肥胖症（obesity）是以体内脂肪过度蓄积为特征的慢性全身性代谢性疾病，由遗传、环境、炎症、内分泌调节异常等多种复杂因素相互作用所致。肥胖已成为当下亟待解决的公共卫生危机。根据2020年《中国居民营养与慢性病状况报告》，中国超重和肥胖发病率和增长速度居世界首位，是超重和肥胖人口最多的国家，约有50%成人超重和肥胖。因此，寻求科学防治肥胖症的方法对中国人群尤为迫切。

棕色脂肪（brown adipose tissue，BAT）细胞与米色脂肪细胞统称为产热脂肪细胞，是哺乳动物体内具有产热特性的脂肪细胞，具有多房脂滴的形态特征，电子显微镜下可见丰富的线粒体，在线粒体内膜上高表达解偶联蛋白1（uncoupling protein1，UCP1）^［1-2］。寒冷或β-肾上腺素能受体（β-adrenergic receptor，β-AR）激动剂可促进脂肪分解，以及上调Ucp1等产热基因的表达水平，长链脂肪酸与UCP1结合可提高线粒体内膜对质子的导电性，消耗质子梯度，使得氧化磷酸化与三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成解偶联，将底物氧化所产生的能量以热能形式释放，从而维持机体体温，促进能量消耗^［3-4］。大量的啮齿类动物研究和临床研究证实，β3-肾上腺素能受体激动剂激活棕色和米色脂肪能够减重、减少体脂^［5-6］，改善胰岛素敏感性与胰腺β细胞功能^［7］，改善游离脂肪酸与炎症水平^［5-6］，升高外周血中高密度脂蛋白与载脂蛋白A1水平、总胆汁酸水平^［8］。因此，棕色脂肪和米色脂肪活化是治疗肥胖症、非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）等代谢性疾病的新途径^［9］。

减少热量摄入与促进能量消耗是预防与治疗肥胖症的主要策略。间歇性禁食（intermittent fasting，IF）是摄食与禁食规律交替的膳食模式，其包括限时禁食（time-restricted feeding，TRF）、5∶2禁食（5∶2 diets）、隔日禁食（alternate-day fasting，ADF）3种形式。临床试验^［10-11］证实，通过8~12周的间歇性禁食，肥胖患者的体质量可较基线减轻4%~8%。间歇性禁食还可升高外周血脂联素水平、降低瘦素水平^［12-13］，改善血糖与胰岛素水平，改善血压和血脂水平^［14-15］。间歇性禁食带来的不仅是摄食量减少^［16-17］，能量消耗增加亦在其中发挥了重要的作用。间歇性禁食实现了从肝源性葡萄糖到脂肪细胞源性酮体的代谢底物转换，通过降低合成代谢、增强应激抵抗力、促进线粒体生物合成、改善糖脂代谢过程、影响自噬、抑制炎症、增强DNA修复和促进细胞存活等机制，发挥改善心血管代谢性疾病的作用^［18］。已有的研究表明，间歇性禁食能够促进腹股沟白色脂肪组织（inguinal white adipose tissue，iWAT）和附睾白色脂肪组织（epididymal white adipose tissue，eWAT）中产热基因Ucp1表达^［19］，还能增加iWAT中细胞死亡诱导DFFA样效应蛋白α（cell death inducing DFFA like effector α，Cidea）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，Vegf）表达，促进能量消耗^［20］。此外，间歇性禁食还可通过影响肠道菌群丰度与代谢物水平，促进白色脂肪米色化并维持能量稳态^［21］。最新的研究证据^［22］提示，符合生物节律的间歇性禁食可促进脂肪细胞的无效肌酸循环，增加机体能量消耗，抵抗高脂饮食诱导的肥胖进展，但其未排除UCP1在间歇性禁食中的作用。考虑到UCP1主要在棕色脂肪和米色脂肪中优势表达，且棕色和米色脂肪活化时能促进外周血中葡萄糖与脂肪酸清除^［23-24］，我们假设UCP1在间歇性禁食中发挥关键作用，若缺失了UCP1的作用，间歇性禁食的减重效应将受损，而通过β3-肾上腺素能受体激动剂激活棕色和米色脂肪，可促进能量以UCP1依赖的方式发生非颤抖性产热，也许能放大间歇性禁食减重和改善代谢的作用。本研究分别在高脂饮食诱导肥胖小鼠与非肥胖小鼠中进行间歇性禁食实验，并隔日给予β3-肾上腺素能受体激动剂CL316243活化产热脂肪，观察间歇性禁食联合产热脂肪活化对高脂饮食诱导的肥胖、慢性炎症，以及机体糖脂代谢的影响，探索间歇性禁食联合治疗能否进一步缓解肥胖的发生发展，明晰UCP1在间歇性禁食中的作用，为间歇性禁食联合β3-肾上腺素能受体激动剂在临床中的运用提供理论支持。

