丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor，serpin）是规模最大、分布最广的一类蛋白酶抑制剂超家族，广泛存在于动物、植物、细菌、病毒和古菌中^［1-6］。Serpin家族成员多数由330~500个氨基酸残基组成，它们的一级序列同源性不高（约25%），但二级和三级结构极其相似。典型的serpin主要由1个包含8~9个α螺旋（helix A~I）、3个β片层（β-sheet A~C）的保守主体结构和1个暴露在分子表面的反应中心环（reactive center loop，RCL）组成^［6］。RCL的长度和序列的多样性决定着serpin靶蛋白酶的特异性。

不同于其他蛋白酶抑制剂家族对蛋白酶非共价抑制作用的锁钥（lock-and-key）机制，serpin对蛋白酶抑制是不可逆的。在天然状态下，处于亚稳态构象的serpin利用RCL捕获靶蛋白酶并与之形成以共价酰酯键连接的复合物。随后，RCL被水解（被水解肽键往N端方向氨基酸依次命名为P1、P2、P3……，往C端方向依次命名为P1'、P2'、P3'……）并部分插入至s3A（β-sheet A第3条折叠股链）与s5A之间作为新的s4A，这导致β-sheet A扩展而主体结构松弛，此时能级达到最低。与s4A相连的蛋白酶被拉扯至serpin底部的同时，也因活性中心形变而失去活性^［7］。Serpin这种由紧凑（S型）向松弛（R型）状态转变的不可逆抑制作用被称为“自杀性抑制”。

在过去的数十年里，人们对哺乳动物serpin的结构、功能和调控机制已经做了相当细致的研究^［8］。这些serpin分为抑制型和非抑制型2类，参与调节人体的很多生理过程，例如血液凝集^［9］、炎症反应^［10］、组织重塑^［11］、细胞凋亡^［12］、激素转运^［13-14］、肿瘤抑制^［15］、分子伴侣^［13］等，而且这些serpin结构与生理功能的失衡，以及多种疾病的发生和发展密切相关^［16-17］。

相较于对哺乳动物serpin的广泛研究，其他种属serpin的研究相对较少。前期已经有少量针对原核生物serpin的报道^{［4，18-21］}。例如，2002年IRVING等^［4］首次在细菌和古菌的基因组中鉴定了12个serpin的基因序列。随后人们又在极端嗜热的Thermococcus kodakaraensis中发现了具有耐酸和热稳定性的Tk-serpin，它能够抑制环境中的蛋白酶从而保护细菌免受侵害^［18］。最近人们也从人体牙周寄生细菌Tannerella forsythia和肠道寄生菌中发现相关serpin，它们可能通过抑制炎症相关丝氨酸蛋白酶参与人体的炎症反应^［19-20］。而针对原核生物蓝藻来源serpin的结构、功能研究目前尚未有报道。

钝顶节旋藻（Arthrospira platensis）是一种富含天然活性物质的光合自养蓝藻；近些年来，钝顶节旋藻作为高营养食品和膳食添加剂被广泛研究，极具经济价值^［22-23］。在医药领域，钝顶节旋藻富含高活性蛋白、脂多糖和亚麻酸，其水提取物被发现具有抗病毒^［24-25］、抗氧化^［26］、抗疟疾^［27］、促进伤口愈合^［28］和抗癌^［29-31］等活性；其高表达的藻蓝蛋白能显著抑制癌细胞的生长且不良反应较小^［32-34］。本研究利用基因组与氨基酸序列比对分析，在钝顶节旋藻中发现了1个新的serpin，并命名为arthropin；通过构建pSUMO3-arthropin融合表达载体，表达、纯化arthropin蛋白，尝试了对其结晶条件的初步筛选，同时检测了它对14种不同丝氨酸蛋白酶的抑制活性，为后续针对其结构和功能的研究奠定了基础。

大肠埃希菌（E.coli）BL21（DE3）购自天根生化科技（北京）有限公司。pSUMO3表达载体由本实验室改造并保存。原pSUMO3载体表达的融合蛋白携带小分子泛素样修饰蛋白（small ubiquitin-like modifier，SUMO），其在提高融合蛋白的表达水平同时，可被小泛素修饰特异性蛋白酶2（sentrin-specific protease 2，SENP2）完整切割^［35］。本实验室对原pSUMO3表达载体［购自安升达（天津）生物科技有限公司］进行优化，删除了SUMO标签末端甘氨酸至限制性内切酶BamHⅠ酶切位点前的碱基序列，这使得融合蛋白被酶切后仅残留1个丝氨酸，减少对后续蛋白质结晶的影响。

