骨肉瘤是儿童和青少年最常见的原发性骨源性恶性肿瘤，具有生长迅速和早期转移的特点^［1-2］。目前，骨肉瘤的主要治疗策略是手术治疗和化学治疗（化疗）。然而，80%的骨肉瘤患者在诊断时已经转移到肺部，对其成功治疗提出了相当大的挑战^［3］。此外，使用化疗的患者中，耐药性和不良反应也是主要面临的问题^［4］。因此，有必要开发高效低毒性的辅助性抗骨肉瘤天然药物。芦丁是一种黄酮类糖苷，在西番莲、茶、苹果等植物尤其是在苦荞麦中含量丰富^［5］，并因其显著的抗氧化、抗肿瘤和抗炎症作用而日益受到人们的关注^［6-7］。研究表明，芦丁在乳腺癌^［8］、胰腺癌^［9］和结肠癌^［10］等多种癌症中具有抗肿瘤作用。然而，芦丁在骨肉瘤中的作用鲜有报道。因此，本文拟探究芦丁对体内外骨肉瘤进展的影响及其作用机制。

芦丁（纯度98.6%）（美国Selleck），DMEM培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美国Invitrogen），青链霉素混合液（100×）、CCK-8试剂盒、RIPA裂解缓冲液、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、二辛宁可酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白质测定试剂盒和ECL发光溶液（上海碧云天生物技术公司），Transwell小室（美国Corning），Matrigel基质胶（美国BD Biosciences），兔源一抗B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、甘油醛3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体以及辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔IgG（英国Abcam）。

MQX-200型酶标仪（美国Bio-Tek），Calibur型流式细胞仪（美国BD），IX71型倒置荧光显微镜（日本Olympus），ChemiDoc MP型全能型成像系统（美国Bio-Rad）。

人成骨细胞hFOB1.19和人骨肉瘤细胞系MG63、U2OS购自美国典型培养物收藏中心。将骨肉瘤细胞置于含有10% FBS、青霉素-链霉素溶液（1×）的DMEM培养基中，于37 ℃和5% CO₂培养箱中培养。

将hFOB1.19、MG63和U2OS细胞以5×10³个/mL的密度置于96孔板中，分别用0、5、10、20、40、80、160 μmol/L的芦丁（溶解于DMSO）在37 ℃、5% CO₂条件下培养细胞24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培养箱中培养2 h，酶标仪读取各孔的吸光度值并计算细胞存活率。

将MG63和U2OS细胞接种在6孔板中，密度为800个/孔，在培养箱中培养，然后用0、10、20、40 μmol/L的芦丁培养14 d，用结晶紫染色10 min。倒置荧光显微镜下观察并计数细胞克隆数（含有50个及以上细胞为1个克隆），计算克隆形成率。

分别用0、10、20、40 μmol/L芦丁处理MG63和U2OS细胞24 h后，用RIPA裂解液裂解细胞并提取蛋白质。BCA试剂盒检测蛋白质浓度，并使用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质。将样品转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭膜1 h。加入抗Ki67、Bcl-2和Bax抗体在4 ℃培养过夜，次日加入HRP标记的山羊抗兔IgG在37 ℃培养1 h。使用ChemiDoc MP成像系统对蛋白质带进行拍照，并用Image J软件分析蛋白条带的灰度值。

将MG63和U2OS细胞密度调整为5×10⁶个/mL并加至6孔板中，分别用0、10、20、40 μmol/L芦丁处理24 h后，用预冷PBS清洗细胞2次，再次悬浮并在12 000×g下离心5 min。加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）溶液，在室温下避光培养细胞10 min。使用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

将MG63和U2OS细胞接种到6孔板中（3×10⁵个/孔）并培养24 h。当细胞贴壁后，用200 μL移液器枪头沿6孔板的直径垂直划伤细胞培养板。丢弃培养基，分别添加含有0、10、20、40 μmol/L芦丁的新鲜培养基。记录各组在不同时间点（0 h、24 h）的划痕面积，并用Image J软件计算划痕闭合率。

