线粒体内膜转位酶8A基因敲除小鼠的构建及其内耳功能研究

doi:10.3969/j.issn.1674-8115.2023.03.001

线粒体内膜转位酶8A基因敲除小鼠的构建及其内耳功能研究

洪晗馨^,¹^,²^,³, 王龙昊¹^,²^,³, 刘辉辉¹^,²^,³, 彭浒⁴, 吴皓^,¹^,²^,³, 杨涛^,¹^,²^,³

1.上海交通大学医学院附属第九人民医院耳鼻咽喉头颈外科，上海 200011

2.上海交通大学医学院耳科学研究所，上海 200125

3.上海市耳鼻疾病转化医学重点实验室，上海 200125

4.海军军医大学长征医院耳鼻喉科，上海 200003

Construction of translocase of inner mitochondrial membrane 8A gene knockout mice and study of its inner ear function

HONG Hanxin^,¹^,²^,³, WANG Longhao¹^,²^,³, LIU Huihui¹^,²^,³, PENG Hu⁴, WU Hao^,¹^,²^,³, YANG Tao^,¹^,²^,³

1.Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Shanghai Ninth People′s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011, China

2.Ear Institute, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200125, China

3.Shanghai Key Laboratory of Translation Medicine on Ear and Nose Diseases, Shanghai 200125, China

4.Department of Otolaryngology, Changzheng Hospital, Naval Medical University, Shanghai 200003, China

通讯作者: 杨　涛，电子信箱：yangtfxl@sina.com吴　皓，电子信箱：wuhao@shsmu.edu.cn。

编委: 邢宇洋

收稿日期: 2022-12-15 接受日期: 2023-02-22 网络出版日期: 2023-03-28

基金资助:

国家自然科学基金.  82101938.  82101211.  82271157.  81730028
上海市科学技术委员会科技创新行动计划.  21JC1404000
上海市耳鼻疾病转化医学重点实验室.  14DZ2260300

Corresponding authors: YANG Tao, E-mail:yangtfxl@sina.comWU Hao, E-mail:wuhao@shsmu.edu.cn.

Received: 2022-12-15 Accepted: 2023-02-22 Online: 2023-03-28

作者简介 About authors

洪晗馨（1997—），女，硕士生；电子信箱：h764274629@sjtu.edu.cn。 E-mail：h764274629@sjtu.edu.cn。

摘要

目的·通过构建线粒体内膜转位酶8A（translocase of inner mitochondrial membrane 8A，Timm8a）基因敲除小鼠（即Timm8a^-^/- 小鼠），探究其听力表型及该基因在内耳的功能。方法·设计并构建Timm8a^-^/- 小鼠，采用PCR及蛋白质印迹法（Western blotting）验证是否构建成功。观察并比较1月龄时Timm8a^-^/- 小鼠与野生型（wild type，WT）小鼠的体型及体质量。采用免疫荧光染色观察WT小鼠耳蜗组织中TIMM8A的表达分布。通过听性脑干反应（auditory brainstem response，ABR）比较Timm8a^-^/- 小鼠和WT小鼠的听力阈值。采用甲苯胺蓝染色法观察该2种小鼠内耳螺旋器、螺旋神经节与血管纹形态。通过透射电镜观察该2种小鼠的内耳毛细胞、螺旋神经节细胞与血管纹细胞中的线粒体超微结构，并统计异常线粒体所占比例。结果·PCR结果显示Timm8a基因已成功敲除，Western blotting结果显示Timm8a^-^/- 小鼠的耳蜗、大脑、心肌、骨骼肌组织中已无TIMM8A表达，表明Timm8a^-^/- 小鼠构建成功。免疫荧光染色结果提示TIMM8A在WT小鼠耳蜗组织中呈泛表达，且高表达于螺旋器、螺旋神经节与血管纹区域。与WT小鼠相比，1月龄时的Timm8a^-^/- 小鼠发育较慢，体质量明显偏轻，且ABR阈值有所升高（均P<0.05）；该小鼠的ABR的Ⅰ波波幅出现下降、Ⅰ波潜伏期有所延长。甲苯胺蓝染色结果显示，与WT小鼠相比，Timm8a^-^/- 小鼠的螺旋神经节细胞的形态与数量均无明显改变，耳蜗中圈及底圈的血管纹厚度减薄（均P<0.05）。透射电镜的观察结果显示，与WT小鼠相比，Timm8a^-^/- 小鼠内耳毛细胞、螺旋神经节细胞与血管纹细胞中线粒体结构出现异常，且异常线粒体比例明显增多（均P<0.05）。结论·该研究成功构建了Timm8a^-^/- 小鼠，其听力阈值的升高可能与其内耳线粒体超微形态结构异常有关。