氨苄青霉素及缓冲液配制试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司，2×YT培养基购自英国Oxoid公司，异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）购自上海麦约尔生物技术有限公司，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）预制胶购自美国Invitrogen公司，14种丝氨酸蛋白酶购自美国Haematologic Technologies公司，激肽释放酶1（kallikrein 1，KLK1）荧光底物（H-D-Val-Leu-Arg-AMC）购自国肽生物科技（北京）有限公司，HisTrap^TM FF预装柱（His标签蛋白纯化柱）、HiTrap^TM Q HP（离子交换预装柱）购自瑞典GE Healthcare公司，SENP2由实验室纯化自用。Crystal Screen^TM蛋白结晶试剂盒购自美国Hampton Research公司。

UH-12型高压细胞破碎仪购自永联生物科技（上海）有限公司，AKTA purifier蛋白纯化仪购自瑞典GE Healthcare公司，Gel Doc XR凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司，96孔坐滴式结晶板购自美国Hampton Research公司，Screenmaker 96+8蛋白结晶配液工作站购自瑞士Tecan公司，LG-P52倒置显微镜购自日本Olympus公司。

利用经典的serpin α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin）的氨基酸序列在人类口腔微生物组数据库（eHOMD，http：//www.homd.org/）进行氨基酸序列比对；选取序列同源性较高的疑似serpin（score>100），并与α1-抗胰蛋白酶、人源性激肽释放酶结合蛋白（kallistatin，KAL）、miropin等serpin的氨基酸序列再次比对，着重分析活性中心与保守区域的氨基酸序列；使用SWISS软件对初步筛选获得的疑似serpin同源建模并分析结构。将新型serpin的基因序列交由安升达（天津）生物科技有限公司进行全基因技术合成，同时委托其完成密码子优化与融合表达载体的构建。

将融合表达载体pSUMO3-arthropin转化至大肠埃希菌BL21（DE3），并涂布于含氨苄青霉素的LB固体平板。37 ℃倒置培养过夜后，挑取单个菌落至含氨苄青霉素的2×YT液体培养基，于37 ℃、220 r/min摇床上扩菌，直至菌液在600 nm处的光密度值达到0.6。加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导表达，并将温度降至20 ℃继续培养12 h，结束后4 ℃离心收集菌体。另留取少量诱导前、后的菌液，利用SDS-PAGE验证融合蛋白的表达情况。

将收集的细菌用缓冲液A［20 mmol/L Tris-HCl（pH=7.4）、0.5 mol/L NaCl、20 mmol/L咪唑］重悬，并在6×10⁴ kPa压强下破碎细胞。用HisTrap^TM FF预装柱挂载离心后的细菌裂解上清液，而后进行20~300 mmol/L咪唑的连续梯度洗脱（缓冲液B：其他成分与缓冲液A相同，仅咪唑浓度变化）。将收集的280 nm吸收峰的峰尖洗脱液透析去除咪唑，再使用蛋白酶SENP2消化融合蛋白12 h（融合蛋白∶SENP2=100∶1），使His-SUMO3标签游离。将消化液再次挂载于HisTrap^TM FF预装柱，收集流穿液中的arthropin。最后，将流穿液透析至缓冲液C［20 mmol/L Tris-HCl （pH=8.0）、0.1 mol/L NaCl］，再挂载于HiTrap^TM Q HP预装柱，进行100~1 000 mmol/L NaCl的连续梯度洗脱，收集280 nm吸收峰的峰尖洗脱液，即可得到高纯度的arthropin蛋白。每步纯化均使用SDS-PAGE分析验证。

