随着人们生活水平的提高和对美的不懈追求，颅颌面骨畸形及缺损的功能和美观重建越来越受到关注。近年来，基于间充质干细胞的组织工程作为颅颌面骨缺损的替代疗法被广泛关注。作为第一个被报道的间充质干细胞，长骨来源的骨髓间充质干细胞仍是用于骨骼再生最常见和最可靠的干细胞^［1］。然而，由于发育模式和成骨方式与长骨不同，颌骨表现出对机械和稳态刺激的离散反应^［2］。在发育模式上，颌骨起源于神经外胚层的神经嵴细胞，而长骨来源于中胚层细胞；在成骨方式上，颌骨主要以膜内成骨为主，而长骨经历软骨内成骨^［3］。同时，最近的研究^［4］表明，干细胞功能会受到组织特异性的影响。已有文献^［5］证实，颌骨来源的骨髓间充质干细胞（jaw bone marrow mesenchymal stem cells，jBMSCs）与长骨来源的骨髓间充质干细胞之间存在功能差异。来源于上颌骨、下颌骨和牙槽骨等的jBMSCs较来源于长骨的骨髓间充质干细胞表现出更强的增殖能力及成骨分化能力^［6］，在治疗颅颌面骨畸形及缺损等疾病中可能较长骨来源的骨髓间充质干细胞更具优势。因此，如何调控jBMSCs成骨分化成为研究热点，有望为临床治疗颅颌面骨相关疾病提供理论基础。

视黄酸作为维生素A的体内代谢产物，在全身多个器官的形成中发挥着重要作用，也是调控骨生长发育的重要营养物质，其缺乏或过量都会影响骨骼系统生长发育。一方面，儿童维生素A缺乏可阻碍骨骼生长发育造成侏儒^［7］。同时，视黄酸缺乏的动物模型也表现出四肢发育畸形^［8］。研究^［9］表明，视黄酸合成限速酶视黄醛脱氢酶（retinaldehyde dehydrogenase，RALDH）缺乏导致的视黄酸合成减少小鼠表现出骨皮质增厚、骨松质密度增加，其间充质干细胞成骨能力增强，Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor2，Runx2）、骨钙素（osteocalcin，Ocn）和成骨细胞特异性转录因子Sp7等成骨细胞标志基因表达水平升高。另一方面，研究^［10］发现维生素A摄入量显著增加的人体的骨骼效应，包括骨骺过早闭合、骨骼和关节疼痛、皮质骨吸收增加及骨形成异常等。高维生素A血症大鼠表现为骨质变薄和矿化增强导致的骨骼脆性增加，免疫组织化学结果显示骨髓及骨内膜区域细胞OCN、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）和基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）呈阳性，且该区域组织成骨标志基因碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，Alp）及Runx2表达水平升高^［11］。目前，视黄酸对骨骼的影响主要聚焦于长骨，而在颌骨中的作用尚不清楚。此外，之前的体外研究主要以视黄酸对成骨/成骨前体细胞系的作用为主^［12］，而其在骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用还鲜有报道。因此，本文通过体外细胞及分子生物学实验初步探究不同浓度全反式视黄酸（all-trans retinoic acid，ATRA）对大鼠jBMSCs成骨分化能力的影响，为体内研究的开展和阐明视黄酸在颌骨中的作用奠定基础。

4周龄Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠25只，购置于上海吉辉实验动物饲养有限公司，饲养于上海交通大学医学院附属第九人民医院无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级动物房，饲养温度（24±2）℃，12 h昼夜更替，自由饮食。实验小鼠生产许可证号为SCXK（苏）2023-0009，使用许可证号为SYXK（沪）2020-0025。