8周龄雄性C57BL/6J小鼠购自上海灵畅生物科技有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2018-0003。小鼠饲养于上海交通大学医学院实验动物科学部SPF级实验室，环境温度（25±1）℃，湿度50%，并保证12 h光照/12 h黑暗交替。小鼠根据实验设计进行隔日禁食或者自由摄取食物，所有小鼠均可自由饮水。实验动物使用许可证号为SYXK（沪）2018-0027。

60%高脂饲料（D12492）购自美国Research Diets公司，β3-肾上腺素能受体激动剂CL316243（C5976）购自美国Sigma公司，TRIzol试剂（R401-01）、反转录试剂盒（R222-01）、实时定量PCR试剂盒（Q711-02）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，三氯甲烷（10006818）、异丙醇（80109228）、75%乙醇（80176961）购自国药集团化学试剂有限公司，DEPC处理水（B501005-0500）购自生工生物工程（上海）公司，实时定量PCR（RT-qPCR）引物由生工生物工程（上海）公司设计与合成。

全自动样品冷冻研磨仪（F6/10）购自上海净信实业发展有限公司，台式冷冻通用离心机（SL16R）、酶标仪（Multiskan Sky）、PCR热循环仪（2720）购自美国Thermo Fisher Scientific公司，荧光定量PCR仪（LightCycler^®480 Ⅱ）购自瑞士Roche公司，荧光倒置显微镜（Ts2-FL）购自日本Nikon公司。

肥胖治疗实验：予8周龄雄性C57BL/6J小鼠60%高脂饲料喂养，小鼠可自由摄取食物，饲养4个月构建饮食诱导的肥胖小鼠模型，后续实验期间仍以60%高脂饲料喂养。待肥胖小鼠模型构建成功后随机将小鼠分为4组，分别为对照组1（Ctrl₁组）、隔日腹腔注射CL316243组1（CL₁组）、间歇性禁食组1（IF₁组）、间歇性禁食联合隔日腹腔注射CL316243组1（IF+CL₁组），每组4只小鼠。其中，间歇性禁食采取隔日禁食的策略：一日自由饮食，一日仅提供饮水，间隔进行，持续38 d。CL₁组与IF+CL₁组小鼠隔日（IF+CL₁组的自由饮食日）予β3-肾上腺素能受体激动剂CL316243腹腔注射，剂量0.5 mg/kg，共注射19次。实验期间每2 d记录小鼠摄食量与体质量变化，计算小鼠38 d内的累积摄食量。

肥胖预防实验：随机将8周龄雄性C57BL/6J小鼠分为4组，分别为对照组2（Ctrl₂组）、隔日腹腔注射CL316243组2（CL₂组）、间歇性禁食组2（IF₂组）、间歇性禁食联合隔日腹腔注射CL316243组2（IF+CL₂组），每组5只小鼠，均以60%高脂饲料喂养。4组小鼠禁食策略与药物干预方法与治疗实验一致，干预124 d。实验期间每2 d记录小鼠摄食量与体质量变化，计算小鼠124 d内的累积摄食量。

