肝细胞癌是原发性肝脏恶性肿瘤，发病率在所有肿瘤中位居第六^［1］。肝细胞癌的高发病率和高致死率使它成为全球第四大癌症相关致死疾病^［2］。棕榈酰化在肝癌的发生发展中发挥重要作用^［3-4］，肝癌组织与正常组织差异的锌指DHHC结构域（zinc finger aspartate-histidine-histidine-cysteine domain，ZDHHC）蛋白家族的蛋白酰基转移酶是一个含有保守结构域Asp-His-His-Cys（DHHC）的酶家族，通过将碳十六脂肪酸棕榈酸酯共价连接到底物蛋白特定半胱氨酸残基的硫醇基团来介导棕榈酰化^［5］。棕榈酰化酶在蛋白质定位、累积、分泌中稳定发挥重要作用^［6-8］。ZDHHC的异常表达参与了各种癌症的发生以及转移，严重影响了癌症患者的治疗和预后^［9］。免疫检查点的棕榈酰化，包括程序性死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）^［10］、程序性死亡蛋白配体1（programmed death ligand-1，PD-L1）^［11］。靶向PD-L1棕榈酰化使肿瘤细胞对T细胞杀伤敏感，抑制肿瘤生长，而且PD-L1棕榈酰化在稳定PD-L1中发挥重要作用^［12］。ZDHHC3的表达升高与乳腺癌中肿瘤生长增强和患者生存期降低相关^［13］。ZDHHC9失活提高N-Ras驱动的白血病治疗效果^［14］，也促进乳腺癌的免疫治疗应答。棕榈酰酶家族抑制剂水解酶结构域的蛋白17（α/β hydrolase domain-containing protein 17，ABHD17）诱导急性髓性白血病细胞中的N-Ras去棕榈酰化，对N-Ras突变的细胞抑制作用显著^［15］。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，同时也可以调控ZDHHC相关酶的表达^［16］。然而，ZDHHC蛋白在肝细胞癌中的表达模式、预后价值和生物学功能尚未系统阐明。本研究利用肝癌数据库对ZDHHC在肝细胞癌中的表达进行了全面的生物信息学分析，旨在为临床医师选择合适的治疗靶点和药物提供更多理论支持。

从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）下载基因组数据共享（Genomic Data Commons，GDC）网站（https：//portal.gdc.cancer.gov/）获取424例肝癌样本的RNA测序数据（包含50例正常组织和374例肝癌样本）和患者的临床资料，删除没有生存时间的样本，删除年龄、性别以及临床分期不全的样本，最终得到370例用于后续分析。

应用R语言limma软件包筛选正常组织与肿瘤组织差异的ZDHHC，设定FDR<0.001，Pearson相关性分析筛选ZDHHC相关的lncRNA（相关系数大于0.5，P<0.01）。使用survival包对lncRNA进行单因素Cox回归分析，将单因素COX回归分析结果中P<0.001的lncRNA纳入多因素COX回归分析。同时采用LASSO逐步回归进一步筛选自变量，构建基于lncRNA表达的风险评分公式，即风险分数=∑lncRNA表达值×风险系数。

通过单因素和多因素COX回归分析肝癌预后的独立风险因素。用R语言rms软件包建立nomogram预测模型，所有独立预后参数和相关临床参数都被纳入，采用逐步COX回归模型构建预后列线图，用来预测患者1、3和5年的总生存期（overall survival，OS），对列线图的预测效能进行检验。利用TIDE算法^［17］预测患者对免疫治疗的应答水平。

采用GraphPad Prism 9.0软件进行数据分析和处理。采用Student's t检验进行基因差异表达分析。通过绘制Kaplan-Meier曲线，统计高、低风险组患者生存期，采用Log-Rank检验评估2组患者生存曲线的差异。采用COX比例风险回归模型评估各因素对预后的影响，行单因素分析和多因素分析，计算风险比（hazard ratio，HR）及其95%置信区间（confidence interval，CI）。计算5年受试者操作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC curve）中各点的敏感度和特异度之和，取最大点对应的风险评分作为临界值来区分风险等级。计算风险模型1、3和5年曲线下面积（area under the curve，AUC）值，并结合校准分析以判断模型预测生存的准确性。P<0.05表示差异有统计学意义。

如图1所示，ZDHHC3~ZDHHC9、ZDHHC11~ ZDHHC14、ZDHHC16~ZDHHC18以及ZDHHC20~ ZDHHC24共19个ZDHHC在肝细胞癌组织中的表达显著高于正常组（图1A、B，t为5.475~11.254，均P<0.05），而ZDHHC19在肝细胞癌中表达低于正常组（图1B，t=7.258，P<0.05）。其中，高表达ZDHHC7、ZDHHC18和ZDHHC23的患者OS相比于低表达患者的OS明显减少（图1C，HR为0.48~2.00，均P<0.05），而低表达ZDHHC19患者的OS相比于高表达ZDHHC19的患者OS明显增加（图1C，HR=0.62，P=0.010）。同时，ZDHHC17和ZDHHC23的高表达与无进展生存期（progression-free survival，PFS）呈负相关（图1C，HR为0.60~1.56，均P<0.05）。

棕榈酰化基因关联的lncRNA共计656个（图1D，均相关系数>0.5且P<0.001），单因素COX回归筛选出影响肝癌生存期的22个棕榈酰化相关lncRNA（图1E）。结合生存时间、状态和lncRNA表达采用LASSO回归分析，在模型达到最小λ后（图2A），构建了一个3个棕榈酰化相关lncRNA（AC026356.1、AC026401.3和POLH-AS1）组成的风险预测模型，风险模型分数=0.662 6×AC026356.1+0.213 9×AC026401.3+0.405 6×POLH-AS1。参照风险模型运算公式计算出每个肝癌患者的风险值，取中位数将患者划分为高风险组和低风险组（图2B、C）。生存分析发现，高风险组的OS和PFS明显低于低风险组（图2D、E，均P<0.05）。