MEM培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）、青霉素/链霉素溶液、胰蛋白酶（Gibco，美国），4%多聚甲醛（武汉赛维尔生物科技有限公司，中国），ATRA（MCE，美国），大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化试剂盒、大鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导分化试剂盒、大鼠骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒（Cyagen，美国），TRIzol Reagent、反转录试剂盒（TaKaRa，日本），SYBR Green Fast qPCR Mix、抗CD31抗体、抗ALP抗体、抗OCN抗体（ABclonal，美国），抗CD29抗体、抗CD45抗体、抗CD90抗体（BioLegend，美国），抗SP7抗体（Abcam，美国），二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、CCK8检测试剂盒、ALP染色试剂盒、茜素红染色试剂盒、油红O染色试剂盒、免疫染色封闭液、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔IgG（H+L）（A0208）、HRP标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）（A0216）（上海碧云天生物技术有限公司，中国），阿尔辛蓝染色液（pH=2.5）（北京索莱宝科技有限公司，中国）。PCR仪（Roche，瑞士），体视显微镜、荧光显微镜（Olympus，日本）。

二氧化碳（carbon dioxide，CO₂）安乐死雄性SD大鼠4只，参照课题组前期方法^［13-14］获取下颌骨，去除肌肉组织，置于含PBS的培养皿中。取第一磨牙近中至第三磨牙远中骨段，用1 mL注射器吸取MEM完全培养基（含10%FBS、1%青霉素/链霉素溶液）多次冲洗下颌骨骨髓腔直至发白。收集冲洗液250×g离心5 min后弃上清液，重悬于MEM完全培养基中，而后接种至10 cm培养皿内，轻轻摇匀，5%CO₂、37 ℃培养。第3日弃去一半培养基，并加入等量新鲜完全培养基。之后每3 d换液1次。待细胞融合度达70%~80%时加入胰蛋白酶液消化，随后使用等量完全培养基中和。接着，用吹打的方式将细胞分散，并转移至离心管150×g离心5 min。弃上清液，重悬，铺于10 cm培养皿中传代。待细胞融合度再次达70%~80%时，取P1代细胞铺板用于后续实验。

取P1代细胞置于PBS中，450×g离心5 min弃上清液。随后用流式染色缓冲液重悬细胞，并将其均分为4组，每组约10⁵个细胞。而后分别使用抗CD29、CD45、CD90和CD31抗体4 ℃孵育30 min。再次以450×g离心5 min后，用流式染色缓冲液清洗。最后，将清洗后的细胞重悬，上机检测并分析。

分别使用ATRA浓度为0.01、0.1、1、5、10、20 μmol/L的培养基培养P1代jBMSCs，同时用含有1 μL/mL DMSO的培养基作为对照组。培养48 h后，向各培养基中加入CCK8试剂，继续孵育1 h。随后，通过酶标仪检测450 nm处吸光度并参阅文献计算相对活细胞数^［15］。

参考文献中成骨诱导方法^［16］，取P1代细胞以5×10⁴个/mL密度铺板。待细胞贴壁后，分别使用ATRA浓度为0.01、0.1、1、5、10、20 μmol/L的大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导液进行成骨分化诱导。同时用含有1 μL/mL DMSO的大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导液作为对照组。2 d换液1次。成骨诱导7 d后，进行ALP染色（见“1.3.8”）、免疫荧光染色（见“1.3.9”）和成骨相关基因表达水平检测。成骨诱导14 d后，进行茜素红染色（见“1.3.10”）。

参考文献中成脂诱导方法^［17］，按照说明书配制大鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导分化培养基A液和B液。取P1代细胞以5×10⁴个/mL密度铺于96孔板中。待细胞贴壁融合度达到100%时，吸去完全培养基，每孔加入A液100 μL。诱导2 d后，吸去A液，加入B液100 μL。维持1 d后，吸去B液，换回A液进行诱导。A液和B液交替使用，待显微镜下观察到大量脂滴时停止诱导，进行油红O染色（见“1.3.11”）。