实验结束后，取小鼠尾尖静脉血于血糖试纸上，用血糖仪检测小鼠外周血葡萄糖浓度；以CO₂窒息法处死小鼠，取小鼠肝脏组织、BAT、iWAT与eWAT用于后续分析。

分别取肝脏、BAT、iWAT与eWAT加入适量TRIzol试剂，并于冷冻研磨仪中破碎组织，根据TRIzol试剂说明书提取RNA，用DEPC处理水溶解RNA，分光光度计测量RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA。根据反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA，根据实时定量PCR试剂盒配制10 μL反应体系：2 μL cDNA模板、0.2 μL上游引物（10 μmol/L）、0.2 μL下游引物（10 μmol/L）、5 μL 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix、2.6 μL双蒸水。反应程序：预变性95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。数据以核糖体蛋白侧茎亚基P0（ribosomal protein lateral stalk subunit P0，Rplp0）为内参，以2-ΔΔCT计算各基因的mRNA相对表达水平。引物序列见表1。

取新鲜肝脏、脂肪组织浸没于通用型组织固定液（中性）过夜，并交由赛维尔公司进行组织石蜡包埋、切片与苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，H-E）染色。在光学显微镜下观察肝脏和脂肪组织结构，于不同倍镜视野下观察细胞形态、脂滴大小等，并拍照。运用Image J软件测量脂肪细胞与肝细胞直径。

数据采用GraphPad Prism 9.0软件进行分析。定量资料以x±s_x 表示，组间比较采用成组t检验或单因素方差分析。所有统计检验采用双侧检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

为探究间歇性禁食联合产热脂肪活化对肥胖的治疗作用，我们采用隔日禁食单独或联合CL316243腹腔注射处理肥胖小鼠（图1A）。在高脂饮食饲养条件下，与Ctrl₁组相比，CL₁组的摄食量无明显变化，IF₁组与IF+CL₁组摄食量显著减少（均P<0.05），说明间歇性禁食能够有效减少高脂饮食条件下小鼠的摄食量（图1B）。经过38 d干预后，IF₁组与IF+CL₁组小鼠的体质量较Ctrl₁组显著下降（均P<0.05）；与IF₁组相比，IF+CL₁组肥胖小鼠体质量下降更加显著（P<0.05，图1C）。为了解间歇性禁食联合产热脂肪活化对血糖的改善作用，我们测量了小鼠的随机血糖，结果显示：与Ctrl₁组相比，CL₁组、IF₁组与IF+CL₁组均能显著降低肥胖小鼠血糖（均P<0.05）；与IF₁组相比，IF+CL₁组随机血糖下降更加显著（P<0.05，图1D）。

为明确间歇性禁食联合产热脂肪活化对肝脏和脂肪组织质量、组织形态的影响，对脂肪和肝脏质量进行分析，结果显示：IF+CL₁组的BAT和肝脏质量占体质量的百分比与Ctrl₁组相比无显著差异，但iWAT与eWAT质量百分比显著下降（图2A）。对脂肪组织与肝脏组织切片进行H-E染色，结果显示：IF+CL₁组小鼠eWAT和iWAT脂肪细胞脂滴明显减小，eWAT中花冠样结构（浸润的炎症细胞）减少，高脂饮食诱导的棕色脂肪脂滴沉积减少，肝脏中脂滴浸润减少（图2B）。进一步对脂肪细胞与肝脏细胞直径进行分析，与Ctrl₁组相比，CL₁组、IF₁组、IF+CL₁组脂肪细胞、肝脏细胞直径均减小，其中IF+CL₁组脂肪细胞与肝脏细胞直径较CL₁组也显著减小（图2C）。