选取本实验室常用的14种丝氨酸蛋白酶，包括活化的凝血因子Ⅸ（activated factor Ⅸ，FⅨa）、活化的凝血因子Ⅹ（FⅩa）、活化的凝血因子Ⅺ（FⅪa）、活化的蛋白C（activated protein C，APC）、组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator，tPA）、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶（human neutrophil elastase，HNE）、猪胰腺弹性蛋白酶（pancreatic elastase，PE）、胰蛋白酶（trypsin）、KLK1、KLK7、蛋白酶3（proteinase 3，PR3）、凝血酶（thrombin，又称FⅡa）、组织蛋白酶B（cathepsin B，CaB）、组织蛋白酶G（cathepsin G，CaG）。利用抑制型serpin能与蛋白酶形成共价复合物的特点，将纯化好的arthropin（3 μg）分别与14种蛋白酶（0.4 μg）混合并于37 ℃孵育30 min，利用SDS-PAGE分析可直观显示arthropin与14种蛋白酶的结合情况。

在20 μL反应体系中，将KLK1（终浓度0.1 μmol/L）分别与不同浓度arthropin（终浓度0~3.2 μmol/L）混合并于室温孵育20 h，再添加180 μL含有KLK1荧光底物（终浓度0.1 mmol/L）的缓冲液［PBS、0.1 mg/mL牛血清白蛋白、0.1%聚乙二醇8000（PEG-8000）］，检测460 nm处荧光信号强度。当荧光底物完整时，其C端7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）的荧光信号被N端H₂N基团吸收；而当底物被KLK1水解，释放的AMC在380 nm处被激发，继而在460 nm处显示荧光信号，根据反应物在460 nm处荧光信号强度的变化即可计算出KLK1的剩余活性。将arthropin/KLK1浓度比与体系中KLK1剩余活性进行线性拟合即可得到该反应的化学计量比（stoichiometry inhibition，SI）^［36］。

二级反应表观速率常数（apparent second-order rate constant，k_app）的检测是在伪一级反应条件（即arthropin浓度远大于KLK1浓度）下进行的。将0.1 μmol/L KLK1与一定浓度的arthropin混合并孵育不同时间，再利用0.1 mmol/L KLK1荧光底物缓冲液检测反应体系中KLK1的剩余活性，将剩余活性的负对数与孵育时间线性拟合，其斜率即是一级反应速率常数（first order rate constant，k_obs）。将不同arthropin浓度（3~12 μmol/L）反应的k_obs与arthropin浓度进行线性拟合，其斜率即是k_app，而二级反应速率常数（second-order association rate constant，k₂）=k_app×SI^［36］。

将Crystal Screen^TM 蛋白结晶试剂盒包含的1 600种结晶试剂分别以65 nL/孔分装至96孔坐滴式结晶板上，在20 ℃下，将200 nL高纯度、性质均一的arthropin蛋白溶液（13 mg/mL）与200 nL结晶试剂混合并接种于96孔坐滴式结晶板，密封。所有操作均由自动化分液机器人完成。针对初筛结果，选取晶型较好的结晶条件进行优化，即调整蛋白质浓度、沉淀剂浓度、体系pH值和结晶温度等，以期获得晶型更好的蛋白晶体。另一方面，用冷冻环（cyoloop）将初筛所得晶体捞取并放入冷冻保护剂（在原结晶条件基础上加入25%甘油）。液氮中瞬间冷冻后，于上海同步辐射光源（Shanghai Synchrotron Radiation Facility，SSRF）18U进行X射线衍射并采集数据。

将arthropin的氨基酸序列导入至蛋白预测结构数据库（AlphaFold Protein Structure Database，https：//alphafold.ebi.ac.uk）进行自动化的三维结构预测，再对生成的arthropin结构模型进行分析。

通过对氨基酸序列的比对与分析，在钝顶节旋藻中发现了一个新的serpin，并把它命名为arthropin。与经典serpin的RCL序列比对结果（图1）显示，arthropin具有典型的抑制型serpin反应中心环，其P9~P17基本符合ExGTEAAAA（x=E/K/R）的保守序列规律，而活性中心P1-P1'是抑制型serpin最常见的R-S，提示arthropin可能具有抑制丝氨酸蛋白酶的活性。Arthropin基因序列插入优化后的pSUMO3质粒（BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间）构建融合表达载体pSUMO3-arthropin。