关键词： 线粒体内膜转位酶8A ; Mohr-Tranebjaerg综合征 ; 听神经病谱系障碍 ; 线粒体

Abstract

Objective ·To explore the hearing phenotype of Timm8a^-^/- mice and the function of translocase of inner mitochondrial membrane 8A(Timm8a)gene in inner ear by constructing Timm8a gene knockout mice. Methods ·Timm8a^-^/- mice were designed and constructed. PCR and Western blotting were used to verify whether the construction was successful. The body size and weight of Timm8a^-/- mice and wild type (WT) mice aged one-month were observed and compared. Immunofluorescence staining was used to observe the expression and distribution of TIMM8A protein in the cochlea of WT mice. Auditory brainstem response (ABR) was used to compare the hearing threshold of Timm8a^-^/- mice and WT mice. Toluidine blue staining was performed to observe the morphology of organ of Corti (OC), spiral ganglion neuron (SGN) and stria vascularis (SV) in the inner ear of the two kinds of mice. Transmission electron microscope was used to observe the ultrastructure of mitochondria in inner ear hair cells (HCs), SGN cells and SV cells of the two kinds of mice, and the proportion of abnormal mitochondria was counted. Results ·The results of PCR showed that Timm8a gene had been successfully knocked out, and the results of Western blotting showed that there was no TIMM8A proteins in the cochlea, brain, heart and skeletal muscle tissues. The both results indicated that Timm8a^-^/- mice were successfully constructed. The results of immunofluorescence staining showed that TIMM8A was abundantly expressed in the cochlea of WT mice, and was highly expressed in the OC, SGN and SV. Compared with WT mice, Timm8a^-^/- miceaged one-month developed slower, had lighter body weight and significantly higher hearing threshold (all P<0.05), their amplitude of Ⅰ wave of ABR was decreased and the latency was prolonged. The results of toluidine blue staining showed that compared with WT mice, there was no significant change in the shape and number of SGN cells in the inner ear, but the thickness of SV in the middle turn and basal turn of the cochlea was reduced (both P<0.05). The results of transmission electron microscope showed that compared with WT mice, the structure of mitochondria in inner ear HCs, SGN cells and SV cells of Timm8a^-^/- mice was abnormal, and the proportion of abnormal mitochondria was significantly increased (all P<0.05). Conclusion ·Timm8a^-^/- mice are successfully constructed in this study, and the elevated hearing threshold of Timm8a^-^/- mice may be related to the abnormal ultrastructure of mitochondria in inner ear.

Keywords： translocase of inner mitochondrial membrane 8A (TIMM8A) ; Mohr-Tranebjaerg syndrome (MTS) ; auditory neuropathy spectrum disorder (ANSD) ; mitochondria

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本文引用格式

洪晗馨, 王龙昊, 刘辉辉, 彭浒, 吴皓, 杨涛. 线粒体内膜转位酶8A基因敲除小鼠的构建及其内耳功能研究. 上海交通大学学报(医学版)[J], 2023, 43(3): 261-268 doi:10.3969/j.issn.1674-8115.2023.03.001

