C9ORF72基因1号内含子区GGGGCC重复序列［GGGGCC repeat，（G₄C₂）_n］的扩增突变是导致遗传性肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）和额颞叶痴呆（frontotemporal dementia，FTD）发生的最常见病因^［1］。异常扩增的（G₄C₂）_n可通过由重复序列介导的不依赖AUG（repeat associated non-AUG，RAN）翻译产生5种聚二肽重复蛋白（dipeptide repeat protein，DPR），其中以多聚甘氨酸-精氨酸（poly-glycine-arginine，poly-GR）的细胞毒性最为显著^［2-3］。有尸检结果^［4］发现，poly-GR主要分布在皮层、海马及小脑区域，其在脑内的分布很大程度上与C9ORF72 ALS/FTD患者疾病累及的脑区重叠；继而提示较其他的DPR，poly-GR与C9ORF72 ALS/FTD患者的神经元损伤关系更为密切。相关研究^{［2，5-6］}已证实，poly-GR可通过引起DNA损伤、翻译抑制及线粒体功能障碍等造成神经元死亡，其中线粒体功能障碍被认为是poly-GR导致神经元死亡的早期病理事件之一。因此，有效降低poly-GR水平、减轻poly-GR对线粒体功能的损伤是降低poly-GR细胞毒性的重要手段。

已有研究^［7］证实蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）对poly-GR毒性具有重要调控作用，过表达AKT或利用AKT激动剂SC79促进AKT的磷酸化均可有效降低poly-GR水平及其细胞毒性。而poly-GR过表达是否会引起AKT及其磷酸化水平的异常，该异常与poly-GR导致线粒体功能障碍的相关性如何，目前则鲜少有报道，进而也缺乏以AKT或线粒体为靶点来抑制poly-GR相关毒性的应用尝试。临床上，二甲双胍是治疗糖尿病的一线用药，其已被证实可有效恢复神经退行性疾病模型中的线粒体功能障碍；且有研究提示，二甲双胍也可促进AKT磷酸化^［8］。基于此，本研究就poly-GR过表达对线粒体功能、AKT及其磷酸化水平的影响进行分析，并就二甲双胍对由poly-GR诱导的线粒体功能异常及细胞凋亡的影响进行探讨，以期为缓解poly-GR细胞毒性、延缓C9ORF72 ALS/FTD进展提供有效的策略。

人胚肾细胞293T、人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

MitoSOX Red线粒体超氧化物指示剂（Invitrogen，美国），碘化丙啶（propidium iodide，PI；上海懋康生物科技有限公司），In-Fusion试剂盒（TaKaRa，日本），二甲双胍（上海碧云天生物科技有限公司），AKT激动剂SC79（MedChemExpress，美国），FLAG抗体（Sigma，德国），β-actin抗体、磷酸化AKT（T308）抗体、AKT抗体、GAPDH抗体、线粒体外膜转位酶20（translocase of outer mitochondrial membrane 20，TOM20）、热激蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）抗体（Cell Signaling Technology，美国），辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG、Alexa Fluro 488或555荧光标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG（Thermo Fisher Scientific，美国），ATP检测试剂盒（Caymen，美国）。共聚焦显微镜（ZEISS，德国），倒置相差荧光显微镜（Nikon，日本），化学发光仪（上海勤翔科学仪器有限公司），透射电子显微镜（Hitachi，日本），多功能酶标仪（BioTek，美国）。

于37 ℃、5%CO₂的恒温培养箱中，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/mL链霉素的DMEM高糖完全培养基分别培养293T、SK-N-SH细胞。每隔2~3 d传代1次，取对数生长期的细胞用于后续实验。

利用PCR分别扩增含有AgeⅠ和BamHⅠ酶切位点的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）、50个重复甘氨酸-精氨酸序列［（glycine-arginine）₅₀，（GR）₅₀］优化密码子的核酸片段［其中（GR）₅₀片段C端带有FLAG标签蛋白序列］，随后经琼脂糖凝胶电泳纯化、回收。利用AgeⅠ和BamHⅠ限制性内切酶线性化慢病毒载体质粒lentiCas9-Blast，而后采用In-Fusion试剂盒分别将上述回收的2种核酸片段插入线性化载体中，以构建过表达GFP、（GR）₅₀的慢病毒质粒即lenti-GFP及lenti-（GR）₅₀。