参考文献中成软骨诱导方法^［14］，按照说明书配制大鼠骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化预混液和成软骨诱导分化完全培养基。取4×10⁵个P1代细胞于15 mL离心管中，20 ℃、250×g离心4 min。吸去上清液，加入0.5 mL预混液重悬细胞，然后以20 ℃、150×g离心5 min。再次重复清洗细胞。弃去上清液，用0.5 mL成软骨诱导分化完全培养基重悬细胞，随后以20 ℃、150×g离心5 min。拧松离心管盖以便气体交换，将离心管竖立放置于培养箱中培养。待24~48 h后，细胞出现聚团现象时，轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮于液体中。此后，每隔3 d更换1次新鲜成软骨诱导分化完全培养基。持续诱导21 d，直至管内形成直径1.5~2 mm的软骨球，即可准备切片染色（见“1.3.12”）。

弃去培养孔板中培养液后，使用PBS洗涤细胞。24孔板每孔加入500 μL TRIzol裂解细胞，并将裂解后的细胞混合物收集于无酶Eppendorf管中。接着加入100 μL氯仿，轻轻混匀后静置3 min，4 ℃、10 000×g离心15 min。随后小心吸取最上层无色水相液体，加入等量异丙醇，摇匀后静置10 min。再次以4 ℃ 10 000×g离心10 min，以沉淀RNA。弃上清液，加入适量无酶无菌水配制的75%乙醇洗涤，4 ℃ 10 000×g离心15 min。重复洗涤2次后弃上清液，在通风橱中干燥RNA沉淀。用20 μL无酶无菌水充分溶解沉淀。使用超微量紫外分光计测定RNA浓度。利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA后，使用SYBR Green Fast qPCR Mix试剂盒进行实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR），以检测成骨相关基因Alp、骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，Bsp）、Ⅰ型胶原蛋白α1（collagen type Ⅰ α1，Col1a1）、Ocn的表达，根据课题组前期方法^［18］分析数据。引物序列见表1。

使用含有上述浓度的ATRA成骨诱导液分别诱导jBMSCs成骨分化7 d后，吸去96孔板中原有培养基，用PBS轻轻洗涤3次。随后，加入4%多聚甲醛固定5 min，再用PBS清洗3次。接着每孔加入80 μL按照说明书配制好的ALP染色液，在37 ℃条件下避光孵育约5 min。最后使用双蒸水冲洗以终止染色反应。体视显微镜下可见ALP阳性细胞呈蓝紫色，拍照记录。

根据文献方法^［19］，用含有上述浓度的ATRA成骨诱导液诱导jBMSCs成骨分化7 d，吸去96孔板中原有培养基，PBS轻轻洗涤3次后加入4%多聚甲醛固定20 min，再用PBS清洗3次后，室温封闭1 h，孵育一抗（SP7、ALP、OCN，1∶500），4 ℃过夜。PBS清洗后，室温使用相应二抗［HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L）、HRP标记的山羊抗小鼠IgG（H+L），1∶1 000］孵育1 h，PBS清洗后4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色10 min，再次用PBS清洗后，于荧光显微镜下拍照。

用含有上述浓度的ATRA成骨诱导液分别诱导jBMSCs成骨分化14 d后，吸去96孔板中原有培养基，用PBS轻轻洗涤1次。随后，加入按照说明书配置好的固定液固定20 min，再用PBS冲洗3次。接着每孔加入80 μL茜素红染色液染色20 min，再用双蒸水冲洗1次。体视显微镜下可见红色矿化结节，拍照记录。

吸去96孔板中的成脂诱导分化完全培养基，PBS轻柔洗涤3次后每孔加入4%多聚甲醛溶液100 μL固定20 min。将油红O储存液和蒸馏水按照2∶3比例混合配制为工作液后过滤。吸去固定液，PBS轻柔洗涤3次后每孔加入100 μL油红O工作液，室温染色30 min。吸去染色液，PBS轻柔洗涤3次后于体视显微镜下可见红色脂滴，拍照。

