乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染会引起慢性乙型肝炎，持续存在的炎症可能进展为肝硬化甚至肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）^［1］。HBV感染已被广泛认为是HCC的危险因素之一^［2］。2016年，全球有43.3%的肝癌归因于HBV，东亚人群中有53.4%的肝癌归因于HBV，甚至超过酒精（乙醇）和丙肝病毒等^［3］。虽然乙肝疫苗的普遍应用使乙肝的发病率得到有效控制，但HBV感染者的数量依然庞大。此外，HBV感染的治愈还有很大挑战：干扰素治疗短期有效，但易复发；核苷（酸）类似物治疗应用最广泛，但治疗3年才将复发率降低至30%^［4］。

HBV在宿主内的复制和表达依赖于宿主细胞的代谢，HBV病毒复制必然伴随着宿主细胞代谢的改变^［5］。我们发现HBV感染引起宿主血清中的脂质代谢异常^［6］。而脂蛋白是脂质在血液中存在、转运及代谢的形式，脂蛋白定量分析有助于了解血脂及其生物功能。一项基于75 619人的队列研究^［7］发现与 HBsAg（-）人群相比，HBsAg（+）人群更不易患非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD），在校正协变量后HBsAg（+）人群患NAFLD的风险比为0.83（0.73~0.94）。细胞实验和人群研究^［8-12］均表明HBV感染会造成脂蛋白和其他脂质代谢显著改变。HBV感染能抑制HepG2细胞中的载脂蛋白B（apolipoprotein B，Apo B）^［8］、Apo A5^［9］和Apo C3^［10］的表达。基于53 528名受试者的研究^［12］发现HBV感染与空腹血糖、血压、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-Ch）、三酰甘油（triacylglycerol，TAG）等代谢综合征的危险因素负相关。与870个对照人群相比，322个HBV感染者的HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-Ch）和TAG水平更低，且HBV病毒载量与TAG负相关^［11］。在60名加纳受试者中，HBV感染者的TAG、LDL、VLDL以及心血管风险水平更高^［13］。但另一项研究^［14］发现HBV感染人群的血浆TAG和CH水平与健康组间无差异。而最近关于HBV感染与脂蛋白亚类的研究发现HBV感染的普通肝病患者中的脂蛋白颗粒数（particle number，PN）如VLDL-PN、IDL-PN、LDL5-PN以及LDL6-PN水平更高，LDL亚类中的LDL1-PN、LDL2-PN、LDL3-PN以及LDL4-PN更低^［15］。上述研究说明脂蛋白亚类对HBV感染的应答各不相同，需进一步研究HBV感染对宿主脂蛋白亚类及其组分的影响规律。

脂蛋白亚类及其组分的定量分析方法众多，各有优势。其中，超速离心法^［16］是脂蛋白检测的金标准方法，但该方法存在时间长、效率低等问题；凝胶电泳法^［17］可将脂蛋白分成不同直径的亚类，但分辨率和重现性均有局限；离子迁移率法^［18］可依据不同颗粒的半径区分脂蛋白亚类，但对干扰十分敏感。而且上述方法均不能充分提供脂蛋白亚类中各组分的定量信息。最近发展的¹H-NMR分析方法快速、无损样品且具有良好的重现性，更重要的是可提供脂蛋白亚类及其组分的定量信息^［19］。因此，¹H-NMR法已成为大队列人群研究的首选。

为此，本研究通过对HBsAg（-）和HBsAg （+）人群的血清脂蛋白亚类及其组分进行¹H-NMR定量分析，研究HBV感染对宿主脂蛋白代谢的影响规律，为认识HBV感染的致病机制提供基础生物化学信息。

纳入2017年3—6月就诊于华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科的患者。纳入标准：①纳入HBsAg（+）人群为HBV感染者组（n=40）。②根据年龄、性别、冠心病史和糖尿病史按照1∶1匹配 HBsAg（-）人群作为对照组。排除标准：①恶性肿瘤患者。②使用他汀类或其他降脂药。

收集基线资料包括年龄、性别和疾病史等基础信息，使用Hitachi 7600全自动生化分析仪（Hitachi，Tokyo，Japan）和标准方法测量常规的血脂、血糖、肝肾功能等信息。

使用不添加任何抗凝剂或促凝剂的真空采血管收集空腹静脉血，室温放置30 min后，4 ℃，1 500×g离心10 min，将上清（血清）按500 μL/管转移至1.5 mL冻存管中，经过液氮速冻后储存于-80 ℃冰箱，代谢组分析前通过干冰运输至检测平台。

