上海交通大学学报(医学版) ›› 2019, Vol. 39 ›› Issue (5): 478-.doi: 10.3969/j.issn.1674-8115.2019.05.007
朱超南,陈沁雯,辛晨歌,李慧
ZHU Chao-nan, CHEN Qin-wen, XIN Chen-ge, LI Hui
摘要: 目的 ·在人胚胎干细胞 (human embryonic stem cells,hESCs) 中构建基于 CRISPR干扰系统的多基因同时抑制系统,作为研究家族基因功能和构建多基因疾病模型的工具。方法 ·通过 Golden Gate克隆法在 hESCs中建立受强力霉素 (doxycycline,Dox) 调控的多基因 CRISPR干扰系统。该系统主要由 2个质粒组成: 1个质粒在 Dox调控下融合表达核酸酶失活的 CRISPR相关蛋白 9(nucleasedeactivated CRISPR-associated protein 9,dCas9)和 Krüppel相关盒(Krüppel-associated box,KRAB)抑制结构域(dCas9-KRAB),另 1个质粒可同时表达 8个独立的导向 RNA(guide RNA,gRNA)来分别引导 dCas9-KRAB蛋白到基因组特定位点抑制转录起始或延伸。以基因组 DNA为模板进行 PCR,确定 2个质粒是否整合至细胞基因组,并通过 Western blotting确定细胞在 Dox诱导下是否可表达 dCas9-KRAB蛋白。结果 ·使用这种可调控的多基因 CRISPR干扰系统,可在 Dox诱导下在 hESCs中同时成功抑制多个基因的表达;并且这些基因的表达被抑制导致 hESCs形态改变,碱性磷酸酶活性下降,hESCs表面标志物阶段特异性胚胎表面抗原 4(stage-specific embryonic antigen 4,SSEA4)的表达下降, hESCs发生分化。结论 ·该 CRISPR干扰系统可以在 hESCs中高效地同时抑制多个基因的表达,是十分有效的多基因研究工具。
中图分类号: