丝氨酸蛋白酶是最古老和最大的蛋白水解酶家族，其命名是由酶活性位点中的亲核丝氨酸残基决定的，该残基攻击底物肽键的羰基，形成酰基中间体^［1］。蛋白底物水解的完成依赖于蛋白酶三级结构中组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸残基组成的催化三元体，通常被称为电荷转移系统^［1-2］。在所有已知的蛋白水解酶中，超过1/3是丝氨酸蛋白酶。混合亲核体蛋白酶超家族A（PA族）、S1亚家族的丝氨酸蛋白酶占已知蛋白酶总量的20%以上，包括胰蛋白酶 、凝乳蛋白酶和凝血酶等以可溶性分泌蛋白的形式产生的蛋白酶，以及通过羧基端跨膜结构域（Ⅰ型）、具有胞质延伸的氨基端跨膜结构域（Ⅱ型）或羧基端糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）连接将丝氨酸蛋白酶催化结构域直接锚定在质膜上的膜锚定丝氨酸蛋白酶^［3］。它们广泛表达于各类组织器官与体液中，在哺乳动物生长发育的许多方面发挥重要而广泛的作用，包括免疫、凝血、溶栓、生殖、分化等过程^［4-6］。在生理条件下，所有丝氨酸蛋白酶都是以单链非活性前体酶或酶原形式被合成，其N端延伸为前肽，需要蛋白酶水解特定的Arg¹⁵-Ile¹⁶位点（按Bovine Chymotrypsin A序列编号）才能产生有活性的酶。

据报道，多种膜锚定丝氨酸蛋白酶的胞外结构域可从细胞表面靶向释放或脱落，提示这些酶可能有助于细胞外液的蛋白水解活动。GPI锚定的丝氨酸蛋白酶通过其独特的GPI-锚被分隔在富含胆固醇的膜微域或脂质筏的动态微环境中^［7-8］，并可被磷脂酶水解，导致蛋白质释放到细胞外空间。例如，前列腺素（prostasin）通过内源性GPI特异性磷脂酶D1裂解其GPI-锚进而从肾皮质集合管（M-1）细胞顶端释放^［7］。目前，还未发现GPI锚定的睾丸素（testisin）以可溶性脱落形式出现，但可通过添加外源性细菌磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（PI-PLC）将testisin从细胞膜上释放出来^［8］。在体内可检测到Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶多种自发脱落的可溶性片段，如matripase、TMPRSS2和肠肽酶等。

testisin最初被认为是一种与前列腺素相关的睾丸特异性蛋白，其在睾丸癌中不表达^［9］。在卵巢癌细胞培养模型中，睾丸素下调可促进细胞凋亡并减少集落形成；而在异种移植小鼠模型中，睾丸素过表达可诱发更大的原发性卵巢肿瘤^［10］。在培养的宫颈癌细胞中，睾丸素与蛋白酶抑制剂maspin（一种肿瘤抑制因子）相互作用并使其失活，从而促进细胞生长，增强其侵袭性和化疗抗性^［11］。此外，testisin可能有助于血管生成^［12］。研究^［13］发现，testisin能够裂解蛋白酶激活受体-2（protease activated receptor -2，PAR-2），导致PAR-2的内化和细胞转导信号丢失，揭示了细胞表面PAR-2调节的一种新模式。此外，对testisin在毛细血管内皮细胞中的功能研究^［14］表明，活化的testisin是血管生成过程中血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）粘连的一种新的调节因子。这提示testisin可作为调节新生血管完整性和相关病理过程的一个潜在的新靶点。

相较于凝血酶、胰蛋白酶和基质酶等这些研究较为透彻的丝氨酸蛋白酶，目前我们对testisin活性调控机制的了解还非常有限。因此，本研究采用生物化学和酶动力学等手段，探索testisin的活性调控途径，为进一步了解其正常生理功能奠定基础。

鼠源testisin（简称mTN）的cDNA（46~298 aa）编码序列的合成和分析由Genewiz公司（中国上海）完成。凝血酶的显色底物S2238（H-D-Phe-Pip-Arg-pNA-2HCl）由BankPeptide公司（中国合肥）合成。蛋白纯化柱购自GE Healthcare公司（美国）。预制4%~20% SDS-PAGE凝胶购自GenScript（中国南京）。其他试剂均为分析级。