为进一步明确间歇性禁食联合产热脂肪活化对肥胖相关的慢性炎症的影响，运用RT-qPCR检测eWAT与肝脏组织的炎症相关基因，结果显示：在eWAT中，CL₁组Ccl5 mRNA表达水平较Ctrl₁组下调，IF+CL₁组Ccl2、Ccl5、Il-1b和Il-6 mRNA表达水平较Ctrl₁组均下调（均P<0.05，图3A）；在肝脏组织中，IF₁组、IF+CL₁组Ccl2、Ccl5、Il-1b和Il-6 mRNA表达水平均下调（均P<0.05，图3B），但IF+CL₁组与IF₁组之间差异无统计学意义。

为明确间歇性禁食联合产热脂肪活化对白色脂肪组织代谢的影响，我们采用RT-qPCR检测了eWAT与iWAT的产热基因及脂肪酸代谢相关基因，结果显示：CL₁组eWAT与iWAT的产热基因Ucp1、Cidea mRNA水平较Ctrl₁组显著上调（均P<0.05）；与IF₁组相比，IF+CL₁组产热基因Ucp1、Cidea mRNA水平上调（均P<0.05，图4A、C）。关于脂肪酸氧化相关基因，IF+CL₁组促进eWAT中脂联素（adiponectin）基因表达上调（P<0.05）；与Ctrl₁组相比，CL₁组、IF₁组、IF+CL₁组eWAT的Ppara、Ehhadh表达均上调（均P<0.05，图4B）。iWAT中仅有IF+CL₁组的Ppara、Ehhadh mRNA表达水平上调，显著高于其他3组（均P<0.05，图4D）。

为探讨间歇性禁食联合产热脂肪活化对肝脏糖脂代谢的影响，我们采用RT-qPCR检测了肝脏糖酵解、糖异生、脂肪酸合成与氧化等相关基因，结果显示：与Ctrl₁组相比，IF+CL₁组脂肪酸氧化相关基因Ehhadh mRNA水平、脂肪酸合成相关基因Scd1 mRNA水平显著上调（图5A），同时糖异生通路中G6Pase、Pepck的表达上调，糖酵解相关基因Pfkl、Gck、Pkm与葡萄糖转运蛋白Glut1、Glut4 mRNA水平显著上调，但与CL₁组和IF₁组相比联合效应并不明显（图5B）。

为研究间歇性禁食联合产热脂肪活化对肥胖的预防作用，我们采用隔日禁食单独或联合CL316243腹腔注射处理正常体质量小鼠（图6A），同时进行高脂饲料喂食，结果显示：与Ctrl₂组相比，CL₂组小鼠摄食量有升高的趋势，但差异无统计学意义（P>0.05），IF₂组和IF+CL₂组的124 d累积摄食量与Ctrl₂组差异无统计学意义（图6B）。与Ctrl₂组相比，CL₂组、IF₂组、IF+CL₂组小鼠的体质量增长被抑制，且IF₂组、IF+CL₂组体质量较CL₂组更低，差异均有统计学意义（均P<0.05，图6C）。在血糖方面，CL₂组、IF₂组与Ctrl₂组小鼠血糖无明显差异，仅IF+CL₂组小鼠血糖显著低于Ctrl₂组（P<0.05，图6D）。

脂肪组织和肝脏组织称重结果显示：与Ctrl₂组相比，CL₂组、IF₂组、IF+CL₂组BAT、iWAT和eWAT质量占体质量的百分比显著下降（均P<0.05），但CL₂组和IF+CL₂组肝脏质量占体质量的百分比较Ctrl₂组显著上升（均P<0.05，图7A）。进一步对脂肪组织和肝脏组织切片进行H-E染色，结果显示：CL₂组、IF₂组、IF+CL₂组的eWAT和iWAT脂肪细胞脂滴沉积减少；CL₂组、IF₂组、IF+CL₂组eWAT脂肪细胞间质花冠样结构显著减少；IF+CL₂组的小鼠iWAT与BAT中的多房脂滴数量更多，肝脏脂滴显著减少（图7B）。脂肪细胞与肝细胞直径分析结果显示：CL₂组、IF₂组、IF+CL₂组的脂肪细胞和肝细胞直径较Ctrl₂组均减小，且IF+CL₂组脂肪细胞直径较CL₂组进一步减小（均P<0.05，图7C）。

