胆囊癌是一种常见的胆道恶性肿瘤，现已成为全球消化道肿瘤发病率排名第五的恶性肿瘤^［1］。我国属胆囊癌高发地区，且近年来发病率持续上升^［2-3］。由于胆囊癌发病隐匿，早期无特异性临床表现，但侵袭性强，进展迅速，诊断时往往已达晚期，手术切除率低，术后易出现复发和远处转移，预后较差，5年生存率仅5%~15%^［4-6］。根据国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）2020年全球癌症数据库^［7］，每年胆囊癌新发病例占所有肿瘤的0.6%，死亡病例则占所有癌症死亡人口的0.9%。因此，推进对胆囊癌的相关研究，寻找新的胆囊癌标志物和治疗靶点，对于提高胆囊癌诊疗水平显得愈发重要。

BRCA（breast cancer susceptibility gene）基因家族在DNA损伤修复中发挥着重要作用。其中，BRCA1参与激活双链断裂修复和同源重组，还可通过调控转录及细胞周期来影响DNA损伤修复过程^［8］。BRCA1突变分为生殖系突变（体内所有细胞均存在突变）和体细胞突变（仅在肿瘤细胞中检测到BRCA1突变）。目前已有许多研究表明，BRCA基因家族生殖系突变与前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等许多肿瘤的发生和发展密切相关^［9-11］。其中BRCA1生殖系突变是已知的最有可能导致女性家族性乳腺癌和卵巢癌的遗传因素，且与不良预后相关^［12-14］。BRCA1的体细胞突变发生率低于生殖系突变。也有研究^［15-16］表明在卵巢癌等肿瘤中，体细胞突变患者发病年龄更晚，但在治疗敏感性和无进展生存时间上与生殖系突变患者无明显差异。还有的研究^［17-18］发现，在其他一些肿瘤，BRCA1突变有促进增殖与抑制凋亡的作用。

对于BRCA1突变的肿瘤，存在同源重组修复异常，而使用聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制剂能够抑制DNA损伤修复过程，造成DNA双链断裂，继而引起修复混乱，通过“合成致死”效应达到促进肿瘤细胞凋亡的目的^［19-20］。在此前的临床工作里，我们收治了1例BRCA1 R1325K（第1325位精氨酸变为赖氨酸）生殖系突变胆囊癌患者；该患者使用PARP抑制剂奥拉帕利（Olaparib）后肿瘤缩小降期，达到R₀切除，成功实现了转化治疗。目前，在胆囊癌中，尚无BRCA1 R1325K突变及其作用的相关报道。基于上述基础，本研究拟进一步探索BRCA1及其R1325K突变对于胆囊癌细胞增殖及凋亡的影响。

胆囊癌细胞系GBC-SD和NOZ均为本实验室保存。使用GV705载体构建添加Flag标签及嘌呤霉素抗性基因但不含有目的基因的对照过表达慢病毒载体（Vector）、BRCA1野生型过表达慢病毒载体及BRCA1 R1325K突变过表达慢病毒载体，并包装慢病毒（由上海吉凯生物科技有限公司完成）。

抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、α微管蛋白（α-tubulin）抗体、Flag抗体、cleaved PARP抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体（美国Cell Signaling Technology公司），BRCA1抗体（武汉三鹰生物技术有限公司），CCK8试剂盒（翊圣生物科技上海有限公司），一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光）、苯甲基磺酰氟（PMSF）（上海碧云天生物技术有限公司），Olaparib（美国MedChemExpress公司），中强度RIPA裂解液、5×上样缓冲液（上海雅酶生物科技有限公司）。

光学倒置显微镜（日本Nikon公司）；Leica倒置荧光显微镜DM2500［徕卡显微系统（上海）贸易有限公司］；美国MD SpectraMax 190全波长酶标仪［美谷分子仪器（上海）有限公司］；5424R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；ChemiDoc XRS+凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

