胰腺癌是一种高侵袭性的恶性肿瘤，5年生存率仅9%~11%^［1］。吉西他滨（gemcitabine，GEM）是美国食品与药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）1997年批准的胰腺癌标准一线化疗药，其最大的问题是耐药性。因此，早期判断化疗耐药性，及时更换干预方案是临床亟需解决的问题。前期研究发现，GEM化疗可通过调节低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）影响糖酵解通路，改变肿瘤糖代谢微环境诱导化疗耐药^［2］。化疗前后行［¹⁸F］氟代脱氧葡萄糖（［¹⁸F］fluorothymidine，［¹⁸F］F-FDG）PET双时相显像，动态观察滞留指数（retention index，RI）变化有助于评估胰腺癌的耐药性^［2-3］。但由于操作较复杂，且需多次显像提高诊断效能，临床可行性欠佳。

［¹⁸F］氟代甲基咪唑（［¹⁸F］fluoromisonidazole，［¹⁸F］F-FMISO）是一种乏氧微环境PET显像剂。过度生长和治疗后坏死至乏氧是大多数肿瘤常见的病理生理过程。乏氧会激活HIF来调节糖酵解通路，以及血管生成、细胞增殖的基因表达而促进肿瘤生长和转移^［4-5］。目前，［¹⁸F］F-FMISO PET主要应用于已确诊的肿瘤，评估其恶性程度、耐药性以及预后，包括胰腺癌^［5-7］。YAMANE等^［5］证实了［¹⁸F］F-FMISO放射性摄取增高，患者的无复发生存时间及总生存时间（overall survival，OS）明显缩短。

［¹⁸F］氟-脱氧胸腺嘧啶核苷（［¹⁸F］fluorothymidine，［¹⁸F］F-FLT）是一种细胞增殖PET显像剂。由于［¹⁸F］F-FLT的细胞内滞留与胸苷酸激酶1（thymidine kinase1，TK1）的活性呈正相关，而TK1的活性是由细胞周期决定的，肿瘤细胞无限增殖可使TK1活性明显上调^［8］。GEM是细胞周期特异性抗癌药，可调整细胞周期、抑制细胞增殖^［9-10］。因此，［¹⁸F］F-FLT PET/CT可用于评估GEM的化疗效果，我们的前期研究发现，该显像可判断胰腺癌耐药性，预测生存时间^［11］。

由于肿瘤增殖与乏氧密切相关，本研究拟通过［¹⁸F］F-FMISO和［¹⁸F］F-FLT PET/CT双核素显像，探讨胰腺癌耐药性及GEM化疗对肿瘤乏氧微环境和细胞增殖状态的影响，为临床转化提供理论依据。

前期研究冻存的胰腺癌亲代细胞株PANC-1（P）和耐药细胞株PANC-1/R（PR）^［2］稳定培养后，行下一步实验。培养液体系：DMEM（Gibco，美国），加10%胎牛血清（FBS，Gibco，美国）和1%青霉素?链霉素双抗（Gibco，美国），放入37 ℃恒温培养箱培养（含5% CO₂）。耐药程度鉴定：将稳定生长的细胞株接种于96孔板，每孔约1×10³个细胞，梯度浓度加入GEM（0~10μg/L），于第4天加入CCK-8试剂（碧云天），1h后在酶标记仪（multiskan MK3，Thermo Fisher Scientific，美国）测量比色（λ_max=450nm）。IC₅₀定义为导致50%细胞死亡的GEM浓度。计算耐药指数（drug resistant index，DRI）=IC₅₀-PR/IC₅₀-P。

5周龄BALB/c雄性裸鼠，购自上海灵畅生物科技有限公司，生产许可证号SCXK（沪）2018-0003；在上海交通大学医学院实验动物科学部饲养，动物使用许可证号SCXK（沪）2023-0041。将裸鼠随机分为P组和PR组，每组12只，于左侧腋窝皮下接种约1×10⁷个细胞，待成瘤。需探讨肿瘤生长不同时期给予化疗对显像和预后的差异，因此设置亚组，每个亚组n=3，分别于接种肿瘤细胞后第12天、第18天开始给予GEM；同时设对照组给予磷酸盐缓冲液（PBS，碧云天），每个亚组n=3（图1）。