用Matrigel涂覆在Transwell的上室，置于培养箱中放置30 min使其凝固。将MG63和U2OS细胞分别用0、10、20、40 μmol/L芦丁在无血清DMEM培养基中培养，并接种于Transwell上室（4×10⁴个/孔）。Transwell下室培养基中添加10%的FBS，将培养板培养24 h后，用棉签将上室中的细胞完全清除，迁移到下室的细胞用PBS清洗，4%多聚甲醛固定，并用结晶紫染色。在显微镜下随机选择5个区域对细胞进行计数。

12只18~20 g的SPF级4周龄BALB/c裸鼠购自并饲养于四川维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号为SCXK（川）2023-0040，使用许可证号为SYXK（川）2023-0263。将裸鼠饲养于无菌环境中，房间温度控制在26 ℃~28 ℃，湿度维持在50%~60%，光照时间10 h，自由进食高压灭菌水和无菌饲料，适应性喂养1周后进行实验。将MG63细胞（2×10⁶个）皮下注射到裸鼠的右侧腹部，建立异种移植模型。在注射后第7日MG63细胞形成肿瘤后，将小鼠随机分为2组（每组6只）：对照组和芦丁40 mg/kg组。芦丁40 mg/kg组腹腔注射芦丁（40 mg/kg），对照组腹腔注射等体积生理盐水，隔日1次，持续4周。所有小鼠每周测量1次肿瘤大小，计算体积。治疗后，在2%异氟醚麻醉下颈椎脱臼处死。取出异种移植肿瘤，用冰冷的PBS冲洗，称质量，4%多聚甲醛溶液固定，用于免疫组织化学分析和TUNEL测定。采集小鼠心、肝、脾、肺和肾组织，通过常规苏木精和伊红染色进行组织学检测。

小鼠腹部移植瘤组织在4%多聚甲醛溶液固定24 h，取出后进行石蜡包埋、切片、干燥、脱蜡，柠檬酸钠缓冲液修复，滴加抗Ki67（1∶100）和抗VEGF（1∶100）抗体并于4 ℃孵育过夜，生物素标记的山羊抗兔IgG 37 ℃孵育1 h，洗涤后避光显色并用苏木精复染细胞核，荧光显微镜下观察Ki67和VEGF的表达。Ki67阳性表达为细胞核中出现棕黄色颗粒物质，VEGF阳性表达为细胞质中出现棕黄色颗粒物质。

小鼠腹部移植瘤组织石蜡包埋、切片、脱蜡后，滴加蛋白酶K修复，放入内源性过氧化物酶封闭液封闭5 min，滴加TUNEL检测液37 ℃避光孵育1 h，洗涤后滴加DAB显色液进行显色并用苏木精复染细胞核，荧光显微镜下观察染色切片。凋亡细胞率=棕黄色细胞数/总细胞数×100%。

采用Graphpad Prism 9.0软件进行统计分析。所有数据以x±s表示。2组间比较采用t检验，多组间的差异比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

CCK-8实验结果显示，浓度为20 μmol/L的芦丁培养24 h即可显著抑制MG63和U2OS细胞的存活（P=0.002，P=0.003；图1A、B）；而80 μmol/L芦丁处理hFOB1.19细胞72 h后才会明显降低细胞活力（P=0.002，图1C）。因此选择10、20和40 μmol/L的浓度继续研究芦丁对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。

克隆形成实验结果显示，与芦丁0 μmol/L组比较，芦丁20 μmol/L组和40 μmol/L组MG63和U2OS细胞克隆形成率显著降低（均P<0.05，图2A、B）；芦丁10 μmol/L组与芦丁0 μmol/L组比较骨肉瘤细胞克隆形成率差异无统计学意义。Western blotting结果显示，与芦丁0 μmol/L组比较，芦丁20 μmol/L组和40 μmol/L组MG63和U2OS细胞中Ki67蛋白表达显著下调（均P<0.001，图2C）；芦丁10 μmol/L组骨肉瘤细胞Ki67蛋白表达与芦丁0 μmol/L组比较差异无统计学意义。

与芦丁0 μmol/L组比较，芦丁20 μmol/L组和40 μmol/L组MG63和U2OS细胞凋亡率显著升高（均P<0.05，图3A、B），而芦丁10 μmol/L组骨肉瘤细胞凋亡率无明显变化。Western blotting结果显示，与芦丁0 μmol/L组比较，芦丁20 μmol/L组和40 μmol/L组MG63和U2OS细胞中Bax/Bcl-2比值显著升高（P<0.05，图3C），而芦丁10 μmol/L组与芦丁0 μmol/L组比较骨肉瘤细胞中Bax/Bcl-2比值差异无统计学意义。