将诱导形成的软骨球用PBS清洗后，4%多聚甲醛溶液固定30 min，分别浸泡于50%、70%、80%、95%乙醇和无水乙醇中脱水各30 min。再用二甲苯和无水乙醇1∶1混匀浸泡2 h。接着，将软骨球在二甲苯中浸泡2次，每次1 h，进行透明。将二甲苯和石蜡按1∶1混匀，将软骨球浸泡其中放于40 ℃烘箱中40 min后，浸泡于纯石蜡中，55 ℃烘箱放置30 min。将软骨球取出，进行包埋后切片。将切片分别浸于二甲苯、无水乙醇，以及95%、85%、70%和50%乙醇中各10 min，晾干。在晾干的切片上滴加阿尔辛蓝染液，37 ℃染色1 h后，自来水冲洗5 min，晾干。体视显微镜下可见组织内大量蓝色酸性黏多糖，拍照。

使用SPSS 24.0软件进行数据统计分析。定量资料以x±s表示，采用独立样本t检验进行组间比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。

通过全骨髓贴壁法提取jBMSCs并用流式细胞术对P1代jBMSCs进行骨髓间充质干细胞表面抗原鉴定（图1A）。结果显示，98%以上的细胞表现为CD29^＋CD90^＋CD31^－CD45^－（图1B），符合骨髓间充质干细胞的特点。分别对成骨诱导7 d和14 d的P1代jBMSCs进行ALP染色和茜素红染色，发现诱导组ALP染色和茜素红染色较对照组均明显增强（图1C）。成脂诱导5 d后，油红O染色显示诱导组有明显的脂滴生成（图1D）。同时，成软骨诱导21 d后形成软骨球，石蜡切片显示阿尔辛蓝染色阳性（图1E）。以上结果说明jBMSCs具有成骨、成脂、成软骨多向分化的潜能。

使用CCK8法检测不同浓度ATRA对jBMSCs细胞活性的影响。CCK8分析显示，0.01、0.1、1、5、10、20 μmol/L ATRA处理48 h后，jBMSCs存活率较对照组差异无统计学意义（图2），表明以上浓度ATRA对jBMSCs无明显细胞毒性。

分别使用含有ATRA浓度为0.01、0.1、1、5、10、20 μmol/L的成骨诱导液对P1代jBMSCs成骨诱导7 d后进行ALP染色。与对照组相比，0.01、0.1、1 μmol/L ATRA组jBMSCs的ALP活性增强，且在0.1 μmol/L浓度时达到峰值，而5、10、20 μmol/L ATRA组ALP活性下降，且差异有统计学意义（均P<0.05）（图3A）。成骨诱导14 d后进行茜素红染色，结果（图3B）显示，与对照组相比，0.01、0.1、1 μmol/L ATRA组jBMSCs矿化结节形成能力增强，且在0.1 μmol/L浓度时达到峰值，而5、10、20 μmol/L ATRA组矿化结节形成能力下降，且差异有统计学意义（均P<0.05），说明较低浓度（0.01、0.1、1 μmol/L）ATRA可增强jBMSCs成骨分化能力，而较高浓度（5、10、20 μmol/L）ATRA抑制jBMSCs成骨分化。此外，与对照组相比，不论是0.01 μmol/L组还是1 μmol/L组ALP活性及矿化结节形成能力均明显弱于0.1 μmol/L组，且差异有统计学意义（均P<0.05），可认为0.1 μmol/L ATRA是促进jBMSCs成骨分化的最适浓度。因此，后续实验均选取0.1、1、5、10、20 μmol/L组作为实验组研究ATRA对jBMSCs成骨分化过程中成骨相关基因及蛋白表达的影响。

利用qPCR对不同浓度ATRA条件下成骨诱导7 d后的P1代jBMSCs进行成骨相关基因表达水平检测。结果（图4）显示，与对照组相比，0.1、1 μmol/L ATRA组jBMSCs成骨相关基因Alp、Bsp、Col1a1、Ocn表达水平显著上升，而5、10、20 μmol/L ATRA组jBMSCs成骨相关基因Alp、Bsp、Col1a1、Ocn表达水平显著下降，且差异具有统计学意义（P=0.000）；提示较低浓度ATRA（0.1、1 μmol/L）促进jBMSCs成骨相关基因表达，而较高浓度ATRA（5、10、20 μmol/L）抑制jBMSCs成骨相关基因表达。

