肺癌是全球公共卫生领域的重大挑战，也是恶性肿瘤相关死亡的首要原因^［1-2］。肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）作为非小细胞肺癌的主要亚型，占所有肺癌的40%以上，占手术切除病例的70%以上^［3］；临床上，约75%的LUAD患者被确诊于晚期，且确诊后的治疗方式选择非常有限。近年来，尽管放射治疗、化学治疗和免疫治疗在LUAD治疗方面已取得了一定进展，但总体治疗效果并不理想，5年生存率仍较低^［4］。因此，探索LUAD的早期检测方法及晚期治疗策略仍然是目前亟需解决的关键问题。

真核生物基因组具有广泛的转录特性，可以产生大量的转录产物RNA，其中仅有极少的序列被作为模版翻译为蛋白质，其余则为非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）^［5-6］。长非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是长度大于200个核苷酸的ncRNA，绝大部分由RNA聚合酶Ⅱ（Pol Ⅱ）转录，并会被加帽、剪接和多聚腺苷酸化^［7］。根据lncRNA和蛋白质编码基因的相对位置，lncRNA可被分为基因间lncRNA（long intergenic noncoding RNA，lincRNA）和基因内lncRNA^［7］。其中，LINC00467作为典型的lincRNA分子，定位于人类1号染色体长臂32.3区带（chr1q32.3），介于肿瘤坏死因子受体相关因子5（tumor necrosis factor receptor associated factor 5，TRAF5）和视网膜变性蛋白3（retinal degeneration 3，RD3）两个基因之间；且该分子包含6个外显子，经可变剪接能够产生28种不同的转录本，最长的转录本由3 508个核苷酸组成。

相关文献提及，LINC00467在睾丸组织、多种恶性肿瘤中呈特异性高表达，最早在神经母细胞瘤中被发现，并被证明是N-骨髓细胞瘤癌基因（N-myelocytomatosis oncogene，N-Myc）的转录靶基因^［8］。作为重要的促癌lncRNA，LINC00467可通过3种主要机制参与多种肿瘤的发生与发展：① 作为miRNA分子海绵调控不同靶点，如在急性髓系白血病中调控miR-339/SKI（sloan-kettering institute）轴^［9］，在宫颈癌中靶向miR-107^［10］，在肺癌中靶向miR-20b-5p/CCND1（细胞周期蛋白D1，cyclin D1）促进肺癌细胞增殖^［11］，在肝癌中通过miR-509-3p/PDGFRA（血小板衍生生长因子受体α，platelet derived growth factor receptor alpha）影响药物敏感性^［12］等。② 通过蛋白质相互作用网络调控转录过程，如在肝癌中与胰岛素样生长因子2的mRNA结合蛋白3（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 3，IGF2BP3）结合以稳定TRAF5并激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路^［13］，在结直肠癌中调控CCND1等细胞周期蛋白的表达^［14］。③ 编码蛋白质，如编码94个氨基酸的功能性短肽，通过作用于ATP合酶促进结直肠癌增殖^［15］。

NF-κB信号通路作为调控炎症反应和肿瘤发生、发展的核心通路，能够被多种刺激激活并调控大量靶基因的表达，形成复杂的调控网络。研究^［16］表明，NF-κB通路与lncRNA存在密切互作，一方面NF-κB可调控lncRNA的表达，另一方面lncRNA可通过影响kappa B抑制因子激酶（inhibitor of kappa B kinase，IKK）复合物、NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）蛋白或核转位等环节调控NF-κB的活性。尽管前期研究揭示了LINC00467在多种肿瘤中的功能及作用机制，但其在LUAD中调控NF-κB通路的具体分子机制并不清楚。

基于此，本研究通过癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库的肿瘤样本分析以及转录组测序（RNA sequencing，RNA-seq）技术、RNA pull-down和免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，co-IP）等实验方法，探究LINC00467在LUAD进展中的作用及机制，以期为开发LUAD早期检测方法和晚期治疗策略提供参考和科学依据。

该部分的实验数据来自TCGA数据库。使用微生信网站（http：//www.bioinformatics.com.cn）分析泛癌中LINC00467的表达情况，比较癌症组织和正常组织、癌症组织和癌旁组织中LINC00467的表达；根据LUAD患者的病理分期，将其分为stage Ⅰ、stage Ⅱ、stage Ⅲ、stage Ⅳ共4组，统计LINC00467在各组中的表达水平。使用Kaplan Meier plotter生存分析网站（http：//kmplot.com/analysis），分析TCGA数据库中LUAD样本的转录组与患者总生存期（overall survival，OS）的相关性。