HONG Hanxin, WANG Longhao, LIU Huihui, PENG Hu, WU Hao, YANG Tao. Construction of translocase of inner mitochondrial membrane 8A gene knockout mice and study of its inner ear function. Journal of Shanghai Jiao Tong University (Medical Science)[J], 2023, 43(3): 261-268 doi:10.3969/j.issn.1674-8115.2023.03.001

线粒体内膜转位酶8A（translocase of inner mitochondrial membrane 8A，TIMM8A）基因定位于性染色体Xq22.1，包含2个外显子和1个内含子，可编码含97个氨基酸的小多肽。既往研究表明TIMM8A在线粒体内外膜间的物质转运过程中发挥了重要作用^［1］。研究^［2］显示，TIMM8A突变可导致Mohr-Tranebjaerg综合征（Mohr-Tranebjaerg syndrome，MTS），又称耳聋-肌张力障碍-视神经病变综合征（deafness-dystonia-optic neuropathy syndrome，DDONS），是一种罕见的X连锁隐性遗传病。临床上，MTS患者多为男性，主要表现为进行性神经退行性病变；患者在儿童早期即出现语前或语后听神经病谱系障碍（auditory neuropathy spectrum disorder，ANSD）^［3］，青少年时期出现缓慢进行性肌张力障碍或共济失调，20岁左右开始出现视神经萎缩导致缓慢进行性视力下降，40岁左右出现认知功能障碍、人格变化、偏执等异常精神症状。且该疾病的临床症状及发病时间不一，具有临床及遗传异质性^［4］。

对于在儿童早期出现ANSD的DDONS患者，采用人工耳蜗植入进行治疗的效果并不理想。有研究^［5］对DDONS患者的颞骨进行病理解剖后发现其耳蜗神经已完全丧失，而该丧失的机制仍不清楚，且尚未有适合的动物模型能够对该机制进行探索。基于此，为探究TIMM8A基因在内耳中发挥的作用，本研究构建了Timm8a基因敲除小鼠（即Timm8a^-^/- 小鼠），对其听力表型及Timm8a基因表达缺失对内耳功能的影响进行分析，以期为后续深入研究该基因在内耳中的功能作用提供一定的理论支持。

1 对象与方法

1.1 实验动物

Timm8a^flox/+ 小鼠委托上海南方模式生物科技股份有限公司构建，野生型（wild type，WT）C57BL/6J小鼠购买自上海南方模式生物科技股份有限公司，动物生产许可证号：SYXK（沪）2019-0002。ACTB-Cre⁺小鼠购自美国杰克逊实验室（The Jackson Laboratory），货号为019099。上述小鼠饲养于上海交通大学医学院附属第九人民医院实验动物中心，动物使用许可证号：SYXK（沪）2020-0025。该实验动物中心的光照周期为每日12 h，环境温度控制在18 ℃~22 ℃，湿度控制在40%~60%，环境噪声≤40 dB，小鼠自由进食水，每周更换1次垫料。

1.2 主要试剂及仪器

基因组DNA提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］，鼠源GADPH抗体、兔源TIMM8A抗体（Abcam，美国），HRP标记抗兔IgG、HRP标记抗小鼠IgG、二抗Anti-rabbit Alexa Fluor 488 IgG和Anti-mouse Alexa Fluor 594 IgG（Cell Signaling Technology，美国）。

T100梯度型PCR仪、XR凝胶成像分析系统（Bio-Rad，美国），ESP300型电泳仪、HE-200型电泳槽（上海天能科技有限公司），5425 R小型台式冷冻离心机（Eppendorf，德国），RZ6听觉电生理工作站（TDT，美国），Zeiss LSM 880激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss，德国），L120L透射电镜（Thermo Fisher Scientific，美国），CM1520冰冻切片机（Leica，德国）。

