颞下颌关节作为颌面部唯一的双侧联动关节，参与咀嚼、言语、下颌运动等多种功能。65%~85%的人在一生中都会经历某种程度的颞下颌关节紊乱病（temporomandibular disorders，TMD）^［1］，颞下颌关节骨关节炎（temporomandibular joint osteoarthritis，TMJOA）是TMD的终末期，最早可见的改变是髁突表面侵蚀破坏，软骨下骨皮质损害；随着疾病进展，侵蚀破坏逐渐明显，当疾病发展进入修复阶段时，髁突前面变平^［2］。在TMJOA不同的发展阶段，患者会呈现相应的症状和体征，从而决定采用相应的治疗方式。动物模型是治疗方法研究的有效载体，如何简单、有效地建立不同发展阶段的TMJOA动物模型是针对性研究其治疗方法的重要前提。

TMJOA建模方法主要包括自然发生模型^［3］、外科手术模型^［4］、化学诱导模型^［5-6］、机械刺激模型^［7］和基因工程模型^［8］。其中化学诱导模型是以向关节腔内注射药物的方式进行，简单易实施，主要用于疼痛机制和治疗方法的研究^［9］。碘乙酸钠（monosodium iodoacetate，MIA）是一种代谢毒物，通过促进活性氧的产生，导致线粒体膜电位去极化，从而增强细胞色素c的释放，增加胱天蛋白酶‑3（caspase-3）的活性，导致细胞凋亡，使软骨和骨发生不可逆退化^［10］。

2012年，Wang等^［11］向大鼠颞下颌关节内注射了0.5 mg/50 μL MIA，在4周后发现关节髁突上出现软骨侵蚀伴软骨下骨破坏的典型TMJOA病变，但是此模型软骨下骨的破坏深度较浅，并且缺乏对软骨下骨参数的量化分析，仅可作为以软骨缺损为主要表现的模型。之后广泛的研究沿用此种建模方式^［12-14］，但观察三维重建结果可发现^{［11，13］}，此种建模常使软骨缺损局限于某一部位，不能很好地模拟患者TMJOA状态下髁突的改变。近期有学者提出了新的注射方式，但根据其小动物计算机断层扫描（micro computed tomography，micro-CT）图像^［15］，该TMJOA模型病变区域同样仅处于髁突的一侧。此外，经典模型的建模时间为4周，建模周期较长。近期有研究者在使用MIA 0.5 mg/50 μL 2周后即进行了实验药物的注射^［16］，也有学者加大了MIA的注射浓度以缩短建模时间，使用1.0 mg/50 μL进行注射，并在2周后观察到了软骨吸收现象^［17］。

因此，为了探究在短期内建立不同缺损深度的大鼠TMJOA模型，本研究拟改进注射方法，给予梯度MIA进行化学诱导，并对其建模效果进行分析评估，旨在为TMJOA不同发展阶段的药物研究提供快速、高效的动物模型建造方法。

18只6周龄左右健康的无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体质量200~250 g，购自上海必凯科翼生物科技有限公司。动物生产许可证号为SCXK（沪）2018-0006，使用许可证号为SYXK（沪）2021-0028。大鼠饲养于上海交通大学医学院附属第六人民医院SPF级动物房，环境温度22 ℃±2 ℃，12 h昼夜交替，自由饮食。

碘乙酸钠、戊巴比妥钠（Sigma，美国），生理盐水（碧云天生物技术有限公司），碘伏（可孚医疗科技股份有限公司），中性通用型组织固定液（武汉赛维尔生物科技有限公司），1 mL一次性使用无菌胰岛素注射器（BD，美国）。体视显微镜SMZ800N（Nikon，日本），SkyScan-1276小动物计算机断层扫描仪（Bruker，比利时），白光病理切片扫描仪（宁波江丰生物信息技术有限公司）。

分别采用传统注射方法与改良版注射方法向SD大鼠关节上腔内注入甲苯胺蓝染液50 μL，30 min后解剖，立即置于体视显微镜下观察。

改良版注射方法（图1）：先使大鼠侧卧，碘伏消毒注射侧耳屏前方无毛区域，用5 mL圆底离心管使大鼠处于半张口位；然后，一手触摸颧弓位置，寻找颧弓弯曲处最下后方点，另一手持注射器自耳屏前方无毛区域中心向颧弓最下后方点下约1 mm处刺入，注射器与水平面所呈角度约为45°，进针深度为8~9 mm，直达骨壁；最后，回抽无血后注射药液约50 μL。

将18只大鼠随机分为6组：对照组（NS组，生理盐水）及MIA1~5组（MIA浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/50 μL），每关节注射对应药液50 μL。每组3只，分笼饲养。3%戊巴比妥钠1 mL/kg腹腔注射麻醉^［18-19］，采用改良注射方法，分别向大鼠双侧关节上腔内注射50 μL药液，7 d后处死。