将存储于-80 ℃冰箱中的血清样本置于室温解冻（约30 min）后离心10 min（4 ℃，1 500×g）。每个血清样分别取320 μL于新的Eppendorf管中，加入320 μL磷酸盐缓冲液（0.085 mol/L，pH 7.4，含10% D₂O）后上下颠倒混匀5次，取600 μL混合液于5 mm核磁管中，上机检测。

本研究在Bruker 600 MHz NMR谱仪（Bruker Biospin，德国）上，使用NOESYGPPR1D脉冲序列采集¹H-NMR谱，使用Bruker IVDr Lipoprotein Subclass Analysis B.I.LISA™ 软件包（Bruker Biospin，德国）定量112个脂蛋白亚类指标^［20］。在此基础上，通过计算获得包括胆固醇酯和脂蛋白比值等在内的184个功能性脂蛋白指标，最终共定量296个脂蛋白亚类及其组分指标。这些指标中除了常规的极低密度脂蛋白（very low-density lipoprotein，VLDL）、中间密度脂蛋白（intermediate-density lipoprotein，IDL）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）和高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）总量外，根据密度大小将脂蛋白分为15个亚类，包括5个VLDL亚类（VLDL1~VLDL5）、6个LDL亚类（LDL1~LDL6）和4个HDL亚类（HDL1~HDL4），同时还获得包括TAG、总胆固醇（cholesterol，CH）、游离胆固醇（free cholesterol，FC）、胆固醇酯（cholesterol esters，CE）以及磷脂（phospholipids，PL）在内的5种脂质，载脂蛋白（Apo A1、Apo A2和Apo B）和颗粒数（particle number，PN），以及它们在各脂蛋白亚类中的含量。

多变量统计分析采用正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），数据的标准化使用UV标准化（unit-variance scaling，UV）处理，OPLS-DA模型的有效性验证采用7折交叉验证（cross-validation，CV）和基于交叉验证的方差分析（analysis of variance in the cross-validated residuals，CV-ANOVA），P<0.05为模型有效。多变量统计分析与作图使用SIMCA-P+软件（v12.0，Umetrics，瑞典）。单变量统计分析通过χ²检验（分类变量）、t检验或Wilcox秩和检验（连续变量）实现，结果以n（%）、x̅±s或变化百分比［percent change=（C_HBsAg（+）- C_HBsAg（-））/C_HBsAg（-）×100］表示，P<0.01为差异有统计学意义。多元逻辑回归分析用于评估每个代谢指标每增加一个标准差（per SD）的比值比（odds ratio，OR），以年龄、性别、糖尿病、高血压和冠心病为协变量进行校正，P<0.01表示差异有统计学意义。相关分析使用Spearman相关分析，结果用相关系数（r）表示，同时对相关系数进行假设检验，P<0.01为相关关系有统计学意义。套索算法（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）用于特征变量筛选，通过交叉验证法选取误差最小的λ值。多元逻辑回归分析用于构建诊断模型，受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）及其曲线下面积（area under the curve，AUC）用于评估HBV感染诊断模型的诊断价值。以上统计分析和作图均通过R程序（v4.0.5，https：//www.r-project.org/）和R studio软件（v1.2.5001）完成。

本研究共纳入40例HBsAg（-）和40例HBsAg（+）人群，其中有5例样本因乳糜血和溶血等原因导致脂蛋白定量不准而被剔除，最终纳入40例HBsAg（-）和35例HBsAg（+）人群进行分析，结果见表1。HBsAg（-）和HBsAg（+）人群在年龄、性别、疾病史（高血压史、糖尿病史、冠心病史）、谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GTP）、超敏C反应蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hsCRP）、同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）、肌酐（creatinine）、尿酸（uric acid，UA）、TAG和HDL-Ch等组成上差异无统计学意义。但HBsAg（+）人群中的CH和LDL-Ch水平低于HBsAg（-）人群，谷草转氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT）水平高于HBsAg（-）人群。

本研究在慢性乙肝患者血清中共定量296个脂蛋白亚类及其组分指标，其中24个指标因在各组中的缺失比例均高于20%而剔除，最终共272个代谢指标纳入后续分析。OPLS-DA得分图（图1A）显示，HBsAg（-）与HBsAg（+）2组间存在分离趋势，CV-ANOVA检验的P值为0.001，模型的预测效能Q²为0.229，说明HBsAg（-）与HBsAg（+）2组间的血清脂蛋白亚类及其组分存在差异。进一步通过单变量统计分析发现有42个脂蛋白亚类及其组分指标在2组间的差异具有统计学意义（P<0.01，图1B）。与HBsAg（-）人群相比，HBsAg（+）人群中除了VLDL5中的三酰甘油占总脂质的百分比［VLDL5-（TAG/LP）］和LDL5中的游离胆固醇占总脂质的百分比［LDL5-（FC/LP）］更高外，其他指标如Apo A2，总VLDL、VLDL1、VLDL2和VLDL3及其组分，IDL，总HDL、HDL3和HDL4及其组分，non-HDL中的脂质组分等水平均更低（P < 0.01，图1B）。