1.3 研究方法

1.3.1 Timm8a^-^/- 小鼠的构建与繁育

利用CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9）技术构建Timm8a^flox/+ 小鼠，即以WT C57BL/6J小鼠为背景鼠，选择Timm8a1-201转录本（ENSMUST00000054213.4）为模板，在2号外显子两端插入loxP（locus of X-over P1）重组片段，以获得Timm8a^flox/+ 小鼠。

选取基因型为Timm8a^flox/+ 的F0代小鼠进行自交，获得能稳定繁育的F1代Timm8a^flox/flox 小鼠。将该小鼠与ACTB-Cre ⁺ 小鼠交配，获得基因型Timm8a^flox/+，ATCB-Cre ⁺ 小鼠后令其自交，最终获得Timm8a^-^/- 小鼠，具体构建步骤见图1。

图1

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图1 Timm8a^-^/^-小鼠构建的示意图

Note： Cas9/gRNA—CRISPR-associated protein 9/guide RNA.

Fig 1 Schematic diagram of the construction of the Timm8a^-/- mice

1.3.2 Timm8a^-/-小鼠的基因型鉴定

待上述小鼠出生7 d后，对其行剪尾处理。采用基因组DNA提取试剂盒对鼠尾组织的DNA进行提取，而后行PCR扩增，再行1%琼脂糖凝胶电泳（电压设定为120 V、时间为20 min）。基因型鉴定的引物序列见表1。而后，根据鉴定结果选择实验需要的Timm8a^-^/- 小鼠，待其生长至1月龄时用于后续实验。

表1 Timm8a^-^/^- 小鼠基因型鉴定的引物序列

Tab 1 Primer sequences for Timm8a^-^/- mouse genotyping

Primer	Forward sequence (5'→3')	Reverse sequence (5'→3')
Timm8a	TTGGGGCACCTAACTGAT	CAAAGCAAGGCAATGGAATA
ACTB-Cre 1	GCGGTCTGGCAGTAAAAACTATC	GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC
ACTB-Cre 2	CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT	GTGAAACAGCATTGCTGTCACTT

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1.3.3 体型观察及体质量检测

观察并比较1月龄时的WT小鼠、Timm8a^-^/- 小鼠的体型及体质量变化。

1.3.4 TIMM8A表达水平检测

向Timm8a^-^/- 及WT小鼠腹腔注射5%替来他明和唑拉西泮混合液（100 mg/kg）进行充分麻醉，而后将其断头处死。取小鼠的耳蜗、大脑、心肌与骨骼肌4处组织，分别置于300 μL蛋白裂解液中，在匀浆机上充分震荡并于4 ℃下17 000×g离心30 min，吸取上清液并行蛋白质浓度定量，而后向其中加入适量上样缓冲液至合适浓度，于105 ℃煮样10 min后置于-20 ℃保存备用。采用蛋白质印迹法（Western blotting）检测上述样品中TIMM8A的表达，每组样品取25 μg，一抗为TIMM8A（1∶1 000）、GADPH（1∶1 000），二抗为HRP标记抗兔IgG、HRP标记抗小鼠IgG（均为1∶10 000），具体操作参照说明书。

1.3.5 耳蜗组织中TIMM8A的表达分布

将“1.3.4”部分中获取的WT小鼠耳蜗组织置于4%多聚甲醛溶液中，于4 ℃固定过夜。次日，将其置于EDTA溶液中，于室温脱钙12 h后，继续于15%蔗糖溶液中室温脱水2 h直至耳蜗沉底，再于30%蔗糖溶液中4 ℃脱水过夜。用冷冻切片包埋剂对其进行包埋后，于-80 ℃冰冻定型。采用冰冻切片机沿与蜗轴平行面进行切片，选取含有螺旋器（organ of Corti，OC）部分的切片进行免疫荧光染色，步骤如下：切片组织经磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）清洗后滴加封闭液，于室温封闭1 h，而后滴加TIMM8A 抗体（1∶200）于4 ℃孵育过夜；次日，加入二抗Anti-rabbit Alexa Fluor 488 IgG、Anti-mouse Alexa Fluor 594 IgG（均为1∶200）于室温孵育2 h后封片，于共聚焦显微镜下观察。