利用细胞免疫荧光染色对不同浓度ATRA条件下成骨诱导7 d后的P1代jBMSCs进行成骨相关蛋白表达水平检测。结果（图5）显示，与对照组相比，0.1、1 μmol/L ATRA组jBMSCs成骨相关蛋白SP7、ALP和OCN表达增强，而5、10、20 μmol/L ATRA组jBMSCs成骨相关蛋白SP7、ALP和OCN表达减弱，且差异具有统计学意义（均P<0.05），与qPCR结果相符；说明较低浓度ATRA（0.1、1 μmol/L）上调jBMSCs成骨相关蛋白表达水平，而较高浓度ATRA（5、10、20 μmol/L）抑制jBMSCs成骨相关蛋白表达水平。

外伤、唇腭裂、骨性错颌畸形及各种综合征是导致颅颌面骨畸形和缺损的重要原因。临床上，唇腭裂患者常伴发牙槽突裂。为了恢复牙弓稳定性和为牙萌出提供良好的骨基础，常用髂骨对牙槽突裂进行移植修复。然而，有研究^［20］证实，下颌骨移植优于髂骨移植，表现出相容性更好、骨吸收更少等特点。这种差异可能归因于颌骨等颅颌面骨和髂骨等中轴附肢骨骼不同的胚胎起源及发育方式。在发育过程中，颅颌面骨起源于腹外侧迁移至鳃弓的来自神经外胚层的神经嵴细胞，并经历膜内成骨形成颅颌面骨结构，而中轴附肢骨骼来源于中胚层，成骨方式主要以软骨内成骨为主^［4］。此外，两者在生物力学方面也具有一定差异。中轴附肢骨骼在行使直立或行走等生理功能时所承受的力几乎是咀嚼时牙槽骨所受力的一半，这可能是巨颌症、双膦酸盐相关性颌骨坏死仅影响颌骨的原因^［21］。细胞层面上，两者都符合间充质干细胞的特点，高表达CD20、CD44、CD90等细胞表面抗原，而低表达CD45、CD31、CD34、CD11b等细胞表面抗原^［22］。然而，两者在生物学特性上具有一定区别。越来越多的研究^［23-24］表明，与长骨相比，jBMSCs具有部位特异性，具体表现为更强的自我更新、成骨和成血管能力，且细胞衰老速度更缓慢，而在成脂及成软骨能力方面较弱。最新研究^［17］发现，Fat4⁺细胞亚群在牙槽骨而非长骨中特异性富集，且该细胞亚群具有集落形成以及成骨和成脂分化能力，说明颌骨可能存在特异性干细胞亚群，造成了其与长骨在某些生物学特征上的差异。视黄酸作为维生素A在体内的代谢产物，不仅影响长骨生长发育，在颅颌面骨生长发育中也表现出重要的作用。一方面，人类胚胎期维生素A缺乏，以及动物维生素A或视黄酸合成限速酶RALDH10缺乏均表现出唇裂、腭裂及颅面骨发育异常等^［25-26］。此外，在小牛中，视黄酸缺乏可导致颅面骨骨吸收和膜内成骨异常，并以下颌骨内侧缘表现最为显著^［27］。另一方面，孕妇维生素A摄入过量或暴露于过量视黄酸类似物会导致小耳畸形、眼距过宽、腭裂、唇裂、小颌畸形和面中部发育不全等颅颌面发育异常、复杂的先天性心脏病和中枢神经系统异常^［28］。同时，视黄酸过量或当细胞色素P450酶系26（cytochrome P450 family 26 enzyme，CYP26）基因突变/敲除使视黄酸不能正常降解而在细胞内堆积时，同样会使胎儿及小鼠胚胎出现颅缝早闭、颅骨形成不全等颅颌面骨发育畸形表现^［29］。然而，视黄酸对长骨及颌骨的作用之间是否存在差异仍不清楚。此外，视黄酸缺乏或过多均会引起颅颌面骨畸形，但其具体调控机制尚不明确，有必要通过条件性基因敲除小鼠进一步研究。