为探究间歇性禁食联合产热脂肪活化对高脂饮食诱导的慢性炎症的改善作用，我们检测了脂肪组织与肝脏组织中的炎症相关基因，结果显示：在eWAT中，CL₂组Ccl2、Il-6 mRNA表达水平较Ctrl₂组显著降低（均P<0.05），IF+CL₂组仅Ccl2 mRNA表达水平降低（P<0.05），Ccl5、Il-1b和Il-6 mRNA表达水平都呈现出下降的趋势，但差异无统计学意义（均P>0.05，图8A）；在肝脏中，IF₂组Ccl2、Il-1b mRNA表达水平较Ctrl₂组显著降低（均P<0.05，图8B）。

为探讨间歇性禁食联合产热脂肪活化对高脂饮食小鼠白色脂肪组织功能的影响，我们采用RT-qPCR检测了eWAT与iWAT的产热基因与脂肪酸代谢相关基因（图9）。eWAT的检测结果显示：与Ctrl₂组相比，IF₂组产热基因Ucp1、Cidea mRNA表达水平无明显差异，而CL₂组和IF+CL₂组这2种基因表达水平显著升高（均P<0.05），且IF+CL₂组Ucp1 mRNA表达水平较IF₂组、CL₂组显著升高（均P<0.05，图9A）；与Ctrl₂组相比，IF₂组、CL₂组和IF+CL₂组adiponectin、Ppara、Ehhadh等脂肪酸代谢相关基因的mRNA水平均显著上调（均P<0.05），且IF+CL₂组较IF₂组的Ppara和Ehhadh表达水平更高（均P<0.05，图9B）。在iWAT中，IF₂组仅Cidea mRNA水平较Ctrl₂组升高（P<0.05），而CL₂组和IF+CL₂组Ucp1、Cidea mRNA表达水平均显著升高（均P<0.05），其中IF+CL₂组2种基因的表达水平更高，但差异没有统计学意义（均P>0.05，图9C）。进一步检测iWAT中脂肪酸代谢相关基因，结果表明：与Ctrl₂组和IF₂组相比，IF+CL₂组Ppara与Ehhadh表达均上调（均P<0.05，图9D）。

为探究间歇性禁食联合产热脂肪活化对高脂饮食小鼠肝脏糖脂代谢的影响，我们采用RT-qPCR的方法检测肝脏脂代谢与糖代谢相关基因，结果显示：与Ctrl₂组相比，CL₂组脂肪酸代谢相关基因Fasn、Scd1、Dgat2、Fgf21 mRNA表达水平显著下调，IF₂组Fasn、Dgat2、Srebplc、Ppara、Fgf21与Pparg表达水平显著下调，IF+CL₂组肝脏Srebp1c、Fasn、Scd1、Dgat2、Ppara、Fgf21、Pparg mRNA水平等均显著下调（均P<0.05，图10A）。在糖代谢方面，CL₂组、IF₂组、IF+CL₂组均能抑制糖异生基因Gck表达（均P<0.05，图10B）。

肥胖症是当下危害个体健康与制约社会发展的公共卫生问题，流行病学研究显示超重与肥胖人数在多个年龄段呈现快速增长的趋势，寻求科学有效的预防与治疗措施、减缓肥胖症患病率的增长是解决肥胖症问题的重心。生活方式的干预贯穿于整个肥胖症健康管理过程，是预防与治疗肥胖症的基石。间歇性禁食是由禁食衍生出的膳食模式，通过周期性的禁食与摄食以达到减少热量摄入的目的，其安全性及有效性在多项临床试验中已得到证实，且亦有临床试验通过间歇性禁食联合治疗观察其对代谢性疾病的改善作用。一项以超重和肥胖患者为研究对象的临床试验^［14］显示，间歇性禁食联合热量限制饮食在有效减轻体质量、减少体脂的同时，能够有效改善血糖、胰岛素水平、血脂和血压，但间歇性禁食联合热量限制饮食与单纯热量限制饮食的减重与代谢指标改善效果并无明显差异，提示限制热量在间歇性禁食减重效果中的重要性。另一项在NAFLD患者中开展的临床试验^［25］显示，间歇性禁食联合有氧运动能有效减轻体质量与减少体脂，显著降低外周血谷丙转氨酶水平，提高胰岛素敏感性；但是间歇性禁食联合有氧运动在改善外周血谷草转氨酶水平、糖化血红蛋白水平以及肝纤维化评分方面与单纯间歇性禁食组、单纯有氧运动组之间并无明显差异，提示间歇性禁食联合有氧运动虽可改善NAFLD患者肝脏脂肪变性程度，但未能比单纯间歇性禁食获得更多的代谢效益。因此，探索更高效的间歇性禁食联合疗法也是防治肥胖症的新思路。

