肺癌是我国乃至世界范围内死亡率最高的恶性肿瘤^［1-2］。肺癌患者中，伴恶性胸腔积液（malignant pleural effusion，MPE）的发生率约为40%；MPE的产生是由于恶性肿瘤在发生胸膜转移后刺激胸腔壁产生炎症反应，进而诱发含恶性肿瘤细胞的胸腔积液^［3-4］。此外，伴MPE的肺癌患者相较于无MPE的肺癌患者，中位总生存期缩短（7.9个月vs 15.8个月）^［5］；并且在接受酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）靶向治疗的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变的晚期肺腺癌患者中，与无MPE的患者相比，伴MPE的患者应答率更低（85.3% vs 62.1%）、预后更差，且缺乏有效的治疗策略^［6-7］。因此，为探究伴MPE的肺癌患者的治疗和预后，建立基于肺癌MPE相关的动物模型具有重大意义。

构建肿瘤动物模型有2种传统的方法。一种是采用肿瘤细胞系进行皮下接种。但由于肿瘤细胞系是在体外建立且脱离了体内微环境，其遗传不稳定且不能概括患者肿瘤的异质性。另一种是采用患者体内获取的新鲜肿瘤组织，经处理后移植到非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷（non-obese diabetic/severe combined immunodeficient，NOD/SCID）小鼠上，依靠小鼠提供生长环境，高度模拟人体内肿瘤的发生发展，建立患者来源的肿瘤异种移植（patient-derived tumor xenograft，PDX）模型。该模型极大保留了原代肿瘤的基因谱表达水平、肿瘤异质性和肿瘤微环境等特征，为肿瘤的机制研究、治疗和药物筛选提供了理想的体内模型。但由于该模型需行有创手术取得患者肿瘤组织，随后在极短时间内完成移植，患者接受度有限；同时还需选取活性高的部位才能获得较高的移植成功率，使其应用受到限制^［8］。

应用MPE构建动物模型则能够更好地弥补以上缺点。临床上，肺癌伴MPE发生率高^{［3-4，9］}，样本易取得；同时MPE需经胸腔引流治疗，方式简易且对患者损伤较小，可实时动态获得组织样本，患者接受度高；MPE中含患者新鲜活性肿瘤细胞，故可考虑将其中肿瘤细胞富集作为患者源性肿瘤进行PDX模型建立。因此，本研究拟通过富集MPE中的肿瘤细胞，将其植入NOD/SCID小鼠皮下进行PDX模型的构建，同时检验PDX是否保留原肿瘤特异性，为进一步研究伴MPE肺癌患者胸腔积液易复发、靶向药物应答率低等的机制及治疗药物筛选奠定基础。

新鲜MPE取自2019—2021年上海交通大学医学院附属第九人民医院肿瘤内科就诊的35例伴MPE的肺癌患者。患者均经病理科确诊为肺癌。将患者胸腔积液引流至引流袋，将其置于装有冰袋预冷的保温箱内，送至实验室，在超净台无菌环境中进一步处理。

6~8周龄雄性NOD/SCID小鼠（浙江维通利华实验动物技术有限公司），体质量19~23 g，饲养于上海市浦东新区爱迪生路332号SPF（specific pathogen free）区。饲养条件：温度20~27 ℃，湿度40%~70%，换气次数10~15 次/h，空气清洁度7级，昼夜明暗交替12 h∶12 h。实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0001。实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2020-0029。

RPMI-1640（Invitrogen，美国），5%胎牛血清（Gibco，美国），红细胞裂解液（Solarbio，北京），基质胶（Corning，美国），抗细胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）抗体、抗甲状腺转录因子1（thyroid transcription factor-1，TTF1）抗体、抗天冬氨酸蛋白酶A（Napsin A）抗体（Cell Signaling Technology，美国）。