选用GBC-SD和NOZ胆囊癌细胞系，分别用BRCA1野生型及BRCA1 R1325K突变过表达慢病毒颗粒感染，构建相应的胆囊癌稳转细胞系，并使用相应的阴性对照慢病毒构建对照胆囊癌稳转细胞系。具体如下：在六孔板中，每孔接种约1×10⁵个细胞，待细胞生长至约70%融合度后，按慢病毒感染复数（MOI）为10加入BRCA1野生型或BRCA1 R1325K突变过表达慢病毒载体感染，48 h后更换为含5 μg/mL嘌呤霉素的培养基（DMEM培养基+10%胎牛血清）进行抗性筛选，每日观察细胞生长情况，7 d后通过Western blotting验证目的蛋白BRCA1的表达情况。

刮取筛选后的细胞，使用含1% PMSF的RIPA裂解液和超声破碎仪充分裂解细胞。4 ℃、14 000×g离心15 min后吸取上清液，加入上样缓冲液，100 ℃加热10 min。使用7.5%凝胶，上样10 μL进行电泳（130 V，80 min），电泳结束后，冰浴下转至PVDF膜（转膜条件：100 V，200 min）。转膜结束后使用5%脱脂奶粉封闭1 h，洗净脱脂奶后分别滴加BRCA1一抗和α-tubulin一抗（均为1∶1 000稀释），4 ℃孵育过夜，次日PBST洗膜3次，每次10 min；加入辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育1 h，PBST洗膜3次，每次10 min；滴加显影液于PVDF膜上，ChemiDoc XRS+凝胶成像系统曝光并观察条带。

细胞分为对照组（Vector组）、BRCA1野生型组（BRCA1 wt组）和BRCA1突变组（BRCA1 mut组）和BRCA1 mut+Olaparib组。将细胞消化后进行计数，吹打均匀后按1 200个/孔均匀铺于96孔板中，每孔培养基（DMEM培养基+10%胎牛血清）总量100 μL。待细胞贴壁后，BRCA1 mut+Olaparib组更换为含20 μmol/L Olaparib的新鲜全培养基，其他组更换为新鲜全培养基，并分别在细胞贴壁后0、24、48、72、96 h时，用CCK8试剂盒进行检测。具体方法为：吸净待测孔的培养基，每孔加入100 μL无血清培养基和10 μL CCK8检测液，37 ℃避光孵育2 h，用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值。每组设置5个复孔。实验数据用Graphpad Prism 9软件绘制折线图。

将Vector组、BRCA1 wt组、BRCA1 mut组和BRCA1 mut+Olaparib组细胞消化后进行计数，轻柔吹打均匀使之分散成单个细胞，并按600个/皿铺于35 mm培养皿中。待细胞贴壁后，BRCA1 mut+Olaparib组更换为含20 μmol/L Olaparib的新鲜全培养基，其他组更换为新鲜全培养基。每3日更换1次对应的新鲜全培养基，每日光学倒置显微镜下观察细胞的增殖情况。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，吸净培养基，每皿用PBS洗2遍后加入4%多聚甲醛，固定30 min后用结晶紫染色，洗净结晶紫后拍照，光学倒置显微镜下计数大于10个细胞的克隆数并用Graphpad Prism 9软件绘制柱状图。

使用Vector组、BRCA1 wt组、BRCA1 mut组和BRCA1 mut+Olaparib组细胞制作细胞爬片。制作完成后，用PBS清洗1次，加入4%多聚甲醛固定30 min后，PBS清洗1次，加入含0.3% Triton-X的PBS室温孵育5 min，PBS清洗2次。按照试剂盒所示比例配置检测液（TdT酶∶荧光检测液=1∶9），每片细胞爬片滴加25 μL检测液，4 ℃摇床避光孵育过夜，次日PBS清洗3次，用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂进行封片。封片后37 ℃避光孵育45 min，于荧光显微镜下观察，分别拍摄DAPI染色图像（曝光时间20 ms）和TUNEL染色图像（曝光时间400 ms），并使用Image J软件进行合并。计算凋亡细胞比例并用Graphpad Prism 9软件绘制柱状图。