雄性Balb/c无胸腺裸鼠18只，SPF级，6~9周龄，体质量为16~18 g，购于上海吉辉实验动物饲养有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2022-0009。裸鼠饲养于上海交通大学医学院附属第九人民医院SPF级动物房，实验动物使用许可证号为SYXK（沪）2020-0025。动物房温度为25 ℃，相对湿度为50%~60%，明暗交替时间为12 h，水和饲料持续供应。

LUAD细胞系A549、H1299、PC9、H3122、H1975、HCC827，人支气管上皮细胞系16HBE和人胚肾上皮细胞系HEK 293T（简称293T），质粒构建使用的pLKO.1、pCMV-HA-N质粒，慢病毒包装中使用的dR8.9、VSVG质粒均为本实验室保存。

DMEM培养基、RPMI-1640培养基（上海源培生物科技有限公司），鼠源NF-κB p65抗体、鼠源p-NF-κB p65抗体、鼠源GAPDH抗体（Proteintech，美国），高保真PCR预混液（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），Streptavidin C1磁珠、Lipo3000细胞转染试剂盒（Invitrogen，美国），凝胶电泳仪、PCR仪（Bio-Rad，美国），超灵敏多功能成像仪（GE，美国），IncuCyte^TM活细胞成像分析系统（Sartorius，德国）。

A549、H1299、PC9、H3122、H1975、HCC827、16HBE细胞使用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的RPMI-1640培养基，293T细胞使用含10%FBS的DMEM培养基，均培养于37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱中。

为选取高表达LINC00467的LUAD细胞作为后续研究对象，我们使用TRIzol分别提取16HBE以及6种LUAD细胞的RNA，经浓度测定后反转录成cDNA并行实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）检测。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde -3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参基因，采用2-ΔΔCT法计算LINC00467的相对表达量。所用的引物序列见表1。

采用短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）技术进行细胞系构建。将特异靶向LINC00467的shRNA片段［shLINC00467-#1（TGCTCTGTAAACCACATAATAA）、shLINC00467-#2（TGGGGATTTGAATTTGAACATCT），生工生物工程股份有限公司合成］进行沸水浴自然降温的退火处理，形成具有黏性末端的双链产物，并连接至相同酶切位点的线性化pLKO.1质粒，以构建LINC00467敲低质粒（记为pLKO.1-shLINC00467-#1和pLKO.1-shLINC00467-#2）。不插入片段的pLKO.1质粒作为阴性对照（记为pLKO.1）。

将上述构建好的敲低质粒pLKO.1-shLINC00467-#1、pLKO.1-shLINC00467-#2及对照质粒pLKO.1分别与dR8.9、VSVG质粒按4∶2∶1的比例配置，转染至293T细胞中，4~6 h后更换培养基，48 h后收集含有慢病毒的上清液。将慢病毒上清液与培养基以1∶1的比例分别加入“1.3.2”中获得的高表达LINC00467的LUAD细胞（A549、H1299细胞）中，并加入聚凝胺（终浓度为8 μg/mL），24 h后更换新鲜培养基继续培养，48 h后加入嘌呤霉素（终浓度为2 μg/mL）筛选，并通过qPCR对敲低效果进行验证。

待“1.3.3”中获得的A549、H1299稳转细胞生长至80%~90%时，分别采用IncuCyte^TM活细胞成像、划痕实验、平板克隆形成实验对细胞的增殖、迁移、克隆形成能力进行分析，步骤如下：① IncuCyte^TM活细胞成像检测细胞增殖实验。以4×10³个/孔接种至48孔板中，设置3个重复。待细胞贴壁后，将48孔板置于IncuCyte™仪器中，在37 ℃、5% CO₂的条件下培养。间隔12 h对细胞进行1次拍摄，连续拍摄4 d，使用IncuCyte™软件分析细胞成像和增殖情况。② 划痕实验。将无菌的Culture-Insert 3 Well放置于6孔板中，制备5×10⁵个/mL的单细胞悬液。向小孔中加入细胞悬液，外侧加入培养基。平板放置于37 ℃、5% CO₂的条件下培养，待细胞贴壁后，使用无菌镊子移去Culture-Insert 3 Well，加入无血清培养基。将此刻计为0时，每隔12 h使用高内涵细胞成像系统进行拍照，直到有1株细胞划痕区域闭合，最后分析计算迁移速率。③ 平板克隆形成实验。以1×10³个/孔接种至12孔板中，放置于37 ℃、5% CO₂的培养箱中培养。14 d后取出细胞并使用PBS清洗，加入1 mL含有10%甲醇的结晶紫染料，固定染色15 min，将残余染料冲洗后晾干、扫描并拍照。使用Fiji/ImageJ（v2.35）处理图像，计算图像中克隆形成数量和面积，并根据以下公式计算克隆形成率：克隆形成率=克隆形成面积/总面积×100%。