全景组织切片扫描分析系统（Olympus，日本），倒置荧光显微镜（Olympus，日本），高速离心机（Eppendorf，德国）。

5例人肺癌伴MPE以及6例人肺癌原位实体瘤单细胞转录组测序数据，来自基因表达综合数据集（Gene Expression Omnibus，GEO；https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），检索号分别为GSE131907、GSE203360，测序平台均为10×Genomics。使用Seurat软件包（版本4.3.0）进行分析。数据经质量控制、整合及降维聚类，严格遵循Seurat的标准流程，计算单个细胞中检测到的基因数量（nFeature）和分子总数（nCount）。通过LogNormalize函数对质量控制后的数据进行标准化后，再归一化表达进行缩放；通过FindVariableFeatures函数筛选出前2 000个高变异基因，随后进行主成分分析。分别选取排名前20和前15的主成分作为输入，使用t分布随机近邻嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）进行降维^［10］。使用FindNeighbors函数和FindClusters函数执行聚类分析；随后，利用FindAllMarkers函数识别各聚类中的标志基因，并注释细胞类型；同时使用FindMarkers函数识别MPE和实体瘤样本中肿瘤细胞群体的差异基因，并对基因进行基因本体（Gene Ontology，GO）功能富集分析^［11］。富集通路分为细胞组分（cell component，CC）、生物学过程（biological process，BP）及分子功能（molecular function，MF）3个部分展示。选取显著性阈值均P<0.05且排名前10的代表性功能展示。Counts代表该词条下包含的基因数，值越大表示该词条下基因数越高；颜色从蓝到红代表富集的显著性，红色表示富集程度更高。

（1）标本处理

将收集到的MPE颠倒混匀，分装至50 mL离心管中；400×g离心7 min，收集上清液；将沉淀细胞和管中上清液分别置于2个离心管中，上清液再次400×g离心7 min，以充分获取上清液中的细胞；弃上清液，存有沉淀细胞的管中各加红细胞裂解液10~15 mL，常温裂解5~10 min；400×g离心7 min，弃上清液；沉淀细胞各加10 mL 1×PBS或RPMI 1640重悬清洗；400×g离心7 min，弃上清液；用100 µL PBS重悬沉淀细胞500万~1 000万个，分装至1.5 mL EP管中，用冰盒送至动物房。

（2）皮下接种与传代

将MPE离心裂解后肿瘤细胞悬液与基质胶按1∶1混合，将混合物注射到NOD/SCID小鼠左前肢皮下，注射体积为100 µL，细胞数量（0.5~1.0）×10⁷个。每2周用游标卡尺测量肿瘤体积。当PDX的肿瘤体积达到1 000 mm³时，手术剥离肿瘤组织，并对小鼠实施安乐死。将剥离的肿瘤组织用手术刀片切成2 mm×2 mm×2 mm的组织块，无菌接种到新一代NOD/SCID小鼠左前肢皮下。采用相同方法将肿瘤细胞传至P4进行后续实验。对表现出皮肤溃疡、驼背姿势、体质量减轻、发声、易怒或缺乏毛发梳理的小鼠进行仔细监测，必要时进行安乐死。MPE来源肿瘤细胞PDX建模流程具体见图1。

将取材所得的移植瘤块经4%多聚甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋，制备5 μm切片。苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，H-E染色）过程：切片常规脱蜡后，苏木精染核3 min，流水冲洗反蓝；盐酸乙醇分化2 s，流水冲洗；伊红染色40 s，流水冲洗；常规脱水及透明；中性树胶封片。扫片机于20倍视野下拍照观察表达。

采用免疫组织化学法（immunohistochemistry，IHC）进行检测。将5 μm切片常规脱蜡后，3% H₂O₂室温孵育10 min，蒸馏水漂洗；枸橼酸缓冲液微波炉加热10~15 min，室温冷却，PBS漂洗；5%胎牛血清室温孵育10 min；滴加一抗（1∶200~1∶50）37 ℃孵育1~2 h，PBS漂洗；滴加辣根过氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗（1∶100 000~1∶1 000）37 ℃孵育20 min，PBS漂洗；DAB显色，水洗，苏木精复染3~5 min；常规脱水及透明；中性树胶封片。扫片机于20倍视野下拍照观察表达。