根据慢病毒包装试剂说明书，将慢病毒质粒lenti-GFP或lenti-（GR）₅₀配置成质粒-转染试剂混合液，室温静置15 min后均匀滴加至培养皿中。于转染后72 h，利用0.45 μm过滤器收集慢病毒上清液，立即使用或存放于-80 ℃备用。

将SK-N-SH细胞（5×10⁵/mL）接种于6孔板中，分别加入由“1.2.3”部分收集到的2种慢病毒上清液，于37 ℃、5%CO₂恒温培养箱中培养24 h后，更换为DMEM高糖完全培养基，并向其中添加3 μg/mL嘌呤霉素进行筛选，以获得稳定过表达GFP、（GR）₅₀的细胞［即GFP CTRL-SK、（GR）₅₀-SK细胞］。

采用荧光显微镜观察GFP CTRL-SK细胞内GFP的表达情况。采用蛋白质印迹法（Western blotting）对上述构建的稳定过表达细胞进行验证。向上述2种细胞中加入蛋白裂解液，而后于4 ℃下14 000×g离心10 min，取上清液行蛋白浓度测定，再通过Western blotting检测（GR）₅₀的C末端FLAG标签蛋白的表达以分析（GR）₅₀的过表达效率，并以此验证（GR）₅₀-SK细胞的构建是否成功；其中，一抗为β-actin、FLAG抗体（稀释比例均为1∶1 000），二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG（稀释比例为1∶5 000）。

于24孔板培养GFP CTRL-SK、（GR）₅₀-SK细胞，向其中分别添加1 μmol/L PI，37 ℃孵育30 min后，于共聚焦显微镜下观察并统计PI染色阳性细胞数量（即凋亡细胞数量）。每种细胞设置5个复孔，每孔取4个视野。

采用免疫荧光（immunofluorescence，IF）染色研究（GR）₅₀蛋白在细胞内的定位情况。分别将（GR）₅₀-SK、GFP CTRL-SK细胞以30%~40%密度铺种于小圆玻璃片上，利用含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）于室温下固定细胞，并对其行透化、封闭等处理。采用一抗、二抗孵育后，行DAPI细胞核染色；其中，一抗为FLAG抗体（稀释比例为1∶300）、TOM20抗体及HSP90抗体（稀释比例均为1∶200），二抗为Alexa Fluro 488或555荧光标记羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG（稀释比例均为1∶500）。于共聚焦显微镜下观察荧光信号分布，以明确（GR）₅₀蛋白在细胞内的定位情况。

将2.5 μmol/L MitoSOX Red分别加入培养的（GR）₅₀-SK、GFP CTRL-SK细胞中，37 ℃孵育30 min后用Hank′s平衡液漂洗3次，于共聚焦显微镜下观察红色荧光强度，以评估细胞内的线粒体活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。

分别将（GR）₅₀-SK、GFP CTRL-SK细胞铺于10 cm培养皿中，待细胞生长融合达70%~80%后，通过胰蛋白酶消化及低速离心，收集绿豆大小的细胞团。向其中加入电镜固定液，于4 ℃固定5 min，经PBS漂洗2次后用0.1 mol/L PBS配制的1%锇酸于室温下避光固定2 h，再经PBS漂洗、室温脱水、包埋后采用超薄切片机进行处理，于醋酸锂染色后在透射电子显微镜下观察线粒体形态，并对其形态进行定量分析（包括正常线粒体的百分比统计、线粒体短径测量）。

将（GR）₅₀-SK、GFP CTRL-SK细胞以30%~40%密度接种于6孔板中，按“1.2.4”部分中的步骤进行裂解、离心制备蛋白上清液，并采用Western blotting检测细胞中的AKT及其磷酸化水平；其中，一抗为磷酸化AKT（T308）、AKT及GAPDH抗体（稀释比例均为1∶1 000），二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG（稀释比例均为1∶5 000）。

使用2 μmol/L的AKT激活剂SC79处理（GR）₅₀-SK细胞，并设置二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）处理为空白对照组。按照“1.2.9”部分中的步骤制备蛋白上清液并检测AKT及其磷酸化水平。而后，按照“1.2.5”及“1.2.7”部分中的步骤，检测SC79对（GR）₅₀-SK细胞的凋亡水平、线粒体ROS水平的影响。