与芦丁0 μmol/L组比较，芦丁20 μmol/L组和40 μmol/L组处理后MG63和U2OS细胞划痕闭合率均降低，差异有统计学意义（均P<0.05，图4），而芦丁10 μmol/L组骨肉瘤细胞划痕闭合率变化差异无统计学意义。

Transwell分析结果显示，与芦丁0 μmol/L组比较，芦丁20 μmol/L组和40 μmol/L组MG63和U2OS细胞侵袭数目均显著减少（均P<0.001，图5），而芦丁10 μmol/L组骨肉瘤细胞侵袭数目变化无显著变化。

与对照组相比，芦丁40 mg/kg组肿瘤质量和体积明显减小（P<0.001，图6A、B、C），Ki67和VEGF的表达显著降低（P<0.001，图6D、E）。TUNEL检测结果显示，与对照组比较，芦丁40 mg/kg组肿瘤组织细胞凋亡率明显增多（P<0.001，图6F）。小鼠主要器官（心、肝、脾、肺和肾）的组织病理学分析结果表明芦丁没有明显的毒性作用（图7）。

越来越多的证据表明，天然产物尤其是黄酮类化合物在癌症预防和治疗中具有潜在效果。这些化合物通过抑制肿瘤细胞增殖、血管生成和转移或诱导细胞死亡发挥抗肿瘤的作用^［11-12］。多项研究表明，芦丁可以作为有效的抗肿瘤候选药物。比如芦丁可通过阻止细胞周期或激活凋亡相关通路来诱导细胞凋亡^［13］。芦丁通过上调miR-877-3p抑制胰腺癌细胞的增殖和迁移，并促进胰腺癌细胞凋亡^［9］。但是芦丁对骨肉瘤的作用尚不清楚。本研究细胞水平实验结果表明芦丁可在体外抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，促进凋亡，并通过建立的MG63异位异种移植小鼠模型证明了芦丁能够抑制肿瘤生长。

抑制肿瘤细胞过度增殖是治疗恶性肿瘤需要解决的首要问题。我们通过CCK-8实验证实芦丁浓度在20 µmol/L以上时即对骨肉瘤细胞增殖有明显的抑制作用，克隆形成实验证实芦丁能明显抑制骨肉瘤细胞的克隆形成，流式细胞分析结果证实芦丁能够显著促进骨肉瘤细胞的凋亡。Ki67是反映细胞增殖活性的指标，其表达越高，提示肿瘤细胞生长越活跃。线粒体凋亡途径是一种经典的内源性凋亡途径，Bax和Bcl-2是该途径的重要调节蛋白。抗凋亡蛋白Bcl-2与线粒体结合，可阻止线粒体向细胞质释放细胞色素c；相反，促凋亡蛋白Bax转位到线粒体，增加线粒体膜通透性，促进细胞色素c释放，从而刺激caspase级联激活凋亡^［14-15］。Western blotting结果表明芦丁能够显著下调Ki67的表达，并升高Bax/Bcl-2的比值，进一步提示芦丁能够抑制骨肉瘤细胞增殖，促进骨肉瘤细胞凋亡。这与之前报道的芦丁诱导其他肿瘤细胞凋亡的结果一致^［9］。细胞迁移和侵袭是癌症转移的关键过程^［16-17］。我们通过划痕闭合实验和Transwell实验观察芦丁对MG63和U2OS细胞迁移和侵袭的影响，结果表明，2种细胞系的迁移速率均受到抑制，并且芦丁显著减少了骨肉瘤侵袭细胞数量。这些结果表明芦丁可以抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力。此外，裸鼠成瘤实验结果进一步验证了芦丁的肿瘤生长抑制作用。芦丁（40 mg/kg）可降低异种移植瘤的大小和质量，降低Ki67和促血管生长因子VEGF的表达。

值得注意的是，组织病理学数据表明芦丁没有明显的毒性作用。综上所述，本研究证实芦丁在体内外抑制骨肉瘤生长和转移的作用，为芦丁的有效开发和骨肉瘤的临床治疗提供了新的思路。