单细胞转录组测序数据显示，来自肺癌伴MPE的20 280个细胞被聚类为7个细胞簇，各自占比如图2A、B所示；来自肺癌原位实体瘤的19 391个细胞被聚类为6个细胞簇，各自占比如图2C、D所示；可见肺癌MPE中肿瘤细胞占比相较实体瘤少，而免疫及间充质类细胞比例较高。通过标志基因识别细胞群体（图2E、F）为自然杀伤（natural killer，NK）细胞（标志基因KLRD1、GNLY、NKG7和NCAM1，实体瘤中不表达上述标志基因）、B细胞（标志基因IGHA2、IGHG3、IGHM、CD79A）、T细胞（标志基因TRAC、CD3G、CD3E、CD3D）、成纤维细胞（标志基因COL1A2、COL1A1、THY1、DCN）、周期细胞（标志基因CCNE2、CCNE1、MKI67、TOP2A）、髓系细胞（标志基因FCGR3A、CD68、MARCO、LYZ）、肿瘤细胞（标志基因CDH1、KRT18、KRT19、EPCAM）。

肿瘤组织经聚类分群后，筛选出MPE和实体瘤的肿瘤细胞群体的差异基因，进行GO功能富集分析结果（图3）显示：CC主要涉及纺锤体、含线粒体蛋白的复合物、核糖体、囊泡等；BP主要涉及核染色质分离、姐妹染色单体分离、有丝分裂、线粒体翻译、线粒体基因表达、微管细胞骨架组织等；MF主要涉及泛素样蛋白连接酶结合、跨膜转运蛋白活性、ATP依赖性蛋白解聚酶活性等。我们发现MPE肿瘤细胞CC、BP及MF中富集增殖、代谢相关（染色体分离、有丝分裂、线粒体功能活跃）等功能更多，提示其体外成瘤能力并不弱，这为MPE来源的肿瘤细胞PDX建模奠定研究基础。

小鼠经接种后正常饮食饮水，活动、毛发均正常。图4A左侧可见NOD/SCID小鼠皮下移植瘤生长情况；图4A右侧为移植瘤稳定生长情况，P4代移植瘤H-E染色可见细胞核异质型明显，形态不一、大小不等，排列成索状或巢状，失去正常结构；核分裂增多，可见多核细胞。表明稳定生长及传代的移植瘤，其主要构成成分为肿瘤细胞，而非其他免疫细胞或基质细胞。同时对随机选取的肺癌MPE来源移植瘤（编码为LC004、LC008）进行IHC检测，并与临床患者肺癌MPE的肿瘤细胞IHC结果对比。移植瘤LC004、LC008的肿瘤标志物CK7、TTF1和Napsin A与临床患者结果一致，均呈阳性表达（图4B）；表明移植瘤组织相对成功地保留了肺癌MPE中肿瘤细胞的病理组织学特性。

本研究2019—2021年共收集肺癌伴MPE 35例，成功构建PDX 13例。具体信息，如组织学分型、IHC标志物、TNM分期以及突变情况见表1。PDX构建成功率达37.14%。

建立合适的临床前模型对于癌症转化研究至关重要。而PDX作为一种临床前模型，能够更真实地模拟患者的癌症生物学特征，为每位患者量身定制个性化治疗方案提供了可能性；同时，PDX模型在测试药物有效性和安全性等方面具有多重优势^［12-15］。然而，对于肺癌PDX模型的建立，以往的研究主要采用切除或活检的肿瘤组织构建，较少使用肺癌患者的MPE。或许由于MPE中的肿瘤细胞相对较少，一些研究者主观上认为体外建模难度大。但是，由于肺癌手术肿瘤实体原料有限，切除的肿瘤组织需要迅速进行移植处理，因此相对应可构建移植肿瘤数量受到限制。

值得注意的是，一些研究^［16-17］指出，肺癌患者MPE中的肿瘤细胞可以轻松有效地分离、扩增和培养；尽管在肺癌伴MPE的PDX模型构建过程中可能存在一些挑战，例如MPE中非肿瘤细胞的比例相对较高以及存在红细胞浸润，但同时考虑到肺癌伴MPE的高发率（约40%）^［3-4］、易复发及缺乏有效治疗方式的临床现况，我们仍认为应用MPE构建PDX模型具备可行性，且在实时动态建模方面具有优势，可为临床肺癌伴MPE患者用药指导提供参考。