接受化疗的裸鼠隔日腹腔注射1 μg/kg GEM，对照组隔日腹腔注射20 μL PBS；共6次（图1）。

治疗前、末次治疗后行［¹⁸F］F-FMISO和［¹⁸F］F-FLT PET/CT显像（分2 d完成）。显像方法：尾静脉注射［¹⁸F］F-FMISO（14.8MBq）后3 h/［¹⁸F］F-FLT（14.8MBq）后1 h，采集图像。使用Inveon Acquisition Workplace工作站（SIEMENS，德国）勾画感兴趣区（region of interest，ROI）得到半定量指标（maximum standardized uptake value，SUV_max）。ΔSUV_max=（第二次显像SUV_max－第一次显像SUV_max）/第一次显像SUV_max。

追踪指标：隔3d记录裸鼠体质量（g）、肿瘤长径（mm）和短径（mm），计算肿瘤生长速率。肿瘤体积=长径×短径²/2；肿瘤生长速率=（后一次肿瘤体积－前一次肿瘤体积）/3。

［¹⁸F］F-FMISO的放射性标记：使用回旋加速器（GE PETtrace 800，美国）通过¹⁸O（p，n）¹⁸F反应产生的¹⁸F^-离子使用自动合成模块（ALLinOne），在碳酸氢盐（碳酸钾/K222）［K222，碳酸氢盐（碳酸钾/K?CO?）］溶液中于115 ℃下与FMISO配体反应10 min，经高效液相色谱仪纯化得到最终产品。

［¹⁸F］F-FLT的放射性标记：使用回旋加速器通过¹⁸O（p，n）¹⁸F反应产生的¹⁸F^-离子使用自动合成模块，在碳酸氢盐（碳酸钾/K222）溶液中于100 ℃下与FLT前体反应10 min，100 ℃水解10 min，经高效液相色谱仪纯化得到最终产品。

采用GraphPad Prism 7.0和IBM SPSS Statistics 23.0软件进行统计学分析并绘图。符合正态分布的定量数据用x±s表示。2组间或组内比较采用独立样本t检验（双侧）。双变量相关性采用Pearson相关性分析。生存时间对比采用Kaplan-Meier生存分析。绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC），获得曲线下面积（area under the curve，AUC），认为AUC>0.9的半定量参数可用于评估准确性，计算约登指数，确定半定量参数的阈值。P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异有显著统计学意义。

CCK-8试验证实PR具有对GEM的高度耐药性：IC₅₀-P为98.41 μg/mL，IC₅₀-PR为416.80 μg/mL，DRI-PR为4.24（n=5）。再按分组接种细胞并进行治疗，追踪裸鼠体质量和肿瘤体积（图2）。

将肿瘤生长分为3个阶段：早期缓慢生长阶段（第3~15天，S1期），中期快速生长阶段（第16~30天，S2期），终末阶段（>30 d，S3期）。P肿瘤生长比PR肿瘤快，且终末P肿瘤比PR肿瘤大［（1 387.47±51.17）mm³vs （1 030.25±39.81）mm³，P<0.001，n=12］。

18D-G组治疗给予时期位于S2期，治疗前P和PR体积分别为（198.23±17.75）mm³和（130.52±7.81）mm³（P<0.001，n=12），生长速率分别为（25.65±2.68）mm³/d和（16.07±0.91）mm³/d（P<0.001，n=12），此时裸鼠体质量已开始进入下降阶段；12D-G组治疗给予时间位于S1期，治疗前P和PR体积分别为（60.56±7.39）mm³和（42.53±5.00）mm³（P=0.001，n=12），生长速率分别为（8.06±1.50）mm³/d和（3.98±0.47）mm³/d（P<0.001，n=12），此时裸鼠体质量达到高峰。该结果提示12D-G组给予治疗时肿瘤负荷较18D-G组小。

（1）18D-G组

化疗前P肿瘤生长速率快于PR肿瘤［（25.59±3.61）mm³/d vs （16.22±1.11）mm³/d，P=0.010，n=6］，且P肿瘤体积大于PR肿瘤［（196.67±22.51）mm³vs （132.55±8.49）mm³，P=0.010，n=6］，但GEM化疗后，P肿瘤体积、生长速率与PR肿瘤相比差异无统计学意义。末次GEM化疗后，化疗组肿瘤大小及生长速率与非化疗组相比差异无统计学意义；但图2仍观察到，GEM化疗期间P肿瘤的生长速率略加快，化疗结束后肿瘤的生长速率较未化疗组减慢，提示肿瘤生长被抑制，而GEM化疗后，PR肿瘤的生长速率反而呈持续加速状态。