将18只裸鼠分为3组，依次于皮下注射“1.3.3”中获得的A549稳转细胞及其对照，并记为control组、shLINC00467-#1组及shLINC00467-#2组。

对3组裸鼠的腋下进行消毒，于皮下注射matrigel与A549稳转细胞的1∶1混合液。注射4周后，使用异氟烷麻醉裸鼠，于IVIS^TM小动物活体成像系统中检测肿瘤荧光信号强度并拍摄荧光信号图。随后，使用颈椎脱臼处死裸鼠，取出皮下肿瘤块，并对其进行拍照和称重。

为探究LUAD细胞中受LINC00467调控的相关信号通路，我们使用“1.3.3”中获得的A549稳转细胞进行转录组测序，并对测序结果进行差异分析和富集分析。具体步骤如下：将细胞用TRIzol裂解后，由上海交通大学医学院附属瑞金医院进行建库、测序、比对，获得RNA-seq数据。使用R（v4.3.1）软件的limma包对RNA-seq数据进行差异分析。设置差异倍数（fold chang，FC）的对数的绝对值>2、P<0.05为阈值，筛选差异表达基因（differentially expressed gene，DEG），并使用Metascape网站（https：//metascape.org）对DEG进行hallmark gene sets富集分析。

考虑到NF-κB信号通路的富集最为显著，我们采用蛋白质印迹法（Western blotting）对A549稳转细胞中的该通路进行验证，具体操作参加说明书。其中，使用NF-κB p65或p-NF-κB p65作为一抗（工作浓度为1∶1 000），使用辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体为二抗（工作浓度为1∶10 000）。

为进一步阐明LINC00467促进NF-κB信号通路激活的具体机制，我们通过RNA pull-down实验对LINC00467的相互作用蛋白进行探索。本研究设计构建了含有SA aptamer、tRNA scaffold及LINC00467序列的RNA探针——tRSA-LINC00467（图1A）^［17］。其中，SA aptamer是一段特异性与链霉亲和素结合的RNA序列；tRNA scaffold作为一段辅助折叠装置，用以促进探针整体形成稳定的“三叶草”结构，增强其与链霉亲和素磁珠的结合能力。而在tRNA scaffold序列的3′端连接目的序列LINC00467后，即可获得RNA pull-down实验所需的功能性探针。

而后，向野生型A549细胞裂解液中添加30 μL strep磁珠，实验组继续向其中加入RNA tRSA-LINC00467、阴性对照组加入RNA LINC00467、空白对照组加入RNA tRSA并于4 ℃过夜，反应完毕后清洗磁珠3次（图1B），取1/3磁珠用于RNA检测，其余磁珠用于蛋白检测。取约20 μg洗脱的蛋白质提交至上海精准医学研究院质谱平台分析，并使用UniProt数据库中的人类（Homo sapiens）的蛋白质数据库进行比对与定量。

使用LFQ-analyst网站（https：//analyst-suite.monash-proteomics.cloud.edu.au/apps/lfq-analyst）对“1.3.8”中获得的蛋白质谱数据进行分析。

进一步地，采用co-IP对“1.3.9”中得到的LINC00467相互作用蛋白进行验证。具体步骤为：向已添加探针的实验组、阴性对照组、空白对照组（“1.3.8”中的pull-down实验）中添加蛋白CSNK2A2，而后继续按照“1.3.8”的实验步骤进行，以获取所有磁珠的蛋白，最终通过蛋白质印迹法进行检测。

本实验通过比较单独敲低LINC00467、单独过表达CSNK2A2、敲低LINC00467的同时过表达CSNK2A2来检测LINC00467相互作用蛋白与NF-κB通路的关系。具体步骤为：分别向“1.3.3”中获得的A549稳转细胞及对照细胞中加入能表达CSNK2A2的质粒及空载质粒，待4组细胞中的质粒表达后采用蛋白质印迹检测NF-κB p65及其磷酸化水平。

使用GraphPad Prism 9对所有数据进行统计分析。对于符合正态分布的资料，采用t检验进行2组间比较，单因素方差分析进行多组间比较；不符合正态分布的资料，采用Mann-Whitney U检验进行2组间比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。