建模7 d后，切取大鼠双侧颞下颌关节髁突组织，去除周围软组织，置于生理盐水中清洗，以中性通用型组织固定液固定24 h。

使用体视显微镜对髁突进行大体观察，并在1×镜下拍照。

采用SkyScan-1276小动物计算机断层扫描仪对标本进行扫描，扫描参数为：X射线源电压为60 kVP，电流为200 µA，像素分辨率为18.0 µm。扫描结束后采用NR economic software version 1.6进行三维重建，使用DataViewer截取二维图像，使用CTAn软件分析髁突软骨下骨参数。

标本脱钙后包埋于石蜡中，沿髁突前后径连续切片，切片厚度为5 µm。随机选取切片进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色：切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，流水冲洗，苏木精染色3~8 min，流水冲洗，盐酸乙醇分化处理数秒，流水冲洗，氨水反蓝，流水冲洗，伊红染色1 min，脱水透明，中性树胶封片。番红O-固绿染色：固绿染色5 min，PBS洗去多余染液；浸泡于分化液中，PBS清洗；番红染色15 s，脱水透明，中性树胶封片。使用病理切片扫描仪进行图像采集，并使用改良Mankin评分^［20］对染色结果进行评价，从结构、细胞异常、基质染色三方面评估软骨退变。

使用GraphPad Prism10.4.1软件进行数据分析。实验数据以x±s表示。通过Shapiro-Wilk检验评估是否符合正态分布后，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行组间比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。

去除皮肤，可见使用传统注射方法的大鼠腮腺上缘软组织蓝染，而使用改良版注射方法的大鼠腮腺上缘蓝染区域明显较小；体视显微镜下观察，见两髁突均呈均匀蓝染状态。2种注射方式的染色对比见图2。

建模7 d后，体视显微镜下观察大鼠髁突，结果（图3）显示：NS组大鼠髁突表面完整、光滑连续，整体呈梭形；MIAl组髁突表面出现微小的浅凹；MIA2组髁突表面凹凸不平；MIA3组髁突表层出现明显的骨质破坏现象，且破坏范围约占髁突表面的1/2；MIA4组及MIA5组骨质破坏程度进一步加剧，且范围更大。

建模7 d后，Micro-CT结果显示：对照组大鼠髁突形态正常，表面连续，软骨下骨结构完整；MIA1组与MIA2组的大鼠髁突表面出现轻微缺损，软骨下骨骨小梁仍排列规整；MIA3组髁突表层的骨质缺损范围有所扩大，且缺损分布较为均匀；MIA4组和MIA5组则出现了严重的骨质破坏，其中MIA5组不仅骨小梁减少，且排列变得疏松。

骨参数分析结果显示：与对照组相比，MIA4组和MIA5组的骨体积分数（bone volume/total tissue volume，BV/TV）显著降低（P=0.039，P=0.019），骨小梁间距（trabecular separation/spacing，Tb.Sp）显著增大（P=0.030，P=0.003），且MIA5组的骨小梁数量（trabecular bone number，Tb.N）明显减少（P=0.004），差异均具有统计学意义（图4）。MIA3组的BV/TV和Tb.N相较于MIA2组略增高。

HE染色结果见图5。对照组展现出正常的软骨结构，从表面到深层依次为纤维层、增殖层、肥大层以及钙化软骨层。这4层结构完整，层次清晰，潮线平滑连续。MIA1组细胞数量轻度减少，纤维层次不够光滑；MIA2组的软骨结构层次不清，出现了无细胞区；MIA3组的结构紊乱，细胞数量明显减少；MIA4组和MIA5组的软骨层几乎不可见。番红O-固绿染色可见：对照组软骨基质中蛋白多糖（红染区）主要集中于肥大层，MIA1组的蛋白多糖变化不明显，MIA2组的染色开始逐渐变浅；MIA4组和MIA5组不仅软骨层缺失，且MIA4组的骨小梁变得稀疏，MIA5组的骨小梁数量明显减少。改良Mankin评分统计分析显示：MIA3、MIA4及MIA5组改良Mankin评分均高于对照组（P=0.008，P<0.001，P<0.001）。

本研究结果表明，当以1.5 mg/50 μL的浓度注射MIA，1周后即可观察到大鼠髁突软骨出现明显缺损；而当MIA浓度达到2.0 mg/50 μL及2.5 mg/50 μL时，1周后则能观察到软骨下骨有明显破坏。相较于以往利用MIA构建颞下颌关节骨关节炎模型的研究，本研究显著缩短了建模所需时间。研究^［21］以2.0 mg/50 μL的MIA浓度，在4周后才观察到髁突部分区域的软骨下骨遭到破坏，并且其研究缺乏BV/TV等骨参数分析结果。研究^［17］则以1.0 mg/50 μL的MIA浓度，在2周后发现髁突BV/TV、Tb.N显著降低，Tb.Sp显著升高，而本研究在2.0 mg/50 μL下，仅1周就观察到了更为广泛且深度相当的破坏。这一结果的出现，很可能归因于本研究实现了药物在大鼠关节腔内的有效注入。

颞下颌关节腔由关节盘分隔为关节上腔与关节下腔，其中下颌骨髁突是关节下腔的关键组成部分。要成功构建以髁突软骨和软骨下骨破坏为主要特征的TMJOA模型，关键在于将药液准确注入目标建模部位。然而，由于颞下颌关节区域的解剖空间较为狭小，药液很难直接注入关节下腔，因此，如何精确地将药液注入关节上腔，就成为了建模过程中的核心问题。