通过对比MPE及实体瘤细胞的异质性，以及查阅其他文献报道^［18-19］，我们发现MPE的成分包括肿瘤细胞、免疫细胞（T细胞、B细胞、NK细胞、髓系细胞）以及基质细胞（成纤维细胞）等，其中非肿瘤细胞占比远大于肿瘤细胞本身。通过对MPE和实体瘤肿瘤细胞进行GO功能分析，我们观察到MPE中的肿瘤细胞具有更强的增殖功能，这提示MPE富集的肿瘤细胞具备更强的成瘤能力。另外，由于收集的MPE中存在不同程度的红细胞浸润，颜色呈现出洗肉水样到血性胸腔积液的血红色变化；同时此前的文献^［20］报道称，红细胞通过积累缺氧诱导因子1-α（hypoxia-inducible factor 1-α，HIF-1α）可抑制肿瘤生长。因此在本实验中，对MPE进行离心并裂解红细胞的方式获得MPE中的细胞悬液，所得建模成功率高达37.14%，与历年文献报道中应用原位实体瘤建模的成功率17%~38.5%^［21-28］相差不大。这说明在MPE和实体瘤模型构建中，肿瘤细胞的绝对数量或非肿瘤细胞成分高低并非成瘤的必要条件，恶性程度才是关键。虽然在本文中未探索MPE去除非肿瘤细胞成分如免疫细胞，是否能提升PDX的成瘤率，但对比文献中应用外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）制备方法去除MPE中免疫细胞的成瘤率（35.48%）^［29］，我们推测免疫细胞对成瘤的影响可能不大。以上均可说明本研究使用的仅离心与裂解红细胞的MPE建模方法简单易操作，成瘤率相对较高，为应用于非小细胞肺癌基础研究与机制探索，以及晚期肺癌患者个性化指导用药提供了相对较好的模型基础。

许多研究^{［15，22，30］}证实PDX能够很好地保存患者原有肿瘤特征和蛋白表达模式，与我们的实验结果一致。在本研究中，我们在已建成13例PDX中随机选取了2例患者的P4移植瘤进行H-E染色，同时应用IHC检测相应肿瘤标志物，与临床患者MPE肿瘤细胞的IHC对比分析。肺癌标志物包括CK7、TTF-1和Napsin A。CK7作为肺腺癌最敏感的免疫学标志物，阳性率接近100%，是鉴别原发性肺腺癌的首选；肺腺癌也通常表现为TTF-1与Napsin A阳性。本研究结果发现，MPE中富集的肿瘤细胞所形成的实体瘤，出现典型的癌巢，符合肿瘤细胞病理学特征；同时，结合移植瘤IHC结果，CK7、TTF-1和Napsin A均为阳性，我们确定PDX组织为典型的肺腺癌，且与临床患者MPE中肿瘤细胞IHC特征一致，表明应用MPE构建的PDX可保留患者肿瘤异质性。此外，我们团队已在早前研究^［31］中应用MPE构建PDX对Janus激酶1（Janus kinase 1，JAK1）抑制剂Itacitinib的反应性进行实验验证，进一步证明了应用MPE构建PDX模型的临床转化实用性。

然而，本研究也存在一定的局限性。首先，我们并未使用短串联重复序列（short tandem repeat，STR）技术对患者肿瘤组织与MPE建模移植瘤进行比对，以加强验证PDX保留患者肿瘤异质性的可信性。在后续实验中，我们将同时应用H-E染色、IHC以及STR技术作为与患者比对的硬性指标。其次，本研究仅收集了35例MPE样本，样本量相对较少。为获得更为可信的成瘤率数据，我们将在后续的研究中持续进行样本收集，扩大样本规模，提高研究的统计效能，以助于更全面地评估MPE来源PDX模型的建模效果，并为未来的研究提供更可靠的数据支持。

综上所述，PDX模型样本的H-E染色、IHC与患者样本对比均显示出相似的组织病理学特征，表明采用MPE构建的PDX保留了患者肿瘤异质性。利用MPE中的肿瘤细胞作为建模材料来源，不仅取材和建模过程简单，而且患者对取材的过程接受度高。这种建模方式可实时动态构建不同进展期肿瘤组织，成本低且成功率也有所保障。相较于实体瘤PDX建模而言，该方法更为简易快捷。本研究结果证实MPE中的肿瘤细胞是构建PDX的良好来源，为肺癌伴MPE患者的治疗用药和机制研究提供了优良的模型参考。