采用0.2 mmol/L二甲双胍分别处理（GR）₅₀-SK、GFP CTRL-SK细胞72 h，设置PBS处理为对照，共计4组。药物处理结束后，按照“1.2.9”部分中的步骤检测4组细胞的AKT及其磷酸化水平。而后，按照“1.2.5”及“1.2.7”部分中的步骤，检测4组细胞的凋亡水平及线粒体ROS水平，并通过“1.2.8”部分中的步骤检测经PBS或二甲双胍处理的（GR）₅₀-SK细胞的线粒体形态。

利用ATP检测试剂盒对“1.2.11”部分中的4组细胞的ATP浓度进行检测，即于多功能酶标仪上检测细胞的相对光单位（relative light unit，RLU）值，并根据标准曲线（ATP标准品的RLU值）计算不同组别细胞的ATP浓度。具体操作步骤参见试剂盒说明书。

采用Image J软件进行图像处理、细胞数目统计。采用Microsoft Excel 2019软件进行数据分析及统计图制作。定量资料用x±s表示，2组间比较采用双尾t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

采用Western blotting对已构建的GFP CTRL-SK、（GR）₅₀-SK细胞中FLAG标签蛋白的表达水平进行检测，结果（图1A）显示与GFP CTRL-SK细胞相比，（GR）₅₀-SK细胞能够稳定表达（GR）₅₀蛋白C末端的FLAG标签蛋白；同时，荧光显微镜观察发现GFP CTRL-SK细胞能够稳定表达GFP（图1B）。继而提示，（GR）₅₀-SK及GFP CTRL-SK稳转株构建成功。随后，利用PI染色检测GFP CTRL-SK、（GR）₅₀-SK细胞的凋亡水平，结果（图1C）显示（GR）₅₀-SK细胞中PI阳性细胞数量显著多于GFP CTRL-SK细胞（P=0.016），提示（GR）₅₀-SK细胞的凋亡水平较高。

为分析由（GR）₅₀引起的细胞凋亡水平升高是否与线粒体损伤相关，我们首先对（GR）₅₀与线粒体在细胞内的位置关系进行分析，结果（图1D）显示（GR）₅₀与TOM20或HSP90（线粒体基质蛋白）存在部分共定位。而后，我们利用MitoSOX Red就（GR）₅₀对线粒体中ROS水平的影响进行评估，结果（图1E）显示（GR）₅₀-SK细胞中ROS水平较GFP CTRL-SK细胞有明显升高，提示（GR）₅₀蛋白可导致线粒体的功能受损。最后，利用透射电子显微镜观察该2种细胞的线粒体形态及结构，结果（图1F、G）显示与GFP CTRL-SK细胞相比，（GR）₅₀-SK细胞中形态正常的线粒体数量较少（P=0.000），线粒体短径有所增加（P=0.010）；且形态存在明显异常，主要表现为内膜连续性破坏、空泡形成、线粒体嵴断裂模糊、自噬小体形成等。

采用Western blotting检测（GR）₅₀-SK、GFP CTRL-SK细胞中AKT及其磷酸化水平，结果（图2A）显示与GFP CTRL-SK细胞相比，（GR）₅₀-SK细胞的AKT表达未发生明显改变，但其磷酸化水平显著降低。为进一步明确AKT磷酸化水平降低在由（GR）₅₀导致的线粒体损伤及细胞凋亡中的作用，我们利用AKT磷酸化激动剂SC79处理（GR）₅₀-SK细胞并采用Western blotting进行检测，结果（图2B）显示SC79可显著促进AKT的磷酸化。而后，行MitoSOX Red超氧化物指示剂染色及PI染色检测，结果（图2C、D）显示在SC79作用后，（GR）₅₀-SK细胞线粒体中的红色荧光强度变弱，PI染色阳性细胞数量明显减少；继而提示，AKT磷酸化水平增加可显著降低该细胞线粒体的ROS水平并减少细胞凋亡。

