发生和发展相关的转录调节因子^［11-12］，文献报道主要集中在其调控多种人类肿瘤细胞的侵袭和转移方面^［13-14］。蛋白质印迹法结果显示，MTA1在PE患者胎盘中表达异常降低。免疫荧光双重染色结果显示MTA1主要定位于滋养层细胞胞核。考虑到胎盘滋养细胞作为胎盘侵袭、浸润和子宫血管重塑的执行细胞，其侵袭活性和功能的异常是导致胎盘发育障碍的根本原因，而与MTA1功能密切相关的因素（缺氧、MMP表达降低等）均与PE病理发生过程有关。我们推测，内源性MTA1表达可能对胎盘滋养细胞的功能非常重要。

EVT中MMP的异常表达与先兆子痫有关^［15］。滋养层细胞侵袭过程涉及MMP介导细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的降解^［16-17］。MMP在生理和病理生理过程中对胎盘发育、炎症、血管生成、肿瘤侵袭和转移等均具有重要意义^［18］。Akt/MMP-9信号通路是乳腺癌细胞侵袭和迁移的关键信号通路^［19］。MTA1是第一个发现的转移相关基因（MTA）家族成员，在乳腺癌侵袭和转移过程中是癌症进展相关基因^［20］。同样，MMP-2也与肿瘤细胞的增殖与侵袭转移作用机制关联密切^［21］。滋养细胞分泌的MMP-2为酶解子宫内膜外基质与基底膜的重要调控因子，有利于滋养细胞侵入子宫内膜，是妊娠早期调控滋养细胞浸润的关键酶^［22］。MMP-2低表达与子痫前期发生高度相关，使滋养细胞的浸润能力下调，子宫螺旋动脉重铸不足^［23］。MMP-2是准确的PE预测生物标志物^［24］。本研究将滋养层细胞在缺氧环境中培养后复氧，模拟胎盘的缺氧环境，结果显示稳定敲低MTA1的人绒毛膜滋养层细胞HTR8/SVneo在低氧刺激诱导下，MMP-2、MMP-9表达水平显著降低。该结果提示了MTA1在滋养细胞浸润子宫内膜方面具有重要作用。

早孕绒毛外植体培养最大程度上维持了组织结构的完整性，通常用来研究多种生物学功能，包括细胞增殖、凋亡、迁移以及侵袭等^［25］。对绒毛外植体进行反义寡核苷酸或者人源重组活性因子的干预，可探究某个基因或外源性因子对外植体存活和功能的影响。为进一步证实MTA1对滋养细胞迁移能力的影响，本研究使用了早孕绒毛外植体培养模型，以便更好地模拟胎盘早期发育中滋养细胞的分化过程。MTA1 shRNA转染绒毛外植体，培养至96 h，采用蛋白质印迹法检测绒毛外植体中MTA1蛋白的表达；结果显示，与Scramble shRNA组相比，MTA1 shRNA可显著降低绒毛组织中MTA1蛋白的表达水平。MTA1 shRNA转染96 h后，对外植体进行整体绒毛外延检测；结果显示，与Scramble shRNA转染组相比，MTA1 shRNA显著降低了外植体中EVT迁移的距离。结合MTA1表达定位结果，我们推测MTA1可能参与了早孕期EVT的分化过程。

PE发生涉及多种细胞的相互作用，是一个异常复杂的病理变化过程^［26］。血管生成标志物能准确诊断PE，并具有较高的阴性预测值，可能有助于排除PE^［27-30］。为了进一步在体内水平确定MTA1的作用性质，本研究使用Mta1^-/-小鼠进行不同基因型小鼠胎盘组织内MTA1蛋白表达情况和胎盘血管形成检测。表型分析结果显示，Mta1^-/-雌鼠胎盘血管形成明显弱于野生型雌鼠，且Mta1^-/-雌鼠产仔率显著降低。结合MTA1在血管发生、肿瘤细胞侵袭和浸润中的作用特点，我们推测内源性MTA1可能通过影响滋养细胞浸润子宫内膜及绒毛毛细血管重塑过程参与PE的发病机制，具体机制有待阐明。

综上所述，MTA1在胎盘发育和先兆子痫发病机制中发挥重要作用，可通过调节滋养细胞迁移和血管重塑影响胎盘功能。MTA1作为PE潜在的治疗靶点，其具体作用机制需要进一步研究。