（2）12D-G组

末次GEM化疗后，P肿瘤体积仍比PR肿瘤大［（415.78±54.51）mm³vs （321.07±27.87）mm³，P=0.050，n=6］，但P肿瘤的生长速率已明显慢于PR肿瘤［（18.27±2.58）mm³/d vs （41.42±2.82）mm³/d，P<0.001，n=6］；图2可见，GEM化疗期间P肿瘤的生长速率快于非化疗组，但在末次化疗开始肿瘤的生长已被抑制，而GEM对PR肿瘤还有促进生长的作用。该结果与18D-G组类似。末次化疗后，比较2组的P肿瘤生长速率，12D-G组生长速率低于18D-G组［（18.27±2.58）mm³/d vs （53.80±7.76）mm³/d，P=0.006，n=6］，提示早期化疗对肿瘤生长速率抑制效果较显著。

接种P肿瘤的裸鼠生存时间较接种PR肿瘤的裸鼠长（P=0.012，n=12）。

（1）18D-G组的生存分析

接种P肿瘤的裸鼠化疗组与非化疗组生存时间比较无统计学差异；而接种PR肿瘤的裸鼠化疗组生存时间短于非化疗组（P=0.025，n=6）。

（2）12D-G组生存分析

接种P肿瘤的裸鼠生存时间较接种PR肿瘤的裸鼠长［（56.00±2.65）d vs （41.67±1.45）d，P=0.025，n=6］；接种P肿瘤的裸鼠化疗组生存时间长于非化疗组［（68.33±1.45）d vs （56.00±2.65）d，P=0.025，n=6］；而接种PR肿瘤的裸鼠化疗组生存时间短于非化疗组［（31.00±2.89）d vs （41.67±1.45）d，P=0.025，n=6］。

第一次［¹⁸F］F-FMISO和［¹⁸F］F-FLT PET显像SUV_max与肿瘤体积、生长速率均呈正相关（P<0.001，n=24）。第二次显像肿瘤体积与SUV_max-FMISO呈正相关（P<0.001，n=12），生长速率与SUV_max-FLT呈正相关（P=0.002，n=12），与余半定量指标无明显相关性。结果提示，SUV_max-FMISO主要受肿瘤体积影响，而SUV_max-FLT主要受生长速率影响。

（1）18D-G组

接种P肿瘤的裸鼠，化疗组SUV_max-FMISO［（1.07±0.20） vs （2.03±0.40），P=0.021，n=6］和ΔSUV_max-FMISO［（0.22±0.12） vs （0.79±0.26），P=0.026，n=6］均明显低于非化疗组。接种PR肿瘤的裸鼠，化疗组ΔSUV_max-FMISO［（0.43±0.06） vs （1.11±0.04），P<0.001，n=6］和ΔSUV_max-FLT［（0.47±0.05） vs （1.62±0.59），P=0.028，n=6］均明显低于非化疗组。其余半定量参数比较无统计学差异。

（2）12D-G组

接种P肿瘤的裸鼠，化疗组ΔSUV_max-FMISO［（0.32±0.11） vs （1.44±0.33），P=0.005，n=6］和ΔSUV_max-FLT［（0.34±0.13） vs （1.97±0.28），P=0.010，n=6］均明显低于非化疗组。接种PR肿瘤的裸鼠，化疗组ΔSUV_max-FMISO［（0.63±0.23） vs （1.62±0.09），P=0.002，n=6］和ΔSUV_max-FLT［（1.35±0.63） vs （4.36±0.38），P=0.006，n=6］也均明显低于非化疗组。其余半定量参数比较无统计学差异。

虽然各亚组分析中，化疗组和非化疗组SUV_max-FMISO和SUV_max-FLT之间并无明显的统计学差异，但化疗组的SUV_max-FMISO和SUV_max-FLT平均值仍低于非化疗组。综上所述，GEM化疗对肿瘤乏氧微环境及细胞增殖有一定的抑制作用。

（1）非化疗组

ΔSUV_max-FLT与生存时间呈负相关（P=0.054，n=12），提示细胞增殖越慢，生存时间越长。

（2）化疗组

ΔSUV_max-FMISO（P=0.050，n=12）和ΔSUV_max-FLT（P=0.006，n=12）与生存时间均呈负相关，提示化疗前后［¹⁸F］F-FMISO和［¹⁸F］F-FLT PET差值越小，GEM抑制细胞增殖效果越好，细胞代谢率越低，生存时间越长。