在过往有关TMJOA建模的研究中，注射方法暴露出诸多弊端。研究^［11］采用直径约为0.40 mm的针头向关节上腔内注射蓝色染液，解剖后发现腮腺上部区域出现蓝染现象，这表明存在药液流失的情况，其原因可能是所使用的注射针头过粗。研究^［21］表明，当大鼠处于闭口位时，颧弓会阻碍针头进入关节上腔，因此在注射时将大鼠置于侧卧位并使其张大口。然而，有研究表明，大鼠保持20 mm大张口状态持续1 min，可能会引发TMJOA早期类似的组织学改变^［22］。由此可见，选择合适、稳定且可重复的半张口位，并在此状态下快速注入药物是十分必要的。此外，以往的注射进针点均选取在毛发浓密的面颊部，若在注射前进行备皮操作，会增加建模的时间成本。而且，该部位皮肤质地相对坚韧，容易使精细的注射针头变钝，进而对深层组织造成损伤。

本实验着重对注射方式进行了优化改良。特意选用针头直径仅0.33 mm的1 mL胰岛素注射器，并将进针点精准设定在大鼠耳屏前方的无毛区域。该区域皮肤轻薄，且无毛发的干扰，这使得在注射过程中对组织的破坏程度得以显著降低，进而有效减少了注入液体的渗出量，大幅提升了关节腔内的药物浓度。此外，通过将5 mL圆底离心管巧妙放置于大鼠口腔内，成功使大鼠维持在稳定的半张口位。实验前期，借助甲苯胺蓝染液展开预实验，结果清晰显示，采用此注射方式后，皮下腮腺区几乎未见蓝染迹象，而关节区髁突软骨则呈现出均匀一致的染色效果。综合本实验的各项研究结果，多组大鼠髁突均呈现出均匀的骨质破坏，且破坏范围并未局限于某一局部区域。这一系列结果充分证实了该注射方式具备高度的可行性与优越性。

既往研究^{［11，15，21］}已证实，MIA诱导TMJOA的过程呈现出时间和剂量依赖性。这意味着，能够通过灵活调整实验周期以及MIA的浓度，来精准控制模型的缺损程度。此特性满足了本实验旨在特定时间内构建不同缺损程度TMJOA模型的需求。本实验结果进一步表明，随着MIA浓度的逐步升高，TMJOA的病变从最初的软骨缺损，逐渐发展至软骨下骨的破坏，清晰地展现出剂量依赖性特征。根据既往研究^［11］，当以0.5 mg/50 μL的MIA注入关节上腔，仅1周后，通过micro-CT扫描即可观察到髁突前部和中央的骨表面出现不连续现象。这表明在1周时0.5 mg/50 μL的MIA浓度便足以使软骨产生微小损伤。因此，本实验将周期设定为1周，最小剂量确定为0.5 mg/50 μL，并在此基础上依次递增药物浓度，进而细致观察髁突的破坏效果。在近期一项关于MIA诱导TMJOA动物模型的研究^［21］中，当注射浓度为2.0 mg/50 μL的MIA时，4周后可观察到髁突的破坏延伸至骨皮质下的骨松质。因此，本实验在该浓度基础上再增设1个浓度梯度，作为本实验的最高浓度。

在本实验micro-CT结果中，MIA3组的BV/TV和Tb.N值均略高于MIA2组，但差异无统计学意义。除实验误差以外，最可能的原因在于，在此特定浓度和时间节点上，髁突出现了修复反应。在TMJOA的病理进程中，伴随着髁突软骨及其下骨的生长和修复^［2］，TMJOA晚期骨赘的形成，便是骨质增生的表现。研究^［11］表明，0.5 mg/50 μL MIA注射后4周至12周，开始出现骨赘。TMJOA骨重建伴随成骨细胞与破骨细胞的代谢，成骨细胞直接参与软骨下骨硬化的形成，其特点是骨密度和体积有所增加^［23］。

本研究存在一定的局限性。实验设计为每组3只大鼠（双侧注射），样本量较小，后期需要大样本量来进一步验证实验结果。此外，实验主要呈现MIA短期内诱导年轻大鼠TMJOA的效果，该方法推广至老年大鼠的建模效果尚不明确。同时，本研究未检测大鼠痛觉，因此不可用作MIA短期诱导TMJOA的疼痛模型。

综上所述，本实验改进了TMJOA建模的注射方式，该注射方式有望保证关节腔内有效药物的浓度而缩短建模的时间。此外，通过使用不同浓度的MIA诱导大鼠TMJOA，并进行大体观察、组织学观察及影像学分析，证实了在建模时间为1周的情况下，1.5 mg/50 μL能够诱导软骨呈现典型的TMJOA表现，而软骨下骨松质无显著破坏，可用于构建以软骨缺损为主要病变的动物模型；而2.0 mg/50 μL MIA则适用于建立以软骨下骨破坏为主要特征的大鼠TMJOA模型。