与已发表的啮齿类动物研究相似，我们的实验结果也证实了间歇性禁食在肥胖症治疗中的作用。与我们的假设相符的是，间歇性禁食联合产热脂肪活化比单纯间歇性禁食取得更好的减肥效果，间歇性禁食联合产热脂肪活化能有效减轻肥胖小鼠体质量、降低体脂含量，改善血糖水平。此外，间歇性禁食联合产热脂肪活化能降低肝脏和内脏脂肪组织炎症水平，并协同促进脂肪组织中产热基因上调与脂肪酸氧化过程，在一定程度上促进肝脏糖代谢过程，维持糖代谢稳态。而在非肥胖小鼠间歇性禁食实验中发现，间歇性禁食联合产热脂肪活化也能抵抗高脂饮食诱导的体质量增长并改善血糖，缓解脂肪组织炎症水平，促进脂肪组织脂肪酸氧化利用，同时抑制肝脏脂质合成过程，减轻脂肪组织和肝脏中的脂肪沉积，但其获得的代谢效益与单纯间歇性禁食效果相当。这提示我们可在肥胖治疗中通过采用间歇性禁食与激活产热脂肪相结合的方式，取得更好的减肥效果；而单纯间歇性禁食即可在肥胖预防中起明显作用，可在肥胖预防领域推广运用。

间歇性禁食联合产热脂肪活化改善小鼠体质量与糖脂代谢过程的具体作用机制尚不明确，我们在肥胖治疗与预防模型中均能观察到间歇性禁食联合产热脂肪活化时产热基因Ucp1表达水平更高，提示Ucp1在联合疗法中的重要作用，但仍需要通过构建Ucp1敲除小鼠模型进一步验证；此外，我们考虑间歇性禁食联合产热脂肪活化可能通过降低血胰岛素水平，促进脂肪组织与肝脏组织的脂肪酸氧化过程，减少脂肪酸合成，进而减轻脂毒性，缓解机体炎症水平以实现其改善机体代谢的作用，但具体机制仍需进一步实验验证。既往研究^［7］表明，在肥胖人群中运用β3-肾上腺素能受体激动剂米拉贝隆可通过白色脂肪米色化过程间接改善胰腺β细胞功能。我们在肥胖治疗与预防模型中观察到间歇性禁食联合产热脂肪活化对肥胖小鼠与非肥胖小鼠的血糖改善作用显著，一方面源于棕色脂肪活化与白色脂肪米色化促进外周血葡萄糖清除，另一方面源于间歇性禁食联合产热脂肪活化可一定程度上促进肝脏糖代谢过程以维持糖代谢稳态。但我们未测定胰岛素水平以及脂肪激酶如瘦素、脂联素水平，尚不清楚间歇性禁食联合产热脂肪活化对胰岛功能与胰岛素敏感性的改善作用。此外，β3-肾上腺素能受体不仅在棕色脂肪细胞上高表达，也表达于膀胱，同时β3-肾上腺素能受体激动剂可非特异性结合其他肾上腺素能受体，继而影响心血管功能^［26-27］。我们仍需进一步评估间歇性禁食联合产热脂肪活化对于心血管系统的影响。