ROC曲线评估风险模型的敏感度和特异度，AUC为0.730（图3A）。计算一致性指数（consistency index，C-index）判断模型的准确性（图3B），显示依据棕榈酰化蛋白ZDHHC相关的lncRNA建立风险模型准确性较高。单因素分析发现分期和风险评分可作为危险因素（图3C），多因素分析显示分期和风险评分同样可以作为独立的危险因素（图3D）。风险评分与患者的预后独立相关（HR=1.375，95%CI 1.208~1.566）。

为探讨风险模型在临床中的应用价值，本研究整合了患者的临床特征并将风险评分纳入多变量Cox回归分析构建列线图（图4A），根据临床指标和风险评分预测患者的生存时间，通过AUC曲线和校准提示该模型预测生存的准确性较高（图4B、C）。

棕榈酰化通过改变肿瘤微环境影响肿瘤免疫治疗^［18］。因此，本研究评估了高、低风险组的免疫功能，其中二型干扰素应答（type Ⅱ interferon response）、抗原呈递共刺激（antigen presenting cell co-stimulation，APC co-stimulation）、趋化因子受体（chemokine receptor，CCR）、T细胞共刺激因子（T cell co-stimulation）等多个免疫通路在高、低风险组存在显著差异（图5A，t为8.247~14.851，均P<0.05）。进一步利用TIDE数据库（http：//tide.dfci.harvard.edu/）预测高低风险组对免疫治疗的应答水平，预测结果显示，低风险组对免疫治疗的应答水平显著高于高风险组（图5B，t=7.472，P<0.05）。综上所述，高危人群之间的免疫状态完全不同，提示靶向棕榈酰化相关分子结合肝细胞瘤免疫治疗具有一定的临床意义。

棕榈酰化是蛋白质翻译后修饰的一种，其中棕榈酸酯通过硫酯连接与绝大多数半胱氨酸残基共价连接（也称为s-棕榈酰化）。棕榈酰化通过影响蛋白膜锚定、转运、相互作用和降解，在人类生理和病理过程中发挥重要作用。ZDHHC家族不仅调节正常的生理过程，而且参与癌症的发生发展。敲低ZDHHC5、EZH2的棕榈酰转移酶，可显著抑制胶质瘤肿瘤的生长^［19］。越来越多的研究表明棕榈酰化或棕榈酰转移酶可能成为癌症治疗的新靶点^［20］。LIU等^［20］发现ZDHHC2、3、6、14、15、21及23在肾透明细胞癌中表达下调，且ZDHHC低表达与不良预后相关。本研究发现多数ZDHHC蛋白在肝细胞癌样本中表达异常，其中ZDHHC23在肝癌中表达显著升高。高表达ZDHHC23也提示不良预后。ZDHHC23在胶质瘤中表达异常，靶向ZDHHC23能够抑制胶质瘤细胞的恶性表型。因此，进一步了解肝细胞癌中ZDHHC的表达模式和功能机制，对未来靶向ZDHHC治疗肝癌有重要意义。

本研究检测在肝癌样本和正常样本差异表达的ZDHHC蛋白相关的lncRNA，发现ZDHHC与656个lncRNA的表达具有显著相关性（均P<0.05）。其中有22个lncRNA可作为不良预后的标志物，利用LASSO回归优化筛选指标，筛选出3个影响预后的lncRNA。lncRNA POLH-AS1和AC026401.3在多个构建肝癌风险模型的研究中也被筛选出^［21-22］，说明这2个lncRNA对于肝癌患者的预后发挥重要作用，但是这2个lncRNA的细胞学功能以及表达的临床意义需要进一步实验验证。本研究采用的LASSO回归计算模型纳入最小因素是在模型预测中广泛使用的。XU等^［4］鉴定了24个与铁死亡相关的差异表达lncRNA，使用LASSO算法和Cox回归模型从TCGA训练数据集和GEO测试数据集构建和验证预后风险评分模型；基于9个lncRNA（CTD-2033A16.3、CTD-2116N20.1、CTD-2510F5.4、DDX11-AS1、LINC00942、LINC01224、LINC01231、LINC01508和ZFPM2-AS1）构建风险模型，为患者的预后和免疫反应提供了个性化的预测工具。本研究将所有样本作为训练集，构建模型的样本足够大。虽未进行外部数据集验证，但是将临床特征与风险分组进行了多因素Cox回归分析，显示即使纳入其他临床变量后，风险分组仍然可以作为独立预后因素。因此，基于ZDHHC相关lncRNA构建的风险模型对于免疫治疗的选择可发挥重要作用。

尽管该模型对于肝癌的免疫治疗具备临床指导作用，但依然存在几个局限性。首先，虽然筛选出的lncRNA（AC026356.1、AC026401.3和POLH-AS1）在TCGA肝癌数据中体现了预后价值，但缺乏大样本的外部数据集进一步验证。其次，本研究是以预后和临床表征构建的风险模型，排除了一些差异更为显著的lncRNA，这降低了模型的预测价值。第三，缺少lncRNA相关的生物功能依据，不能体现对棕榈酰化过程的作用，因此还需要更多的实验证据。

综上所述，棕榈酰化相关lncRNA可能在肝癌的发生发展中发挥重要作用。基于lncRNA构建的风险模型可较为准确地预测出肝癌患者的1年、3年、5年生存时间，并结合免疫细胞浸润水平比较高、低风险组的免疫治疗应答水平，为肝癌患者提供新的免疫治疗策略。