不进行协变量校正时（Model 1），有32个脂蛋白亚类及其组分指标与HBV感染显著关联（图1C）。其中Apo A2，总VLDL、VLDL1、VLDL2和VLDL3及其组分，IDL、HDL3、HDL4及其组分，non-HDL中的脂质组分是HBV感染的保护因素（OR<1，P< 0.01），而VLDL中的游离胆固醇占总脂质的百分比 ［VLDL-（FC/LP）］则是HBV感染的危险因素（OR>1，P<0.01）。在进一步校正年龄、性别、高血压、糖尿病以及冠心病因素后（Model 2），还有29个脂蛋白亚类及其组分指标与HBV感染显著关联（图1C）。总VLDL、VLDL1、VLDL2、VLDL3及其组分，IDL、HDL4及其组分，non-HDL中的脂质组分依然是HBV感染的保护因素（OR<1，P<0.01），而VLDL5中的三酰甘油占总脂质的百分比［VLDL5-（TAG/LP）］则是HBV感染的危险因素（OR>1，P<0.01）。另外，在校正协变量后，总VLDL中的组分（如VLDL-CH、VLDL-FC、VLDL-PN以及VLDL-Apo B）以及VLDL5-（TAG/LP）与HBV感染的关联性增强（OR与校正协变量前相比更接近0），而VLDL3-CE和VLDL-（FC/LP）与HBV感染的关联性略减弱（OR与校正协变量前相比更接近1，P在0.01~0.05间）。除此之外，校正协变量后与HBV感染显著关联的29个脂蛋白亚类及其组分指标中，除VLDL3-CH外，其余28个指标在HBsAg（-）和HBsAg（+）2组间的差异均具有统计学意义（图1D）。

采用Spearman相关分析进一步探索上述28个脂蛋白亚类及其组分指标与临床指标的关系。分组的相关分析结果显示临床检测的血脂指标（如TAG和HDL-Ch）与脂蛋白亚类及其组分强相关（图2A）。此外，在HBsAg（-）人群中，hsCRP与HDL4中的磷脂（HDL4-PL）、总脂质（HDL4-LP）和Apo A1（HDL4-Apo A1）呈较弱的负相关关系（图2A），相关系数r在-0.37~-0.30之间，P在0.01~0.05之间（图2B）。而在HBsAg（+）人群中，hsCRP与HDL4-PL、HDL4-TAG、HDL4-LP以及HDL4-Apo A1间存在更强的负相关关系（图2A），r在-0.71~-0.51之间，P≤ 0.002（图2B）。同时，在HBsAg（+）人群中还发现，尿酸（uric acid，UA）与总VLDL中的磷脂（VLDL-PL）、三酰甘油（VLDL-TAG）、总脂质（VLDL-LP），VLDL1中的磷脂（VLDL1-PL）、三酰甘油（VLDL1-TAG）、磷脂在总脂质中的百分比 ［VLDL1-（PL/LP）］，VLDL2中的磷脂（VLDL2-PL）间呈正相关（图2A），r在0.44~0.48之间，P≤ 0.008（图2B）。HBsAg（+）人群中的肌酐（creatinine）则与VLDL1中的三酰甘油（VLDL1-TAG）、磷脂（VLDL1-PL）以及磷脂在总脂质中的百分比［VLDL1-（PL/LP）］间呈正相关（图2A），r在0.44~0.50之间，P≤0.008（图2B）。但在HBsAg（-）人群中，脂蛋白亚类及其组分与UA和肌酐均无相关关系（r<0.25，P≥0.085，图2B）。

将上述28个脂蛋白亚类及其组分指标作为备选的特征变量，通过LASSO回归进行变量筛选后构建HBV患者的诊断模型。最终从28个脂蛋白亚类及其组分指标中筛选出6个指标作为特征变量，即HDL4-PL、VLDL1-（PL/LP）、VLDL1-（FC/LP）、VLDL5-（TAG/LP）、（VLDL+IDL）-PL和（VLDL+IDL）- TAG，利用筛选出来的6个特征变量构建逻辑回归模型，绘制ROC曲线，AUC为0.861，95%置信区间为0.777~0.944（图3A）。而利用5个协变量（年龄、性别、高血压、糖尿病以及冠心病）构建的模型的AUC为0.577（0.446~0.708），同时结合5个协变量和6个脂蛋白特征变量构建的模型的AUC为0.863，95%置信区间为0.780~0.946（图3A）。

