肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）是最常见的遗传性心血管疾病，发病率高达1/200^［1］；该疾病是一种由编码肌小节相关蛋白的基因发生突变导致的以心肌肥厚为特征的心肌病^［2］。心肌细胞紊乱、心肌纤维化增加是HCM关键的组织病理学标志，且这些标志可诱发心脏功能受损、左心室流出道梗阻和心律失常，并能够导致严重的心脏并发症^［3］。HCM是一种肌小节蛋白疾病，遗传学研究显示40%~60%的HCM患者存在多个单独的肌小节蛋白基因致病性变异^［4］。在这些基因检测阳性的患者中，大多数致病变异发生在肌球蛋白重链7（myosin heavy chain 7，Myh7）和肌球蛋白结合蛋白C3（myosin binding protein C 3，Mybpc3）上。而在5%~10%的HCM病例中，该疾病是由与神经肌肉疾病（如弗里德赖希共济失调）、代谢疾病（如Barth综合征）或遗传综合征（如努南综合征）相关的非肌小节基因突变引起^［5］。近年来，在对心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的研究中发现，患有高血压^［6］、动脉粥样硬化^［7］和心力衰竭^［8］的患者群体均存在肠道菌群失调的现象。同时，越来越多的证据表明，因肠道菌群失调造成的其代谢产物的累积不仅会加重CVD的病情还会加速CVD的进展^［9］。在诸多肠道菌群代谢产物中，氧化三甲胺（trimethylamine oxide，TMAO）作为通过“肠-心”轴参与CVD进程的热点标志物，在循环系统中的水平与CVD患病率相关，也是心血管不良事件的一个新的独立危险因素^［10］。

目前，有关TMAO在心力衰竭、糖尿病心肌病、动脉粥样硬化等CVD中的作用已被明确，如相关研究^［11］指出，TMAO在主动脉弓缩窄（transverse aortic constriction，TAC）大鼠模型中可加重心肌肥厚，在糖尿病心肌病中可通过炎症介质的累积引起心室重构。而其在HCM中的发病机制与上述疾病有着较本质的区别，且鲜有研究进行具体阐述。基于此，本文使用与人Myh7同源的HCM小鼠［即Myh6 c.1211G>A（p.R404Q^+/-）点突变小鼠］模型，从Ca²⁺调节相关蛋白的角度对TMAO在HCM进程中产生的作用进行探讨，以期阐述TMAO的潜在作用机制，从而为改善HCM患者心功能受损症状提供新的辅助治疗策略。

本研究使用的HCM小鼠为Myh6 c.1211G>A（p.R404Q^+/-）点突变雄性杂合子小鼠（Myh6 R404Q^+/-）^［12］，对照组为同窝雄性野生型（wild type，WT）小鼠。4月龄的Myh6 R404Q^+/-小鼠（24只，体质量25~30 g）、WT小鼠（12只，体质量25~30 g）均购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，动物生产许可证号为SCXK（苏）2023-0009。所有小鼠饲养于上海交通大学医学院附属第一人民医院实验动物中心（SPF级），室温（20±5）℃、湿度40%~70%，在非定向气流笼中保持12h/12h的明暗循环。动物使用许可证号为SYXK（沪）2019-0028。

TMAO试剂、TMAO抑制剂——碘甲基胆碱（iodomethylcholine，IMC）购自美国Sigma-Aldrich公司，小鼠TMAO试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，异氟醚购自上海吉至生化科技有限公司，苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin staining，HE staining，HE染色）试剂盒、马松（Masson）染色试剂盒购自珠海贝索生物技术有限公司，兰尼碱受体2（ryanodine receptor 2，RyR2）抗体、RyR2色氨酸2808位点磷酸化［p-RyR2（S2808）］抗体购自美国Invitrogen公司，GAPDH抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）标记的抗兔免疫球蛋白G（illunoglobulin G，IgG）购自美国Cell Signaling公司，蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）活性测定试剂盒购自英国Abcam公司。

酶标仪购自瑞士TECAN公司，动物彩色多普勒超声成像仪购自美国Sigma公司，病理切片扫描仪购自日本Hamamatsu公司，化学发光成像仪购自美国Bio-Rad公司。

分别采用常规饲料、添加了0.12% TMAO的饲料、添加了0.06% IMC的饲料饲养HCM小鼠和WT小鼠，为期8个月。根据饲料成分的不同将该2类小鼠进行分组：① WT组（6只），常规饲料喂养的WT小鼠。② HCM组（12只），常规饲料喂养的Myh6 R404Q^+/-小鼠；而后再将其随机分为HCM-1组和HCM-2组（每组6只），用于不同组别的比较。③ WT+TMAO组（6只），常规饲料中添加0.12% TMAO喂养的WT小鼠。④ HCM+TMAO组（6只），常规饲料中添加0.12% TMAO喂养的Myh6 R404Q^+/-小鼠。⑤ HCM+IMC组（6只），在常规饲料中添加0.06% IMC喂养的Myh6 R404Q^+/-小鼠。