1.3.6 内耳病理形态学观察

将“1.3.4”部分中获取的耳蜗组织于室温脱钙12 h（步骤同“1.3.5”部分）。随后，将耳蜗组织行常规的石蜡包埋、降温冷冻，并用石蜡切片机进行切片。将切片晾干后，依次于二甲苯、乙醇中进行脱蜡及脱水，而后行甲苯胺蓝染色，并于光学显微镜下观察。

1.3.7 小鼠听性脑干反应检测

经麻醉处理（5%替来他明和唑拉西泮混合液，100 mg/kg）后，待小鼠疼痛反射消失，将其置于隔音屏蔽室中的37 ℃直流电保温毯上。向小鼠颅骨正中线皮下插入记录电极，右乳突区皮下插入参考电极，左肩皮下插入接地电极。采用MF1扬声器在距离小鼠双耳10 cm处给予4、6、8、11.3、16、22.6、32 kHz自由场声刺激，在TDT system 3上分析各频率刺激下小鼠的听力阈值。声音强度自90 dB声强级（sound pressure level，SPL）开始，以5 dB SPL递减；听力阈值以可以检测到振幅的最低声音强度为准。

1.3.8 耳蜗透射电镜样本的制备与线粒体超微结构观察

将“1.3.3”部分获取的耳蜗组织置于2.5%戊二醛中，于4 ℃下固定过夜。随后，将其依次置于EDTA中室温脱钙12 h，1%四氧化锇中4 ℃固定12 h，50%~100%乙醇中行梯度脱水。采用环氧树脂包埋剂对耳蜗组织进行包埋后浸透，再使用超薄切片机对其进行切片，并于醋酸双氧铀中进行染色，最终于透射电镜下观察。

1.4 统计学方法

使用SPSS 26.0软件对研究数据进行统计分析。定量资料采用x±s表示，2组间比较采用t检验。所有实验至少重复3次。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Timm8a^-^/^- 小鼠构建的验证及其体型观察

采用PCR扩增对小鼠构建过程中的基因型（loxP片段、Cre序列）进行鉴定，结果（图2A、B）显示：2、4号小鼠的基因型均为Timm8a^-^/-，ACTB-Cre ⁺；1、3、5号小鼠的基因型均为Timm8a^flox/flox，ACTB-Cre ^-；6号小鼠的基因型为Timm8a^+/+，ACTB-Cre ^-。采用Western blotting对Timm8a^-^/- 及WT小鼠进行检测，结果（图2C）显示Timm8a^-^/- 小鼠的耳蜗、大脑、心肌、骨骼肌组织中已无TIMM8A表达。表明Timm8a^-^/- 小鼠构建成功。对该2种小鼠的体型及体质量进行分析，结果（图2D、E）显示，与WT小鼠相比，Timm8a^-^/- 小鼠的体型明显偏小，且无论雌雄其体质量明显偏轻（均P=0.000）。

图2

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图2 Timm8a^-^/^- 小鼠构建的验证及其与WT小鼠的体型观察

Note： A/B. Identification of Timm8a loxP (A) and ACTB-Cregenotype (B) of mice by PCR amplification. 421 bp is band of Timm8a loxP band, 361 bp is WT band, 100 bp is Cre positive band, 324 bp is positive control band. C. Detection of TIMM8A in different tissues of Timm8a^-^/- mice and WT mice by Western blotting. D. Comparison of body size between Timm8a^-^/- mice and WT mice. E. Comparison of weight between Timm8a^-/- mice and WT mice.