刮取细胞，分别置于1.5 mL离心管中，洗净残余培养基，加入100 μL含1% PMSF的RIPA裂解液，吹匀后，用超声破碎仪充分裂解细胞。4 ℃、14 000×g离心15 min后吸取上清液，加入上样缓冲液，100 ℃加热10 min。使用10%电泳凝胶，上样10 μL进行电泳（130 V，65 min）。电泳结束后，冰浴下转至PVDF膜（转膜条件：100 V，100 min），转膜结束后使用5%脱脂牛奶封闭1 h。洗净后分别滴加cleaved PARP一抗、Bcl-2一抗、Bax一抗和GAPDH一抗（均为1∶1 000稀释），4 ℃孵育过夜，次日PBST洗膜3次，每次10 min；之后加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，再次PBST洗膜3次，每次10 min；之后滴加显影液于PVDF膜上，ChemiDoc XRS+凝胶成像系统曝光并观察条带。再用Image J软件进行灰度分析，并用Graphpad Prism 9软件对相对蛋白表达量进行统计作图。

采用SPSS 22.0软件进行数据统计分析。定量资料用x¯±s表示。组间比较采用独立样本t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

用Western blotting对GBC-SD和NOZ细胞系Vector组、BRCA1 wt组及BRCA1 mut组目的蛋白BRCA1的表达情况进行验证。如图1A及B所示，对照过表达慢病毒载体感染的GBC-SD和NOZ细胞（Vector组）几乎无内源性BRCA1表达，BRCA1野生型慢病毒及BRCA1 R1325K突变慢病毒感染后的细胞（BRCA1 wt组、BRCA1 mut组）则有相应野生型或突变型BRCA1蛋白的稳定表达，且表达量较高。

BRCA1野生型和突变型胆囊癌稳转细胞系在Olaparib处理0、24、48、72、96 h后进行CCK8检测。如图2A、B所示，在GBC-SD和NOZ细胞中，BRCA1 wt组的细胞增殖能力与Vector组相比差异没有统计学意义（均P>0.05），而BRCA1 mut组的细胞增殖能力较Vector组明显增强（均P<0.05）；但在加入20 μmol/L Olaparib（适用于BRCA1/2突变的靶向药）处理96 h之后，BRCA1 mut组GBC-SD和NOZ细胞的增殖能力均受到了显著抑制（均P<0.05）。

如图3A~D所示，克隆形成实验结果提示：与Vector组相比，过表达野生型BRCA1基因对胆囊癌GBC-SD和NOZ细胞的克隆形成能力无明显影响；但BRCA1 mut组相较于Vector组和BRCA1 wt组，胆囊癌细胞的克隆形成能力均明显提高（P<0.05）；在加入20 μmol/L Olaparib后，BRCA1 mut组胆囊癌细胞的克隆形成能力显著下降（P<0.05）。

根据文献^［21］报道，BRCA1的高表达在某些肿瘤中可促进凋亡，而其突变则能产生抑制凋亡的作用，故我们用TUNEL实验对胆囊癌细胞GBC-SD和NOZ的凋亡情况进行了检测。如图4A~D所示，Vector组胆囊癌细胞未见明显凋亡，在过表达野生型BRCA1

后，可观察到细胞出现部分凋亡，而过表达BRCA1 R1325K突变则未见细胞凋亡，表明过表达野生型BRCA1可以促使胆囊癌细胞系发生凋亡，而突变型BRCA1无此效应。但在加入20 μmol/L Olaparib处理后，BRCA1 mut组重新出现凋亡现象。

进一步，我们用Western blotting对于BRCA1 R1325K突变前后的凋亡相关蛋白的表达情况进行了检测。如图5A和B所示，相较于BRCA1野生型，过表达突变型BRCA1后，cleaved PARP及促凋亡蛋白Bax的表达量降低，凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达量升高，提示BRCA1 R1325K突变后的胆囊癌细胞有一定的抗凋亡能力。而加入20 μmol/L Olaparib处理后，Bcl-2的表达量则降低，并且cleaved PARP及Bax的表达量升高。综上所述，初步认为，野生型BRCA1的过表达会促使胆囊癌细胞发生凋亡，BRCA1 R1325K突变则能够产生抗凋亡的作用。