本研究基于NMR脂蛋白分析方法定量分析了 HBsAg（-）和HBsAg（+）人群中296种脂蛋白亚类及其组分指标的水平，发现大部分脂蛋白亚类及其组分在HBsAg（+）人群中更低（图1B，3B）。校正年龄、性别、高血压、糖尿病和冠心病因素后，总VLDL、VLDL1~VLDL3及其组分，IDL、HDL4及其组分，non-HDL中的脂质组分依然是HBV感染的保护因素，而VLDL5中的TAG占总脂质的百分比［VLDL5-（TAG/LP）］则是HBV感染的危险因素。进一步通过LASSO回归筛选出6个脂蛋白亚类及其组分指标用于构建HBV感染诊断模型，AUC为0.861。

HBV感染会导致宿主循环系统脂蛋白中的脂质水平下降，也会影响宿主的胆固醇代谢（图3B~C）。研究发现HBV感染会导致宿主脂肪酸氧化增加，脂滴减少^［21］，且HBV感染导致患者血清中HDL、LDL和VLDL的合成下降^［22］。基于100对HBV感染和对照人群的脂质轮廓分析表明，HBV感染人群的总胆固醇、二酰甘油、HDL-Ch、VLDL-Ch、LDL-Ch和总脂质的含量均显著降低^［23］。而HBV感染者血清中的VLDL、IDL和LDL含量的减少可能与Apo B合成减少有关^［8］。本研究也发现大部分脂蛋白亚类及其组分在HBsAg（+）人群中含量更低。另外，在嵌合人肝脏的小鼠中发现HBV感染引起胆固醇代谢相关的基因上调^［24］，本研究发现HBsAg（+）人群中总VLDL、VLDL1~VLDL3和HDL4中的胆固醇类（如CE、CH和FC）含量更低，而LDL5中的游离胆固醇占总脂质的百分比［LDL5-（FC/LP）］含量更高，提示HBV感染可能引起宿主的胆固醇代谢失调。

此外，同一类脂蛋白的不同亚类间的变化趋势不同。HBV感染的普通肝病患者的IDL、LDL5和LDL6的颗粒数（PN）比正常对照组更低，而LDL1~LDL4的PN更高^［15］。类似地，本研究发现与 HBsAg（-）人群相比，VLDL1~VLDL3中脂质组分的含量在HBsAg（+）人群中更低，但VLDL4~VLDL5中的脂质组分无差异；HDL3~HDL4中的脂质组分在HBsAg（+）人群中更低，但HDL1~HDL2中的脂质组分并无差异。不同的是，本研究中的IDL和LDL的PN在2组间无差异，即使校正年龄、性别、高血压、糖尿病和冠心病因素后也无统计学意义，仅在总VLDL中发现PN（VLDL-PN）的含量更低。

有趣的是，HBV感染改变了脂蛋白亚类及其组分指标与临床指标的关联程度。本研究发现在 HBsAg（+）人群中的HDL4及其组分（HDL4-PL、HDL4-LP和HDL4-Apo A1）与炎症指标hsCRP之间呈现更强的负相关关系。HDL4是所有HDL亚类中颗粒最小、密度最大（密度范围：1.125~1.210 kg/L）的一类，其抗氧化能力更强，保护作用也更强^［25］。而且来源于小肠的HDL4可以直接进入门静脉，阻止Toll样受体4（Toll-like receptors，TLR）通过识别脂多糖产生炎症反应，从而减少肝脏损伤^［26］。因此，HDL4组分的水平一定程度能反映机体对炎症的反应程度。另外，虽然肌酐和UC水平在HBsAg（+）和HBsAg（-）2组间无差异，但在HBsAg（+）人群中，肌酐和UC与部分脂蛋白亚类及其组分指标的相关性更强（图2），说明HBV感染可能不会直接影响血清肌酐和UC的水平，但是会增强脂蛋白代谢与肌酐和UC代谢的关联。

本研究基于NMR脂蛋白定量技术分析了HBV感染者的血清脂蛋白谱，发现大部分脂蛋白亚类及其组分水平在HBsAg（+）人群中更低，且总VLDL、VLDL1~VLDL3及其组分，IDL，HDL4及其组分，non-HDL中的脂质组分是独立于年龄、性别、高血压、糖尿病和冠心病因素外的HBV感染的保护因素，而VLDL5-（TAG/LP）则是HBV感染的危险因素。此外，HBV感染不仅引起宿主胆固醇代谢异常，还增强了炎症指标与HDL4及其组分的相关性。脂蛋白亚类及其组分可用以区分HBV引起的表面抗原阳性患者。这些发现可为进一步认识HBV感染的致病机制提供基础生物化学信息。