（1）18D-G组

非化疗组P肿瘤第一次双核素显像的SUV_max-FMISO和SUV_max-FLT均高于PR肿瘤［（1.15±0.27） vs （0.70±0.15），P=0.050；（1.60±0.46） vs （0.84±0.08），P=0.047；n=3］，第二次显像P肿瘤的ΔSUV_max-FLT明显低于PR肿瘤［（0.23±0.05） vs （1.62±0.59），P=0.005，n=3］。化疗组P肿瘤第一次双核素显像的SUV_max-FLT略高于PR肿瘤［（1.29±0.53） vs （0.79±0.15），P=0.052，n=3］，第二次显像P肿瘤的ΔSUV_max-FMISO和ΔSUV_max-FLT低于PR肿瘤［（0.22±0.12） vs （0.43±0.06），P=0.045；（0.03±0.14） vs （0.47±0.63），P=0.050；n=3］。余半定量指标无统计学差异。

（2）12D-G组

非化疗组P肿瘤第一次双核素显像的SUV_max-FMISO和SUV_max-FLT均高于PR肿瘤［（0.52±0.12） vs （0.29±0.07），P=0.048；（0.45±0.09） vs （0.19±0.07），P=0.020，n=3］，第二次显像P肿瘤的ΔSUV_max-FLT明显低于PR肿瘤［（1.97±0.28） vs （4.36±0.78），P=0.007；n=3］。化疗组P肿瘤第一次双核素显像的SUV_max-FLT高于PR肿瘤［（0.56±0.11） vs （0.27±0.08），P=0.019；n=3］，第二次显像P肿瘤的ΔSUV_max-FLT低于PR肿瘤［（0.34±0.13） vs （1.35±0.63），P=0.051，n=3］。余半定量指标无明显统计学差异。

综上所述，肿瘤生长中期（S2期）ΔSUV_max-FLT越大，细胞增殖越快，提示耐药性可能越强，包括化疗和非化疗。

采用治疗前各半定量参数对肿瘤耐药准确性进行预测分析，绘制ROC曲线后获得AUC，结果提示：SUV_max-FMISO和SUV_max-FLT的AUC<0.90，不适用于预测胰腺癌耐药性。（图3）

采用末次治疗后各半定量参数进行化疗耐药准确性评估分析，绘制ROC曲线后获得AUC，结果提示：非化疗组ΔSUV_max-FLT的AUC为0.90，可以用于评估化疗耐药性；ΔSUV_max-FLT=0.45时约登指数最大，为0.50，预测耐药胰腺癌的灵敏度和特异度分别为100.00%、50.00%。化疗组ΔSUV_max-FMISO的AUC为0.94，ΔSUV_max-FLT的AUC为0.97，可用于评估化疗耐药性；ΔSUV_max-FMISO=0.37、ΔSUV_max-FLT=0.36时约登指数最大，均为0.83，上述阈值判断耐药胰腺癌的灵敏度和特异度均为100.00%、83.33%。其余各半定量参数AUC<0.9，不适用于评估化疗耐药性。（图3）

早期判断胰腺癌的化疗耐药性，即时干预治疗，是影响患者预后的关键因素。本研究发现，GEM短期会加速肿瘤细胞的生长，而化疗结束后，非耐药胰腺癌细胞的生长速率可被抑制、生存时间延长，耐药胰腺癌细胞的生长速率不能被抑制，甚至有加速的趋势，缩短了生存时间；这与前期研究结果一致^［2，11］。对于接种非耐药胰腺癌细胞的裸鼠，及早给予GEM化疗，抑制肿瘤生长效果则显著。导致化疗耐药的因素包括肿瘤微环境变化、耐药相关蛋白突变、肿瘤干细胞活化等^［12-13］。核素显像的优势就是利用分子探针将化疗耐药内在分子改变可视化，纵向监测代谢或功能动态变化规律。［¹⁸F］F-FDG PET/CT预后指标的建立一直存在争议^［14-15］。各种基于［¹⁸F］F-FDG PET/CT的成像参数，如代谢肿瘤体积和总病灶糖酵解率等，曾被建议作为胰腺癌预后的指标^［16-18］。前期研究建议，末次化疗后行［¹⁸F］F-FDG PET/CT双时相显像获得的RI能更准确地判断化疗耐药性^［2］。但由于参数获得较为复杂，临床上并未广泛应用。