于4、8、12月龄时，采用超声心动图分别对WT组、HCM-1组、WT+TMAO组、HCM+TMAO组小鼠心脏的左心室舒张末期内径、左心室收缩末期内径及左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness，LVPW）进行评估，同时于12月龄时对HCM-2组和HCM+IMC组小鼠进行同样的评估。具体操作如下。

使用5%异氟醚诱导小鼠麻醉，而后脱去小鼠胸毛，再使用0.5%异氟醚维持麻醉，并使小鼠的心率维持在400~500次/min。将小鼠置于37 ℃加热板上，选择空间分辨率为30 μm的40 MHz超声探头进行操作。在探头上涂抹适量的凝胶，置于小鼠胸骨左缘，调整探头的角度和位置，使超声仪能够清晰显示心脏二维图像。通过超声心动图记录，分别测量小鼠心脏左心室舒张末期内径、左心室收缩末期内径及LVPW，并计算左心室短轴缩短（left ventricular fraction shortening，FS）率，公式为：FS率=（左心室舒张末期内径-左心室收缩末期内径）/左心室舒张末期内径×100%。上述数据均由每只小鼠的3次心动周期的平均值获得。

小鼠在12月龄完成了超声心动图评估后全部被处死，收集其血清样本和心肌组织标本。具体操作如下：将处死后的小鼠固定在取材板上，剪开胸前皮肤和肋骨，暴露胸腔后沿主动脉根部剪下心脏并迅速置入冰浴的PBS溶液中，轻轻挤去多余血液，沿冠状轴将心脏切成两部分。一半置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，用于后续制作病理组织切片；另一半置于液氮冷冻并于-80 °C冰箱中保存，用于提取心肌组织蛋白。同时，接取主动脉断端血液，待其凝固后放入离心机，14 000×g离心15 min，收集上层淡黄色血清，以备后用。

使用小鼠TMAO试剂盒对HCM-1和WT组小鼠血清中的TMAO浓度进行检测，该试剂盒的检测方法为酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），具体操作步骤参照试剂盒的说明书进行。

采用HE染色对小鼠心肌细胞的排列情况进行评估，操作如下：将“1.2.3”部分获得的小鼠心脏组织标本制作为厚度3 μm的心肌组织切片，经苏木精、伊红染色后，使用奥林巴斯光学显微镜观察染色结果并使用扫描仪对切片进行扫描，而后使用ImageJ软件分析心肌细胞组织形态和心肌细胞排列规整度。

采用马松染色试剂盒对“1.2.5”部分获得的心肌组织切片进行染色，而后使用奥林巴斯光学显微镜观察染色结果，并使用ImageJ软件对心肌组织纤维化的比例进行分析和评估。具体操作见说明书。

将“1.2.3”部分获得的小鼠心脏组织切碎，取心肌组织经液氮研磨后，提取其总蛋白并用二辛可宁酸（bicinchonininc acid，BCA）法测定蛋白浓度。随后，使用PKA活性测定试剂盒检测心肌组织中的PKA活性，具体操作参见试剂盒说明书。

将“1.2.7”部分提取的总蛋白经BCA法测定浓度后，采用蛋白质印迹法（Western blotting）对小鼠心肌组织中RyR2、p-RyR2（S2808）的表达进行检测，具体操作参见说明书进行。其中，使用的一抗为RyR2、p-RyR2（S2808）、GAPDH，工作浓度均为1∶1 000；二抗为HRP标记的抗兔IgG，工作浓度为1∶10 000。

使用GraphPad Prism 9软件对所有数据进行统计分析。定量资料以x±s表示，两两比较采用独立t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

采用超声心动图评估各组小鼠在不同月龄时的FS率和LVPW，结果（图1）显示：① WT+TMAO组小鼠的FS率在4、8、12月龄时呈下降趋势，且在12月龄时显著低于WT组（P=0.013）；HCM+TMAO组小鼠的FS率在8、12月龄时低于同月龄的HCM-1组（均P<0.05），LVPW在12月龄时显著高于HCM-1组（P=0.040）；而在12月龄时，WT组小鼠和HCM-1组小鼠的FS率、LVPW间差异均无统计学意义。② HCM-2组小鼠的LVPW在12月龄时高于HCM+IMC组（P=0.025）。

小鼠血清TMAO浓度检测的结果（图2）显示，常规饲料喂养的HCM-1组小鼠血清中的TMAO浓度高于WT组（P=0.030）。

HE染色的结果（图3A、C）显示：WT+TMAO组小鼠的心肌细胞发生了轻微的排列紊乱，但与WT组相比差异无统计学意义；HCM+TMAO组小鼠心肌细胞排列的规整程度低于HCM-1组（P=0.049），而经IMC喂养后HCM+IMC组的排列规整程度高于HCM-2组（P=0.042）。马松染色的结果（图3B、C）显示，WT+TMAO组小鼠的心肌组织纤维化所占比例与WT组间差异无统计学意义，HCM+TMAO组的纤维化占比则高于HCM-1组（P=0.024），而经IMC喂养后HCM+IMC组的纤维化占比低于HCM-2组（P=0.007）。