作为胆道系统最常见的恶性肿瘤，胆囊癌起病隐匿，手术依然是其主要的治疗手段。但胆囊癌早期临床症状不典型，多数患者就诊时即已失去手术切除的机会，局部进展、转移性或复发患者只能进行化学治疗（化疗）及其他综合治疗，目前大多难有令人满意的疗效和预后。靶向药物和免疫治疗通过各种机制起到抑制和杀伤肿瘤的作用，其中分子靶向治疗具有特异性强、不良反应小的特点，在多种实体瘤的治疗中发挥了巨大作用。但目前胆囊癌缺乏特异性分子标志物，对于潜在的靶向药物敏感度较低，因此特异性肿瘤标志物的寻找将为胆囊癌的靶向治疗提供新的方向，具有十分重要的意义。

BRCA家族基因是一种十分重要的抑癌基因，其高表达在某些肿瘤中有抑制增殖与促进凋亡的作用^［21-24］。其他研究^［9-11］表明，BRCA家族基因突变与乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、宫颈癌等肿瘤的发病密切相关。Olaparib是美国食品和药物管理局（FDA）批准的靶向BRCA1和BRCA2（BRCA1/2）突变的药物，被称为聚ADP-核糖聚合酶抑制剂（PARPi）。在临床试验中，PARPi改善了包括乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌在内的多种BRCA1/2突变肿瘤患者的预后^［25-29］。我们在前期的临床工作中发现了1例BRCA1 R1325K突变的胆囊癌病例，该患者肿瘤进展较其他无突变的胆囊癌患者迅速，但对于靶向药Olaparib反应良好，在口服Olaparib之后，肿瘤缩小降期并成功实现了R₀切除，达到了转化治疗目的。基于此，我们对于BRCA1 R1325K在胆囊癌发生和发展的作用产生了兴趣，进而使用胆囊癌细胞系GBC-SD和NOZ构建了相应的稳转细胞系，再通过CCK8、Western blotting、TUNEL等实验验证了BRCA1 R1325K突变对胆囊癌发生和发展的促进作用；同时探究了抑制剂Olaparib对BRCA1 R1325K突变胆囊癌的抑制作用，这些也为相似临床病例的治疗提供了一定的借鉴。

目前，BRCA1突变在胆囊癌中的研究仍属罕见，且多为临床病例，已有报道的位点如BRCA1 Q858*^［30］、BRCA1 p. S451Lfs*20^［31］等，但R1325K位点突变尚属首例。本文从细胞层面，对BRCA1 R1325K突变促进胆囊癌发生和发展的作用进行了验证，并发现其能够升高凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达、降低促凋亡蛋白Bax的表达，为进一步探究BRCA1 R1325K突变促进增殖及抑制凋亡的具体机制奠定了基础。根据既往文献报道，BRCA1参与转录调节过程，能够与p53蛋白的C端区域结合，形成复合物并能作为共激活分子调控其下游基因的表达^［32］，其对PI3K/Akt通路也有调节作用^［33-34］。我们已发现BRCA1 R1325K突变能够影响Bcl-2/Bax的表达，而p53、PI3K/Akt也能够直接或间接调控Bcl-2/Bax的表达^［35-39］。由此我们推测，BRCA1 R1325K可能是通过上调p53表达或激活PI3K/Akt信号通路等机制调节Bcl-2、Bax及其下游通路分子如Cyt-C、Caspase-3等相关蛋白的表达，从而抑制胆囊癌细胞的凋亡，这与为我们后续的机制探索提供了一定的思路。

总之，本研究发现BRCA1 R1325K能够促进胆囊癌增殖并抑制其凋亡，这一效应能够被Olaparib所抑制，这为胆囊癌发生和发展机制的探究提供了新思路，也为胆囊癌的临床治疗提供了新的靶点。而在后续的工作中，我们将进一步深入探究BRCA1 R1325K突变促进胆囊癌细胞增殖并抑制其凋亡的具体机制，并结合体内实验和临床样本验证，同时联合多中心收集病例，开展相应的临床研究，或许有望找到胆囊癌诊断和治疗的新靶点，并为胆囊癌的个体化治疗提供新的思路。