乏氧，即微环境中的氧浓度低于正常组织，是大多数恶性肿瘤的共同特征，可显著影响肿瘤的生长、转移和对治疗的反应，诱导产生化疗耐药，加速疾病进展^［19-20］。研究^［21-22］显示，导致乏氧的原因有多种：① 肿瘤血管发育异常导致血供不足。② 肿瘤相关成纤维细胞的增生阻碍氧分子的递送。③ 肿瘤生长迅速，耗氧量增加导致相对缺氧。④ 肿瘤细胞代谢活跃，对氧供需求量增加。这些变化在耐药性胰腺癌中尤为明显^［23-24］。因此，肿瘤乏氧监测是判断耐药性的重要参考标准。［¹⁸F］F-FMISO是应用较早且广泛认可的PET乏氧显像剂。乏氧最重要的基因改变即HIF蛋白被激活^［25］，HIF是在肿瘤内环境和代谢途径上起关键作用的转录因子，可参与血管生成、细胞增殖、细胞代谢等过程，从而促进肿瘤生长和转移^［5，26］。前期研究证实，耐药胰腺癌HIF-1α活性明显增加，促进了肿瘤的糖酵解^［2］。有研究显示，HIF-1α的高表达与［¹⁸F］F-FMISO的摄取相关^［27-28］，但该结论仍存在争议^［29-30］。TOMOHIKO等^［4］对25例胰腺癌患者进行了［¹⁸F］F-FMISO PET/CT显像，并与免疫组化结果对比：［¹⁸F］F-FMISO高放射性摄取倾向HIF-1α高表达，但摄取程度与HIF-1α表达量之间没有显著相关性。本研究建议，通过化疗前后对比［¹⁸F］F-FMISO PET/CT显像得到的ΔSUV_max-FMISO值有利于预测生存时间，ΔSUVmax-FMISO越大，GEM抑制肿瘤乏氧作用越小，生存时间越短。

［¹⁸F］F-FLT是经典的细胞增殖PET显像剂，因能被TK1酶磷酸化而被滞留于细胞内，故细胞摄取［¹⁸F］F-FLT的量与TK1活性呈正相关。TK1是DNA合成途径的关键酶，其活性是由细胞周期决定的，增殖期细胞TK1活性增加，在S期末和G2期达到高峰；肿瘤细胞的无限增殖可使TK1活性达正常细胞的3~4倍^［31］。GEM是细胞周期特异性抗癌药，干扰DNA合成关键酶（包括TK1等），抑制DNA合成途径^［9-10］，主要作用于S期细胞，也可阻止G1期细胞向S期的进展，从而影响细胞周期重分布。NAKAJO等^［32］通过对15例初诊胰腺癌患者同期行［¹⁸F］F-FLT和［¹⁸F］F-FDG PET/CT显像，对比预测胰腺癌预后效果，发现仅SUV_max-FLT与无进展生存时间（progression-free survival，PFS）相关，且SUV_max-FLT预测OS效果优于TLG-FDG（总糖酵解）和TLP-FLT（总细胞增殖）。我们前期体内外研究^［11］发现，SUV_max-FLT可以预测接种胰腺癌患鼠的生存时间，而［¹⁸F］F-FLT的摄取量受肿瘤耐药性和GEM化疗的影响，其机制与平衡型核苷转运蛋白1（equilibrative nucleoside transporter 1，ENT1）和TK1有关。GEM化疗后ENT1表达增加抑制了TK1的表达，导致［¹⁸F］F-FLT摄取减少。本研究进一步发现，肿瘤生长中期与早期［¹⁸F］F-FLT PET/CT显像对比，ΔSUV_max-FLT能更准确地区分耐药胰腺癌。

研究还发现，肿瘤体积和生长速率对2种核素显像的SUV_max影响较大。这可能由于肿瘤早期生长较缓慢，缺氧不显著，SUV_max-FMISO和SUV_max-FLT相对较低；而处于快速生长期时，SUV_max-FLT显著上升，且随着耗氧量增加，内环境逐渐缺氧加重而使SUV_max-FMISO逐渐增高。这与PRETZ等^［33］和KAFKALETOS等^［34］的报道结果一致。本研究分双时期给予治疗并分别进行统计分析，减小了肿瘤体积和生长速率造成的干扰，但今后进入临床转化仍需探索标准化半定量参数，以便于对比评估。