将融合表达质粒pSUMO3-arthropin转入大肠埃希菌BL21（DE3）后，利用IPTG进行诱导表达。结果显示，诱导后的大肠埃希菌裂解总蛋白中检测到大量相对分子质量约为60 000的蛋白，与His-SUMO3-arthropin理论相对分子质量（60 800）相近，推测为arthropin融合蛋白（图2A）；而细菌裂解上清液中只有少量该蛋白，提示大部分融合蛋白以包涵体的形式存在，仅有少部分以可溶性蛋白的形式存在。后续我们采用HisTrap^TM FF预装柱（镍离子亲和层析）从细菌裂解上清液中纯化His-SUMO3-arthropin融合蛋白，然后通过SENP2酶切及第2次镍离子亲和层析去除His-SUMO3标签，并通过HiTrap^TM Q HP预装柱（阴离子交换层析）进一步纯化arthropin，最终获得了高纯度的、与理论相对分子质量（45 800）相近的重组arthropin（图2B、C）。

为了鉴定arthropin抑制丝氨酸蛋白酶的特异性，我们将重组arthropin与14种丝氨酸蛋白酶分别反应，然后通过SDS-PAGE检测其与丝氨酸蛋白酶形成共价复合物的情况。图3A结果显示，arthropin不能与HNE和PE形成复合物，反而是作为底物被这2种蛋白酶降解，变成1条相对分子质量稍小的蛋白条带及1条低于10 000的条带。Arthropin能与FⅩa、APC、FⅨa、FⅪa、胰蛋白酶、CaG、KLK1、KLK7和FⅡa形成稳定的共价复合物条带，其中与KLK1形成的复合物条带最深，这说明arthropin对这些蛋白酶有抑制活性，可能对KLK1的抑制作用最为显著。

为了更直观地了解arthropin对蛋白酶的抑制能力，我们利用动力学方法检测了arthropin抑制KLK1的反应速率。图3B结果显示，arthropin抑制KLK1的SI值为5.1±0.5，k_app为（3.3±0.1）×10² L/（mol·s）。所以，arthropin对KLK1的k₂为1.7×10³ L/（mol·s），低于其他细菌来源的serpin（如miropin、siropin等）^{［19-20，37-40］}。以上结果表明，arthropin是一种抑制型serpin，对多种蛋白酶有抑制活性，但反应速率较低。

为了明确arthropin的结构特点并更直观地阐明其抑制机制，我们尝试筛选arthropin的结晶条件，为后续晶体结构的解析奠定基础。在以聚乙二醇或磷酸盐作为沉淀剂，溶液pH为5.6~7.6的结晶试剂中，arthropin可以形成碎片状、针状和小颗粒状的蛋白质晶体（图4）。其中，片状晶体棱角分明且光泽较好［结晶条件：25%聚乙二醇单甲醚550（PEG MME 550）、0.1 mol/L吗啉乙磺酸（MES，pH 6.5）、0.01 mol/L ZnCl₂］，但由于该晶体较小，X射线衍射后分辨率仅为10 Å（1 Å=1×10^－10 m）。

为了获得一些关于arthropin的三维空间结构信息，我们利用AlphaFlod Colab预测了arthropin亚稳态结构模型；结果（图5）显示，arthropin具有经典的抑制型serpin的结构特点，具有中间完整的β-sheet A和暴露在分子表面的RCL，这是其抑制活性的结构基础。Arthropin的表面电荷分析结果显示，其分子表面多数携带负电荷，表面正电荷较少，结合其理论等电点为5.35，我们认为arthropin是一种偏酸性蛋白。

丝氨酸蛋白酶家族成员数量庞大，其序列同源性不高，但结构高度一致。无论是真核或原核生物serpin总能以多样的RCL抑制特定的丝氨酸蛋白酶。事实上，抑制型serpin中多样化的RCL同样存在一定的保守规律^［41］。RCL的P1~P7基本决定了serpin的特异性，它们的保守程度较低，多数是疏水氨基酸，其中作为活性中心的P1大多数是精氨酸或亮氨酸。P8多数是小侧链氨基酸。而P9~P17是RCL的铰链区，通常富含丙氨酸，并且序列较为保守^［2，4］。P14作为第一个侧链被掩藏的氨基酸尤为重要，必须是不带电氨基酸；若将P14突变为带电氨基酸，虽不影响纤溶酶原激活物抑制物1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）对蛋白酶的识别，但将使其丧失对蛋白酶的抑制活性^［41］。本研究中，arthropin的P1为精氨酸，其RCL的序列亦符合典型的抑制型serpin的保守规律，因此属于抑制型serpin的可能性较大。