Fig 2 Verification of Timm8a^-^/- mouse construction and observation of its body size with WT mice

2.2 小鼠内耳TIMM8A表达检测及听力表型、内耳形态观察

采用免疫荧光染色对WT小鼠耳蜗组织中的TIMM8A的表达定位进行观察，结果（图3A）显示TIMM8A在小鼠耳蜗组织中呈泛表达，且在OC、螺旋神经节（spiral ganglion neuron，SGN）与血管纹（stria vascularis，SV）中呈高表达。对Timm8a^-^/- 小鼠与WT小鼠的听性脑干反应（auditory brainstem response，ABR）进行检测，结果（图3B、C）发现，相较于WT小鼠，Timm8a^-^/- 小鼠在各频率刺激下的ABR阈值有所上升（均P<0.05），ABR的Ⅰ波波幅下降且Ⅰ波潜伏期延长。采用甲苯胺蓝染色对Timm8a^-^/- 小鼠与WT小鼠的内耳结构形态进行观察，结果（图4）显示，与WT小鼠相比，Timm8a^-^/- 小鼠的SGN细胞的形态与数量均无明显变化，但耳蜗中圈及底圈的SV厚度有明显变薄（均P<0.05）。

图3

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图3 TIMM8A在耳蜗组织中的表达定位及 Timm8a^-^/^-小鼠与WT小鼠听力表型对比

Note： A. Expression of TIMM8A in cochlea tissue of WT mice. DAPI—4', 6-diamidino-2-phenylindole. B. Comparison of the hearing thresholds between Timm8a^-/- mice and WT mice by ABR. ^①P=0.002, ^②P=0.005, ^③P=0.003, ^④P=0.008, ^⑤P=0.000, ^⑥P=0.007, ^⑦P=0.001. C. Comparison of the ABR waveforms between Timm8a^-/- mice^{and WT mice.}

Fig 3 Expression and localization of TIMM8A in cochlear tissue and comparison of the hearing phenotype between Timm8a^-/- mice and WT mice

图4

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图4 Timm8a^-^/^- 小鼠与WT小鼠的内耳病理形态学分析

Note： A. Observation of the structural morphology of inner ear in Timm8a^-/- mice and WT mice. B. Comparison of the number of SGN cells between Timm8a^-/- mice and WT mice. SGN cells per 1 000 μm² were counted C. Comparison of SV thickness between Timm8a^-/- mice and WT mice.

Fig 4 Pathological analysis of inner ear between Timm8a^-/- mice and WT mice

2.3 小鼠内耳线粒体超微结构的形态观察

采用透射电镜观察Timm8a^-/-小鼠和WT小鼠的内耳线粒体超微结构，结果（图5）显示，相比于WT小鼠，Timm8a^-/-小鼠内耳毛细胞（hair cells，HCs）、SGN细胞、SV细胞中的线粒体基质变浅，嵴排列紊乱，且嵴的长度变短、数量变少甚至消失，异常线粒体的比例明显增多（均P<0.05）。

图5

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图5 Timm8a^-^/^- 小鼠与野生型小鼠内耳HCs、SGN细胞及SV细胞中线粒体超微结构观察及异常结构占比分析

Note： A. Observation of mitochondrial ultrastructure in different types of cells in Timm8a^-/- mice and WT mice. B. Proportion of abnormal mitochondria in different types of cells in Timm8a^-/- mice and WT mice.

Fig 5 Observation of mitochondrial ultrastructure and analysis of the proportion of abnormal structure in inner ear HCs, SGN cells and SV cells of Timm8a^-/- mice and WT mice