鉴于视黄酸在骨骼中的重要作用，许多学者对其在成骨分化中的作用进行了体外研究。结果显示，不同浓度视黄酸对成骨细胞及其前体细胞的分化能力表现出多样性。一方面，部分研究^［12］表明，ATRA在纳摩尔浓度下抑制成骨分化，而在微摩尔浓度下促进成骨分化。OHISHI等^［30］发现1 nmol/L ATRA抑制胎鼠颅骨原代成骨细胞ALP活性、骨矿化结节形成及成骨相关基因骨γ-羧基谷氨酸蛋白（bone γ- carboxyglutamate protein，Bglap）表达水平。人类成骨细胞前成骨细胞系（SV-HFO）在100 nmol/L ATRA条件下也观察到类似结果^［31］。此外，400 nmol/L ATRA抑制人原代成骨细胞和成骨前体细胞系（MC3T3-E1）的矿化能力，并且对MC3T3-E1细胞的影响主要与成骨相关基因Alp、Bglap、Runx2和Sp7相关^［32］。而使用1 μmol/L ATRA处理大鼠成骨细胞系导致ALP活性增强，且成骨相关基因Col1a1表达上调。同时，1 μmol/L浓度的ATRA可促进小鼠间充质干细胞细胞系（C3H10 T1/2）成骨相关基因Alp、Runx2和整合素结合唾液酸蛋白（integrin binding sialoprotein，Ibsp）的表达并促进其矿化^［33］。另一方面，也有研究^［34］表明，5、10 μmol/L ATRA可抑制小鼠原代成骨细胞和MC3T3-E1的ALP活性及矿化能力，并且下调成骨相关基因Alp、Bglap、Col1a1的表达。以上研究大多局限于视黄酸对原代成骨细胞/成骨细胞系以及成骨前体细胞系的研究，而其对于骨髓间充质干细胞作用的研究还较罕见。本研究成功分离并培养大鼠jBMSCs，并发现ATRA在0.01、0.1、1μmol/L浓度下促进jBMSCs成骨分化，且该促进效应在0.1 μmol/L浓度达到峰值，而在5、10、20 μmol/L浓度下抑制jBMSCs成骨分化，说明ATRA对jBMSCs成骨分化的调控存在双向效应。之前的研究对于视黄酸在成骨分化中的作用表现出相互矛盾的结果，可能正是由于视黄酸在此过程中的双向效应导致的。

维生素A摄入过多会引起以眩晕、呕吐、腹泻、头痛、抽搐和皮肤脱皮为特征的疾病。可见，维生素A及视黄酸维持在正常生理水平是机体代谢所必需的。然而，目前还没有敏感、有效的方法确切评估机体的维生素A状况。事实上，视黄酸常作为药物治疗痤疮及多种癌症，包括急性早幼粒细胞白血病、卡波西肉瘤、头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌和神经母细胞瘤等^［35］。因此，将视黄酸用于疾病治疗的过程中应注意监测患者其他系统的不良反应，做到安全、合理、高效用药。

综上，本研究利用课题组前期方法成功分离培养了大鼠jBMSCs，在体外进行成骨诱导，利用ALP染色、茜素红染色、qPCR及免疫荧光染色等实验分析了不同浓度ATRA对大鼠jBMSCs成骨活性、矿化能力，以及成骨相关基因mRNA和蛋白表达水平的影响。研究结果表明，较低浓度（0.01、0.1、1 μmol/L）ATRA促进大鼠jBMSCs成骨分化能力，且该效应在0.1 μmol/L浓度时达到峰值，而较高浓度（5、10、20 μmol/L）ATRA抑制大鼠jBMSCs成骨分化能力，说明全反式视黄酸对大鼠jBMSCs成骨分化的调控具有双向效应。本研究为体内研究的开展与视黄酸的临床应用提供了参考依据。