人胚胎肾脏细胞（HEK293S）在Freestyle-293培养基（元培生物，中国）中培养，并在二氧化碳细胞培养摇床（永联生物，中国）中悬浮培养（37 ℃，5% CO₂）^［4］。

mTN的cDNA进行全基因合成并克隆到哺乳动物表达载体pKN中，在mTN的C-端尾部添加6×His标签。质粒瞬时转染至HEK293S真核表达系统中进行表达^［15］。将聚乙烯亚胺（polyethylenimine L，PEI）（Polyscience，24765-1，美国）和mTN的表达质粒（PEI∶DNA=6∶1）混合后转染密度为3.6×10⁶个/mL的HEK293S悬浮细胞；其中，PEI的浓度为6 mg/mL，mTN表达质粒的浓度为1 mg/mL，各取1 mL。5 d后离心收集培养液，上清液经Ni柱（GE Healthcare）纯化。含有mTN的组分经浓缩管（30 000 MWCO，Millipore，美国）浓缩至浓度大于5 mg/mL，在-80 ℃下保存。

样品经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，用Bio-Rad（美国）半干转膜仪将蛋白转移至硝酸纤维素（NC）膜（恒压25 V，10 min），常温下脱脂牛奶封闭1 h后，孵育辣根过氧化物酶（HRP）偶联的His标签抗体1~2 h。用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2次，每次5 min。采用Bio-Rad LAS4000显影仪显影。

所有mTN突变体都通过KOD Plus诱变试剂盒（TOYOBO，中国上海）进行PCR诱变构建。将酶原激活位点Arg⁴⁶进行点突变，得到R46A突变体；将酶原催化三元体活性中心位点Ser²⁴⁰进行点突变，得到S240A突变体。将序列K²¹¹KPDFR²¹⁶置换为AAPDFA（即K211A、K212A、R216A），得到3A突变体；将序列K²¹¹KPDFR²¹⁶置换为GGA，得到GGA突变体。

凝血酶发色底物S2238是一种化学合成的小肽，其一端为发色基团（pNA）。丝氨酸蛋白酶如凝血酶，可将pNA催化解离下来，而游离的pNA在405 nm有光吸收，可通过酶标仪检测405 nm的吸光度值D（405 nm）来反映其催化活性。因为mTN也可以分解S2238，所以通过检测D（405 nm）的变化测量mTN的活性。

嗜热菌蛋白酶（thermolysin）是由革兰阳性菌Bacillus thermoproteolyticus分泌的耐热的中性金属蛋白酶，在体外可以有效切割丝氨酸蛋白酶的激活位点（Arg-Ile）而激活该酶^［16］。将100 μg的mTN酶原和100 ng嗜热菌蛋白酶混匀后，在37 ℃的条件下分别保温1、10、30 min，测定D（405 nm）以检测激活效果。取相同浓度的mTN酶原、R46A突变体和S240A突变体，放置于20 ℃的条件下，每隔24 h检测1次蛋白活性，共检测5次。

将相同浓度的mTN酶原置于5组孵育条件下（表1），每隔24 h，取等量的mTN稀释到底物S2238溶液中，测定D（405 nm），检测mTN的活化程度。

取相同浓度的mTN酶原、3A突变体和GGA突变体，放置于20 ℃的条件下，每隔24 h检测1次蛋白活性，共检测5次。

将底物S2238分别溶解于pH值3.0~11.0的缓冲液中，加入等量的mTN并测定D（405 nm）以确定TN的最适反应pH。将mTN分别置换到pH值3.0~11.0的缓冲液中，室温放置2 h后测定酶的残余活性以确定mTN的pH稳定性。将底物S2238分别在4、16、25、37、50、65、80 ℃水浴中预热后，加入等量的mTN，测定D（405 nm）的变化情况以确定mTN的最适反应温度。将mTN分别置于4、16、25、37、50、65、80 ℃的条件下，水浴2 h后测定酶的残余活性以确定mTN的热稳定性。Zn²⁺、Ca²⁺和Na⁺可以作为调节元件与丝氨酸蛋白酶相结合，并调控其活性^［17］。将mTN分别置换到含有0、0.1、1、5、10 mmol/L的ZnCl₂、CaCl₂ 和0.1、0.2、1、2、4 mol/L NaCl的缓冲液中，测定酶的残余活性以确定不同金属离子对mTN活性的影响。

Edman降解法测序是通过化学反应依次切下蛋白质N-端的每一个氨基酸，再使用HPLC液相色谱分别鉴定切下的氨基酸，得到的氨基酸信息排序结果即为蛋白质N-端的序列。对mTN降解的轻链短肽（C-端片段）采用Edman降解法鉴定前5个氨基酸，将鉴定的氨基酸与蛋白序列进行比对，即可得到蛋白的自剪切位点。

为了明确mTN的结构特点并更直观地阐明其活性调控机制，将蛋白的氨基酸序列（46~298 aa）输入Alphafold 2蛋白质三维结构预测模型，即可得到预测的mTN酶原三维空间结构。

将mTN表达质粒转入HEK 293S细胞进行表达，经Ni柱纯化后，从含有mTN的表达培养液中获得纯度较高的蛋白样品，约为1.5 mg/L。SDS-PAGE胶图显示其条带位置对应于55 000，高于其理论相对分子质量（约为35 000）。这可能是由于真核表达系统中蛋白被糖基化修饰，故纯化的复合物相对分子质量大于理论值（图1A）。

嗜热菌蛋白酶可以有效切割丝氨酸蛋白酶的Arg⁴⁶-Ile肽键从而激活该酶。酶活性检测结果显示，mTN 激活10 min和30 min后，其水解S2238底物的蛋白酶活性相似，达到最大。结合SDS-PAGE结果，活化后的mTN和mTN酶原相对分子质量相差不大，在条带上区分并不明显；但激活30 min后可以观察到mTN的两个降解片段，分别对应40 000和15 000两个条带。用Q阴离子交换层析柱进一步纯化从Ni柱获得的mTN时，也观察到mTN的降解现象（图1B），且降解后的mTN同样具有水解S2238的蛋白酶活性。排除外源蛋白酶污染的可能性后，推测mTN在纯化过程中可能发生了自激活和自剪切。

mTN酶原、酶原激活位点突变体R46A和催化三元体活性中心位点突变体S240A孵育后的酶活性检测结果（图1C、D）显示：随着时间的延长，mTN酶原逐渐开始形成有活性的酶，而R46A突变体和S240A突变体的活性均未增加。结合Western blotting结果，mTN酶活性增加的同时产生了C-末端降解条带，而2个突变体在体外保温的过程中其相对分子质量均未发生明显变化。其自剪切位点没有被切割，说明该位点的切割依赖于testisin激活位点的活化和完整的活性中心，而不是潜在的纯化过程中引入其他的蛋白酶。该结果提示mTN酶原可以在体外发生自激活，且自剪切是在酶原激活后发生的。

丝氨酸蛋白酶原的激活速率受酸碱度、温度等多种因素影响。酶活性检测及Western blotting结果发现：mTN酶原的自激活是一种级联放大反应，蛋白浓度越高，激活速率越快（图2A、B）。在酸性条件下（pH值6.0），mTN酶原可以稳定保存5 d（图2A、C）。高盐条件能够延缓酶原的自激活（图2A、D）。当温度升高后，mTN酶原会快速发生自激活；但随着时间的延长，蛋白活性下降并发生降解（图2A、E）。

Edman降解法N-端测序结果显示，mTN自剪切的轻链短肽N-端的前5个氨基酸为Gly/His-Gly/Asn-Gly/Ile-Trp-Gly（图3A）。通过与mTN氨基酸序列进行比对（图3B），显示降解位点在重组蛋白的211~216 aa之间，即K²¹¹KPDFR²¹⁶。

mTN酶原、3A和GGA突变体孵育后的酶活性检测结果显示（图3C、D），GGA突变体能够发生自激活，且不再产生剪切条带；而3A突变体不能发生自激活。以上实验结果提示，mTN酶原在体外的剪切位点为211~216 aa。

mTN酶原经Alphafold 2预测得到的三维空间结构模型与其他丝氨酸蛋白酶结构非常类似（图3E）。当蛋白活化后，mTN N-端I⁴⁷被释放，插入2个结构域之间的缝隙中，并引起激活域构象的变化。二硫键（黑色箭头指示，球状结构）拉近空间结构使分布在2个结构域上的活性中心位点在空间上靠近，形成催化结构域。3个标黄的棍棒结构展示的是活性中心三联体（H⁸⁶-D¹³⁹-S²⁴⁰）。结构中K²¹¹KPDFR²¹⁶即170/175肽环（按Bovine chymotrypsin A序列编号）暴露在分子表面，这与其容易被切割发生自剪切相吻合。另外，发生自剪切后，2段多肽仍以二硫键相连（蓝色箭头指示，球状结构），不影响蛋白整体的空间结构，因此降解后并不影响mTN的酶活性。

吸光度检测结果显示：mTN的最适pH值为8.0，在7.5~9.0的pH值范围内酶活性大于70%；当pH值≤6.0时，酶活性接近于0。可能是由于在酸性条件下，蛋白活性中心位点的丝氨酸残基质子化，无法发挥水解活性（图4A）。

吸光度检测结果显示，当pH为7.5~8.0时，蛋白酶活性保持在95%~100%（图4B）。

吸光度检测结果显示：随着温度升高，酶反应速率加快，在50 ℃时酶活性达到最大值；但温度继续升高，酶活性下降（图4C）。

吸光度检测结果显示：蛋白在30 ℃以下稳定性较好；但在37 ℃以上温度下，其稳定性迅速下降；当温度高于60 ℃时，蛋白活性完全丧失（图4D）。

测试结果显示，Zn²⁺和Ca²⁺均对testisin的活性产生抑制作用。5 mmol/L的Zn²⁺可使蛋白酶活性完全丧失。5 mmol/L Ca²⁺使酶活性下降到25%左右；但再提高Ca²⁺的浓度，对酶的抑制作用无显著增强（图4E）。Na⁺对testisin的活性无明显调节作用（图4F）。