3 讨论

线粒体疾病（mitochondrial diseases，MDs）属遗传性罕见疾病。细胞中，约有超1 500种线粒体蛋白参与、维持线粒体的正常功能，其中任一编码线粒体的基因发生有害突变均可能导致MDs。研究^［6-7］显示，线粒体的遗传信息受核基因组和线粒体基因组双重控制，且已有超300个线粒体相关基因被证明与人类疾病的发生有关。MDs可累及全身器官，通常具有显著的临床和遗传异质性^［8-9］。尽管所有器官都可能受到MDs的影响，但高能量代谢器官（如神经系统、骨骼肌、心肌等）常会较早地表现出相关症状^［10］。作为高能量代谢器官之一，耳蜗常常受到MDs的累及，使得该类患者常伴有听力障碍，且其生活质量亦受到极大影响，因此对听力障碍等临床症状的支持性治疗显得至关重要^［11-12］。由TIMM8A突变导致的MTS也属于MDs，该综合征的首要临床表现为听神经病谱系障碍；对于该类患者，人工耳蜗的干预效果并不理想，且目前尚缺乏有关其发病机制及治疗手段的基础研究。因此，本研究通过构建Timm8a^-^/- 小鼠模型，分析Timm8a基因缺失对内耳功能的影响，从而为Timm8a在内耳中的功能研究提供理论支持。

本研究结果发现，与WT小鼠相比，Timm8a^-^/- 小鼠ABR的Ⅰ波波幅下降、Ⅰ波潜伏期延长；通过对小鼠内耳HCs、SGN细胞、SV细胞的线粒体超微结构进行观察后发现，相比于WT小鼠，Timm8a^-^/- 小鼠线粒体损伤的比例较高。相关研究^［13-15］发现，线粒体功能障碍与噪声性听力损失、年龄相关性听力损失、耳毒性药物诱发性听力损失及遗传性听力损失均相关。在大多数哺乳动物细胞中，线粒体是活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要来源。耳蜗线粒体的功能异常可导致ROS水平增加，从而引起线粒体结构进一步受损，包括线粒体膜、线粒体DNA、呼吸链蛋白和与线粒体功能相关的核DNA^［16］；同时，ROS可产生脂质过氧化产物（如8-异前列腺素F2α），该产物会导致血管收缩，继而减少耳蜗中的血流量，最终导致细胞凋亡^［17-18］。基于上述研究，我们推测Timm8a^-^/- 小鼠听力障碍可能与内耳线粒体功能异常、ROS形成增加导致耳蜗稳态失衡有关，这也可解释为何人工耳蜗干预对MTS患者的效果不佳；而针对该类人群，我们推测听觉脑干植入可能更为适合，其相关研究仍需更进一步的探索。

综上，本研究成功构建了Timm8a^-^/- 小鼠模型，并对Timm8a^-^/- 小鼠的内耳功能及形态学进行分析，结果发现该小鼠较WT小鼠的听力阈值有所上升，内耳SV结构出现了异常，线粒体结构异常的占比较高；该结果或将为深入探索TIMM8A在内耳中的功能奠定基础。后续，我们将继续对Timm8a^-^/- 小鼠的内耳细胞的线粒体功能开展研究，并对其ROS水平是否发生改变进行实验，以探索MTS引起耳聋的作用机制。

作者贡献声明

杨涛、吴皓参与了课题指导，洪晗馨、王龙昊参与了实验设计与实验操作，洪晗馨、王龙昊、刘辉辉、彭浒参与了数据整理、论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意了最终稿件的提交。

YANG Tao and WU Hao contributed to the study instruction. HONG Hanxin and WANG Longhao participated in the experimental design and operation. HONG Hanxin, WANG Longhao, LIU Huihui and PENG Hu participated in data collation, paper writing and revision. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

利益冲突声明

所有作者声明不存在利益冲突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

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原文顺序

文献年度倒序

文中引用次数倒序

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... 线粒体内膜转位酶8A（translocase of inner mitochondrial membrane 8A，TIMM8A）基因定位于性染色体Xq22.1，包含2个外显子和1个内含子，可编码含97个氨基酸的小多肽.既往研究表明TIMM8A在线粒体内外膜间的物质转运过程中发挥了重要作用^［1］.研究^［2］显示，TIMM8A突变可导致Mohr-Tranebjaerg综合征（Mohr-Tranebjaerg syndrome，MTS），又称耳聋-肌张力障碍-视神经病变综合征（deafness-dystonia-optic neuropathy syndrome，DDONS），是一种罕见的X连锁隐性遗传病.临床上，MTS患者多为男性，主要表现为进行性神经退行性病变；患者在儿童早期即出现语前或语后听神经病谱系障碍（auditory neuropathy spectrum disorder，ANSD）^［3］，青少年时期出现缓慢进行性肌张力障碍或共济失调，20岁左右开始出现视神经萎缩导致缓慢进行性视力下降，40岁左右出现认知功能障碍、人格变化、偏执等异常精神症状.且该疾病的临床症状及发病时间不一，具有临床及遗传异质性^［4］. ...