对TCGA数据库中LINC00467的表达水平进行分析，结果显示，与正常组织（图2A）或癌旁组织（图2B）相比，LINC00467在LUAD等多数恶性肿瘤中显著高表达（P<0.05）。进一步，在LUAD不同病理分期中，LINC00467的表达均较高（P<0.001，图2C）。最后，生存分析的结果（图2D）显示，LINC00467高表达组患者的OS显著短于低表达组（P=0.004）。

利用qPCR对6种LUAD细胞的LINC00467表达进行检测，结果（图3A）显示，与人支气管上皮细胞16HBE相比，所有LUAD细胞中的LINC00467表达量均较高（P<0.001）。基于表达量较高且组间差异较小的特点，最终选择A549、H1299细胞用于后续稳定敲低细胞系的构建。随后，我们对已构建的敲低LINC00467细胞进行检测，结果（图3B、C）显示，LINC00467的表达量均有显著下降（P<0.001），即稳定敲低LINC00467的LUAD细胞——A549、H1299稳转细胞构建成功。

我们采用一系列实验对A549、H1299稳转细胞开展表型分析：① 采用IncuCyte^TM活细胞成像系统检测细胞的增殖能力，结果（图4A~D）显示，敲低LINC00467可抑制A549、H1299细胞的生长速度。② 平板克隆形成实验的结果（图4E~H）显示，敲低LINC00467显著降低了A549、H1299细胞的克隆形成数量。③ 细胞划痕实验的结果（图4I~L）显示，敲低LINC00467的A549细胞和H1299细胞划痕愈合速度明显减慢。

为进一步验证LINC00467在体内的生物学作用，我们开展了裸鼠皮下成瘤实验。结果显示，shLINC00467-#1组及shLINC00467-#2组的肿瘤荧光信号强度显著低于control组（图5A、B）；同时，其肿瘤重量和体积均显著小于control组（图5C~E）。

RNA-seq数据的分析结果（图6A）显示，敲低LINC00467共导致了339个基因显著上调，828个基因显著下调；同时，LINC00467下调显著降低了CCND1和高迁移率族蛋白A1（high mobility group AT-hook 1，HMGA1）的表达，这与已报道的LINC00467在LUAD中通过miR-20b-5p调控CCND1、在骨肉瘤中通过miR-217调控HMGA1的机制相一致^{［11，18］}。进一步，对DEG进行hallmark gene sets富集分析的结果显示，shLINC00467-#1组、shLINC00467-#2组与control组在基因表达模式上存在显著差异（图6B）；同时，在shLINC00467-#1与shLINC00467-#2组中，下调基因显著富集于NF-κB调控的肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNFα）信号通路和磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B-mammalian target of rapamycin，PI3K-AKT-mTOR）信号通路，而上调基因主要集中于缺氧通路及胆固醇稳态通路（图6C）。鉴于NF-κB和PI3K-AKT-mTOR通路在促进肿瘤细胞增殖和抑制凋亡中的关键作用^［19-20］，本研究发现LINC00467敲低导致的这2条通路活性被抑制与“2.3”中获得的细胞表型实验结果较吻合。

考虑到NF-κB信号通路的富集最为显著，我们对NF-κB通路富集到的基因进行qPCR检测，结果（图6D）显示这些基因在转录水平均出现了明显的降低。同时，我们还检测了LINC00467敲低后该通路中的关键分子NF-κB p65及其磷酸活化形式（p-NF-κB p65）的蛋白水平^［21］。蛋白质印迹及灰度值的统计结果（图6E~G）显示，LINC00467敲低可导致细胞内总NF-κB p65水平升高，约为对照组的2倍；而p-NF-κB p65/p65水平显著降低，约为对照组的1/4。综上所述，敲低LINC00467可抑制NF-κB信号通路的活性。

利用RNA pull-down联合蛋白质谱实验分析与LINC00467相互作用的蛋白。首先，采用qPCR对探针与磁珠的结合效率进行检测后发现，结合在磁珠表面的tRSA-LINC00467探针是空白对照组的50倍（图7A）。该结果表明，利用我们构建的tRSA-LINC00467探针对LINC00467相互作用蛋白进行分析检测是切实可行的。

随后，我们对tRSA和tRSA-LINC00467探针捕获的蛋白质进行质谱分析，筛选出实验组中显著富集的3个候选蛋白CSNK2A2、丝氨酸和苏氨酸重复矩阵1（serine and arginine repetitive matrix 1，SRRM1）和Y盒结合蛋白3（Y-box binding protein 3，YBX3）（图7B）。进一步地，co-IP的结果（图7C）显示，LINC00467与CSNK2A2存在相互作用。有研究^［22］显示，CSNK2A2还参与了包括NF-κB在内的多种信号通路的调控；我们推测，LINC00467可能通过结合并调控CSNK2A2来影响NF-κB p65的磷酸化。

接着，采用蛋白质印迹法对LINC00467相互作用蛋白与NF-κB通路的关系进行分析，结果（图7D）显示，单独敲低LINC00467的A549细胞中，NF-κB p65磷酸化水平有显著下调；单独过表达CSNK2A2，NF-κB p65磷酸化水平则显著上调；而敲低LINC00467的同时过表达CSNK2A2，下调的NF-κB p65磷酸化水平又出现了明显的上调。该结果提示，LINC00467可能通过CSNK2A2促进NF-κB p65的磷酸化，进而促进NF-κB通路的激活。

一直以来，LUAD在全球范围内的发病率和死亡率持续居高不下；其早期症状较隐匿，确诊时常伴随远处转移，严重影响治疗效果与预后。近年来的研究发现，lncRNA在LUAD的发生和进展中扮演着重要角色，可作为诊断和预后的生物标志物以及潜在的治疗靶点。尽管已有研究报道LINC00467在多种癌症的发生中具有促进作用，但其在LUAD中的具体功能及其分子机制仍有待进一步阐明。

本研究系统探讨了长非编码RNA——LINC00467在LUAD发生与发展中的作用及其潜在分子机制。通过对TCGA数据库中的肿瘤样本数据进行分析，发现LINC00467在LUAD组织中显著高表达，且其表达水平与患者OS呈负相关。体外细胞表型实验表明，敲低LINC00467会抑制LUAD细胞的增殖、克隆形成和迁移能力；体内裸鼠成瘤实验进一步验证了其对LUAD细胞的促瘤作用。继而提示，LINC00467可能作为LUAD的诊断和治疗潜在的靶标，对有效延长患者的生存时间、改善患者预后具有十分重要的意义。

作为lncRNA，LINC00467在多种肿瘤中可通过miRNA海绵作用、蛋白互作调控转录、编码功能性短肽这3种主要机制参与肿瘤的发生与发展。这些机制在不同癌种中既存在共性，又表现出一定的组织特异性。在肺癌中，已有研究证实LINC00467可通过吸附miR-20b-5p促进CCND1表达从而驱动细胞增殖^［11］，以及通过结合miR-4779/miR-7978增强肿瘤干细胞特性^［23］。本研究发现，在LUAD中LINC00467可与CSNK2A2相互作用，激活NF-κB信号通路，促进NF-κB p65磷酸化和肿瘤进展。这些结果不仅丰富了LINC00467的相互作用蛋白网络，更揭示了其在调控关键信号通路中发挥的保守作用模式。

NF-κB由促炎细胞因子激活，可诱导细胞增殖、抗凋亡基因表达，并通过诱导血管内皮生长因子表达促进血管生成，因此异常的NF-κB活性是肿瘤的标志^［20］。本研究的结果显示，与对照组相比，LINC00467敲低会导致细胞内总NF-κB p65水平升高。基于现有研究结果，我们推测这是一种代偿性调节机制。具体而言，当LINC00467表达下调时，磷酸化的NF-κB p65水平显著降低，这可能破坏了NF-κB信号通路的动态平衡。为应对信号转导效率的减弱，细胞可能通过激活负反馈调节机制，上调NF-κB p65表达以维持信号通路的稳态。这种精细的调控模式体现了细胞在应对基因表达扰动时维持信号通路稳态的适应性策略。NF-κB p65的磷酸化是NF-κB通路达到最佳活化状态至关重要的生物学过程^［24］；异常激活的NF-κB p65磷酸化是引起NF-κB活化改变的重要因素，是促进肿瘤发生与发展的主要因素^［24］。同时，磷酸化的NF-κB p65可以增强转录活性，延长核滞留时间，进而上调一系列抗凋亡、促增殖和促侵袭相关基因的表达。这些结果均提示LINC00467在LUAD细胞的NF-κB通路中发挥了重要作用。

综上所述，本研究为揭示LINC00467促进LUAD发生与发展的作用机制提供了新的线索。该研究结果不仅能够加深我们对LUAD的发生机制的理解，还可为LUAD的诊断和治疗提供新的理论依据和潜在靶点。