人体中约有20种膜锚定丝氨酸蛋白酶。多种膜锚定丝氨酸蛋白酶的胞外结构域可从细胞表面靶向释放或脱落，并在生理功能以及在蛋白酶介导的癌症信号转导中起着重要作用。例如，纤溶酶原以大约150 μg/mL的浓度存在于血浆中^［18］。当纤溶启动后，2种纤溶酶原激活剂（tPA和uPA）将使其活化，并且纤溶酶也将以自身为激活剂产生正向反馈，使纤溶酶加速产生，促进血栓的溶解^［19］。hepsin可以激活凝血级联反应中的几种蛋白酶，可能在前列腺癌中发挥特殊作用^［20］。corin在心脏和子宫中表达，调节盐分水平和血压，其基因突变会导致先兆子痫^［21］。Matriptase对表皮屏障功能的维持有重要作用，在乳腺上皮细胞系、胸腺上皮细胞系和极化肠上皮细胞系的条件培养基中均可发现其可溶片段^［22-24］。TMPRSS2常见于精液并在前列腺管腔内积聚；在雄性激素刺激的LNCaP细胞中，自活化的TMPRSS2通过自切割将其胞外结构域从膜上释放出来^［25-26］。本研究中的testisin被认为是一种与prostasin相关的睾丸特异性蛋白，与精子的生成、成熟和血管生成密切相关^［12］，并且可以促进卵巢癌、宫颈癌等肿瘤的发生、侵袭和转移^［10-11］。以上这几种膜锚定蛋白酶的表达失调均与致癌作用相关，并且这些酶的内源性抑制剂含量升高将导致患者预后不良^［27］。此外，这些蛋白酶既可以作为细胞外基质蛋白降解酶，也可以通过水解生长因子和蛋白酶激活受体（尤其是PAR-2）介导致癌作用^［28］。因此，膜锚定丝氨酸蛋白酶的表达调节对维持正常稳态的重要性，以及这些酶与癌症和其他疾病之间的密切关系表明这些酶在正常环境中受到严格的调控。

在对丝氨酸蛋白酶的体外研究中，无论是分泌型丝氨酸蛋白酶，还是膜锚定型丝氨酸蛋白酶，通常是通过构建蛋白酶结构域片段进行相应的研究。在本研究中，我们通过在体外对mTN的蛋白酶结构域进行真核表达与纯化，获得了高纯度、均一性良好的目的蛋白，并验证了mTN酶原可以发生自激活，且酸性条件下酶原稳定存在。这提示了在生理条件下，mTN可能是在分泌到膜表面后才通过自激活的方式获得活性。相比凝血系统中多种丝氨酸蛋白酶都需要特定的上游蛋白酶来激活，mTN的激活调控显得更加灵活。在生物体内，细胞需要应对各种复杂多变的环境条件，包括营养物质的变化、激素水平的波动以及外界刺激等。自激活机制使得mTN能够在这些条件下迅速响应，调整其活性水平，以满足细胞代谢和生理功能的需要。

此外，本研究发现，活化后mTN于170/175肽环处发生降解，此机制或许是为了调节蛋白酶与底物的相互作用。170/175肽环位于活性部位的边缘，在大多数情况下，这个相对较短的肽环作用可能会被忽略。在HtrA1中，此肽环被鉴定为变构激活传感器^［29］。对于fⅨa来说，fⅧa在175肽环的结合能打开Tyr177的“锁定”，能够影响附近的99肽环，并允许底物结合。此外，在凝血酶原中，175肽环是fⅩa和fV催化结构域的主要接触区^［30］。对fⅩa和Trypsin环嵌合体的研究发现：175肽环赋予了99肽环和189/191肽环变构相互作用的可塑性^［31］。这些结果提示了mTN 170/175肽环可能在蛋白构象和活性调节中起着某些尚未发现的作用，有待进一步的研究。

对蛋白的活性进行研究，可知活化mTN的最适pH值为8.0，且在其最适pH值附近较为稳定。此外，Zn²⁺和Ca²⁺对mTN的活性有明显的抑制作用，可能是通过结合在75肽环上的一些氨基酸残基（如His⁷¹、Glu⁷⁴）来抑制酶活性。另外，我们推测使用Q离子交换柱纯化mTN时，在中性pH值下，低盐浓度和局部高浓度mTN酶原的富集促进了mTN的自激活和后续自剪切，这也提示在细胞表面局部mTN的富集也有利于其自活化的发生。

综上，本研究提供了一种高效制备重组mTN酶原的方法，阐述了其发生自激活和自剪切的分子机制，揭示了testisin参与机体正常生命活动的潜在调控方式，为进一步研究testisin在生物体内的生理功能奠定了基础。