... 对于在儿童早期出现ANSD的DDONS患者，采用人工耳蜗植入进行治疗的效果并不理想.有研究^［5］对DDONS患者的颞骨进行病理解剖后发现其耳蜗神经已完全丧失，而该丧失的机制仍不清楚，且尚未有适合的动物模型能够对该机制进行探索.基于此，为探究TIMM8A基因在内耳中发挥的作用，本研究构建了Timm8a基因敲除小鼠（即Timm8a^-^/- 小鼠），对其听力表型及Timm8a基因表达缺失对内耳功能的影响进行分析，以期为后续深入研究该基因在内耳中的功能作用提供一定的理论支持. ...

... 线粒体疾病（mitochondrial diseases，MDs）属遗传性罕见疾病.细胞中，约有超1 500种线粒体蛋白参与、维持线粒体的正常功能，其中任一编码线粒体的基因发生有害突变均可能导致MDs.研究^［6-7］显示，线粒体的遗传信息受核基因组和线粒体基因组双重控制，且已有超300个线粒体相关基因被证明与人类疾病的发生有关.MDs可累及全身器官，通常具有显著的临床和遗传异质性^［8-9］.尽管所有器官都可能受到MDs的影响，但高能量代谢器官（如神经系统、骨骼肌、心肌等）常会较早地表现出相关症状^［10］.作为高能量代谢器官之一，耳蜗常常受到MDs的累及，使得该类患者常伴有听力障碍，且其生活质量亦受到极大影响，因此对听力障碍等临床症状的支持性治疗显得至关重要^［11-12］.由TIMM8A突变导致的MTS也属于MDs，该综合征的首要临床表现为听神经病谱系障碍；对于该类患者，人工耳蜗的干预效果并不理想，且目前尚缺乏有关其发病机制及治疗手段的基础研究.因此，本研究通过构建Timm8a^-^/- 小鼠模型，分析Timm8a基因缺失对内耳功能的影响，从而为Timm8a在内耳中的功能研究提供理论支持. ...

... 本研究结果发现，与WT小鼠相比，Timm8a^-^/- 小鼠ABR的Ⅰ波波幅下降、Ⅰ波潜伏期延长；通过对小鼠内耳HCs、SGN细胞、SV细胞的线粒体超微结构进行观察后发现，相比于WT小鼠，Timm8a^-^/- 小鼠线粒体损伤的比例较高.相关研究^［13-15］发现，线粒体功能障碍与噪声性听力损失、年龄相关性听力损失、耳毒性药物诱发性听力损失及遗传性听力损失均相关.在大多数哺乳动物细胞中，线粒体是活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要来源.耳蜗线粒体的功能异常可导致ROS水平增加，从而引起线粒体结构进一步受损，包括线粒体膜、线粒体DNA、呼吸链蛋白和与线粒体功能相关的核DNA^［16］；同时，ROS可产生脂质过氧化产物（如8-异前列腺素F2α），该产物会导致血管收缩，继而减少耳蜗中的血流量，最终导致细胞凋亡^［17-18］.基于上述研究，我们推测Timm8a^-^/- 小鼠听力障碍可能与内耳线粒体功能异常、ROS形成增加导致耳蜗稳态失衡有关，这也可解释为何人工耳蜗干预对MTS患者的效果不佳；而针对该类人群，我们推测听觉脑干植入可能更为适合，其相关研究仍需更进一步的探索. ...

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