为了进一步验证和探究arthropin潜在的生理功能，我们利用原核表达系统对arthropin进行了重组表达，arthropin融合蛋白多数以无活性的包涵体形式存在，仅有少部分以可溶性蛋白的形式存在。目前报道的其他原核生物serpin，如miropin、siropin和TK-serpin的纯化后产量为每升菌液25 μg、12 mg和10 mg^［18-20］，而arthropin纯化后产量为每升菌液1.8 mg，该产量高于miropin，但与其他原核生物serpin相比处于较低水平。考虑到在常规表达条件下，上清液中的融合蛋白多数以有活性的亚稳态构象存在，且常规产量已满足后续实验需求，本研究未对表达条件进一步优化。由于表达的融合蛋白溶液中含有较多杂蛋白，因此本研究采用了镍离子亲和层析、酶切、反向镍离子亲和层析、阴离子交换层析的4步层析纯化，最终得到了高纯度的重组arthropin蛋白。

将纯化后的arthropin重组蛋白用于晶体结构解析，仅能得到分辨率为10 Å的蛋白质晶体，尚不足以解析其结构。分析其主要原因有二：一是重组蛋白均一性不足，后续研究可通过增加凝胶过滤层析等纯化步骤进一步提高蛋白均一性；二是重组蛋白自身结构过于灵活，不利于蛋白质晶体的形成。以往对真核生物serpin的结构与功能研究已知，保证serpin的主体结构及RCL完整是其发挥抑制功能的前提，而serpin N端可能存在的非二级结构片段一般不具有生理功能^［1］。基于arthropin的结构模型，并将其氨基酸序列与α1-抗胰蛋白酶进行比对，我们发现arthropin的N端可能存在长度为52个氨基酸的非二级结构片段，该片段长度与经典serpin——α1-抗胰蛋白酶相近，将此片段截短可能有利于重组蛋白结晶。

Arthropin与丝氨酸蛋白酶共孵育的SDS-PAGE结果显示，arthropin对9种蛋白酶发挥抑制活性，其中对KLK1的抑制作用可能最为显著。Arthropin对KLK1的抑制速率（k₂）为1.7×10³ L/（mol·s），略低于其他原核生物serpin，远低于真核生物serpin。天然状态下，原核生物serpin对丝氨酸蛋白酶的抑制速率为10⁴~10⁵ L/（mol·s）。例如，thermopin抑制胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）的速率为8.4×10⁴ L/（mol·s）^［37］，双歧杆菌中serpin抑制中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase）的速率为4.7×10⁴ L/（mol·s）^［38］，aeropin抑制胰凝乳蛋白酶的速率为1.8×10⁵ L/（mol·s）^［39］等。而真核生物serpin抑制作用的速率为10⁵~10⁶ L/（mol·s）^［40］。Arthropin对蛋白酶较低的抑制速率可能与其较广谱的抑制能力有关。

Miropin是首个被发现具有广谱抑制能力的原核生物serpin，其来源于口腔牙周疾病相关细菌；在应激时，miropin通过抑制多种蛋白酶保护细菌自身的存活^{［19，42］}。而蓝藻作为最古老的原核生物之一，同样具有抵御各种生物和环境侵袭的生命机制^［43］。蓝藻天然生产的次生代谢化合物便多数具有显著的蛋白酶抑制活性^［44］，例如铜绿菌素（aeruginosin）^［45］、微囊藻毒素（microcystins）^［46-47］、草抑制素A~C（grassystatin A‒C）^［29］等。Arthropin来源于钝顶节旋藻，基于arthropin拥有比miropin更为广谱的丝氨酸蛋白酶抑制能力，我们推测arthropin极有可能是作为蓝藻机体防御中重要的一员。在本研究筛选范围内，arthropin抑制的蛋白酶多数与凝血相关。虽然目前arthropin的天然靶蛋白酶尚不清楚，但是它可能通过抑制多种外源性的丝氨酸蛋白酶，发挥保护自身免受侵害的作用。

综上所述，本研究发现并制备了来源于钝顶节旋藻的新型丝氨酸蛋白酶抑制剂arthropin；并对其初步的靶蛋白酶筛选揭示arthropin拥有广谱的丝氨酸蛋白酶抑制活性，这可能对其发挥保护自身免受环境蛋白酶侵害意义重大。同时，我们对arthropin结晶条件的筛选也为更深入地探索arthropin结构与作用机制奠定了基础。