小鼠心肌组织中PKA活性的检测结果（图4）显示：WT+TMAO组、HCM+TMAO组小鼠的PKA活性分别高于WT组、HCM-1组，且HCM-1组的PKA活性高于WT组（均P<0.05）；经IMC喂养后，HCM+IMC组小鼠心肌组织中PKA活性则低于HCM-2组（P=0.017）。

Western blotting的结果（图5）显示：WT+TMAO组、HCM+TMAO组小鼠心肌组织中p-RyR2（S2808）表达水平分别高于对应的WT组、HCM-1组（均P<0.05），但RyR2表达量的组间差异无统计学意义；经IMC喂养后，HCM+IMC组小鼠心肌组织中p-RyR2（S2808）的表达低于HCM-2组（P=0.025），RyR2表达量的组间差异亦无统计学意义。

肠道菌群在人类的疾病与健康中扮演着重要角色。作为肠道菌群的代谢产物之一，TMAO在血液循环中的浓度与CVD（如心肌梗死^［7］、中风^［6］及心力衰竭^［13］）患病率密切相关，同时也与心肌肥厚、心肌组织纤维化有着密切关系。研究^［14］表明，TAC术后的大/小鼠疾病模型的血清TMAO浓度出现了显著升高，且可加重心肌肥厚、心室扩张、心力衰竭及心肌纤维化的症状。但有关TMAO在先天性HCM模型中的作用尚未有文献报道。本研究发现HCM小鼠血液循环中的TMAO浓度显著高于WT组。为了探究TMAO对HCM小鼠心脏的影响，在进一步的实验中，我们使用常规饲料、添加了TMAO的饲料和添加了IMC的饲料喂养小鼠。结果显示：常规饲料喂养的WT小鼠和HCM小鼠的FS率间差异无统计学意义，而在TMAO摄入8个月后，WT+TMAO组和HCM+TMAO组小鼠的FS率均有显著下降，这说明TMAO可使小鼠的心功能变差。同时，TMAO的添加对WT小鼠的LVPW、心肌细胞排列规整度、心肌组织纤维化比例无明显影响，但可增加HCM小鼠的LVPW及心肌组织纤维化比例、降低心肌细胞排列的规整度；在使用IMC喂养HCM小鼠后，其LVPW和心肌组织纤维化比例均有显著下降，心肌细胞排列的规整度则有显著提高。上述研究均表明，TMAO与HCM的心肌肥厚、心肌组织纤维化表型等存在因果关系。

研究^［15］发现，心肌纤维的Ca²⁺敏感性增加是HCM患者心脏发生功能障碍的决定因素之一，可促进心肌细胞收缩亢进导致心肌肥厚。因此，本研究考虑从Ca²⁺调控分子靶点的角度探讨TMAO影响HCM小鼠心功能的可能的机制。PKA是调控心肌细胞Ca²⁺相关蛋白的主要激酶^［16］，其异常激活可促进心肌肥大、心力衰竭及糖尿病心肌病的进展^［17］。本研究结果发现：HCM小鼠心肌组织中PKA活性高于WT小鼠，在添加TMAO喂养后该2组小鼠的PKA活性均有增加；而在使用IMC喂养后，HCM小鼠心肌组织中的PKA活性则低于常规饲料喂养的HCM小鼠。这说明TMAO能够增加WT或HCM小鼠心肌组织的PKA活性。

心肌细胞的Ca²⁺调控靶点主要包括横管结构、肌浆网（sarcoplasmic reticulum，SR）、离子通道、激酶等。RyR2是SR上主要的Ca²⁺释放通道，其功能的异常可使胞质内Ca²⁺超载，进而会导致心肌细胞过度收缩、心脏舒张功能发生障碍及心律失常等^［18］。同时，RyR2的功能与其磷酸化［p-RyR2（S2808）］水平息息相关，即RyR2色氨酸2808位点的磷酸化水平。有研究^［16］表明，PKA介导的RyR2色氨酸2808位点磷酸化水平的增加是导致心肌细胞收缩性缺陷和心力衰竭的重要因素之一。缺血性心脏病的相关研究^［19］发现，给予单次、大剂量合成的异丙肾上腺素可诱导PKA依赖性的RyR2色氨酸2808位点发生过度磷酸化，并进一步导致SR的Ca²⁺渗漏，继而诱发心肌细胞的凋亡和坏死。且有研究^［20-21］表明，RyR2色氨酸2808位点的过度磷酸化可使RyR2通道Ca²⁺释放异常，进而导致心肌细胞收缩功能异常、心力衰竭等。在本研究中我们发现，添加TMAO喂养后HCM小鼠心肌组织的p-RyR2（S2808）表达水平有显著升高，而经IMC喂养后其水平有了显著降低；继而证实，TMAO可促进RyR2色氨酸2808位点的磷酸化，这可能是导致HCM小鼠心功能异常的重要原因之一。

综上，血液循环中TMAO浓度的升高是HCM的重要特征之一，其可增强HCM小鼠心肌组织的PKA活性、促进RyR2色氨酸2808位点磷酸化，进而导致心功能障碍。本研究首次在HCM小鼠中验证了TMAO浓度升高对小鼠心功能的影响，该结果或可为HCM患者心功能下降的机制研究提供新的思路。