为明确二甲双胍能否有效改善由（GR）₅₀导致的AKT磷酸化水平降低，本研究采用二甲双胍分别处理（GR）₅₀-SK、GFP CTRL-SK细胞后，通过Western blotting、MitoSOX Red超氧化物指示剂染色、透射电子显微镜观察、ATP浓度检测、PI染色等评估细胞的AKT及其磷酸化水平、线粒体ROS水平、线粒体形态、线粒体生成ATP的能力及细胞凋亡水平。结果如图3所示。Western blotting的结果（图3A）显示，与PBS处理组相比，二甲双胍可有效恢复（GR）₅₀-SK细胞中的AKT磷酸化水平，但对GFP CTRL-SK细胞的AKT磷酸化水平无影响；MitoSOX Red染色的结果（图3B）显示，与PBS处理组相比，二甲双胍可显著降低（GR）₅₀-SK细胞的线粒体ROS水平，但对GFP CTRL-SK细胞无影响；透射电子显微镜的观察结果及定量分析的结果（图3C、D）显示，与PBS处理组相比，二甲双胍可有效促进（GR）₅₀-SK细胞中线粒体嵴结构重塑，其正常形态的线粒体数量有所增加（P=0.010）；ATP检测的结果（图3E）则显示，（GR）₅₀-SK细胞中的ATP浓度较GFP CTRL-SK细胞有所下降（P=0.000），而与PBS处理的（GR）₅₀-SK细胞相比，二甲双胍可显著提高该细胞中的ATP浓度（P=0.000），提示二甲双胍可有效修复由（GR）₅₀导致的线粒体ATP生成能力受损；PI染色的结果（图3F）显示，与PBS处理组相比，二甲双胍处理组的（GR）₅₀-SK细胞中PI阳性细胞数明显减少（P=0.000），提示二甲双胍可有效降低由（GR）₅₀诱导的细胞凋亡。

Poly-GR主要分布于细胞质中，因富含正电荷的精氨酸且与线粒体靶向序列（mitochondria targeting sequence，MTS）相似，使得其能够靶向定位并富集于线粒体外膜上，进而可通过多项机制诱导线粒体发生形态及功能损伤^［9］。已有研究证实，在小鼠模型中，（GR）₈₀可与线粒体ATP合酶α亚基（ATP synthase F1 subunit α，ATP5A1）发生特异性结合，促进自身泛素化及降解，从而导致线粒体能量合成减少^［10］；在果蝇模型中，（GR）₈₀可与线粒体内膜复合物结合，使线粒体内嵴形态发生异常并造成线粒体损伤^［11］。Poly-GR的细胞毒性与其转录物重复序列的重复次数相关。本研究采用含有50个重复序列的低毒性的（GR）₅₀来模拟poly-GR在细胞功能受损早期的病理作用及机制，结果显示（GR）₅₀与线粒体部分共定位，并可显著损害线粒体的形态及功能；继而提示，有效恢复线粒体形态及功能将是抑制poly-GR细胞毒性的重要方法。

基于果蝇模型的研究^［7］发现，过表达AKT或促进AKT磷酸化可有效抑制poly-GR水平及其细胞毒性。AKT是重要的线粒体功能调控蛋白^［12-14］。磷酸化的AKT可磷酸化促凋亡蛋白Bcl2相关的激动蛋白（Bcl2-associated agonist of cell death，Bad）和Bcl2相关X蛋白（Bcl2-associated X protein，Bax）以调控线粒体介导的细胞凋亡，可调控视神经萎缩蛋白（optic atrophy 1，OPA1）及动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1，DRP1）水平以促进线粒体融合、减少线粒体分裂及ROS生成，还可与PTEN诱导激酶1（PTEN induced kinase 1，PINK1）/parkin相互作用共同调控线粒体自噬以促进损伤线粒体的清除。在本研究中，我们发现（GR）₅₀可显著下调AKT磷酸化水平，而利用化合物SC79激活AKT磷酸化后，（GR）₅₀诱导的线粒体ROS水平上升及细胞凋亡水平增加均得到了显著抑制。这些发现提示，（GR）₅₀通过抑制磷酸化AKT水平来影响线粒体功能，并最终导致细胞凋亡；因而，有效上调AKT磷酸化水平对修复由（GR）₅₀引起的线粒体功能损伤、抑制细胞凋亡具有重要意义。

二甲双胍长期应用于临床，其安全性、方便性均较高。有研究^［8，15］发现，二甲双胍可促进磷酸化AKT水平升高，且可显著改善神经退行性疾病模型中受损的线粒体功能。因此，我们尝试将二甲双胍作用于（GR）₅₀-SK细胞，以上调磷酸化AKT水平并减轻线粒体功能障碍。本研究的结果显示，二甲双胍可有效恢复（GR）₅₀-SK细胞中磷酸化AKT水平，且能够有效降低（GR）₅₀对线粒体形态及功能的损伤，并减轻（GR）₅₀诱导的细胞病理性凋亡。更有意思的是，二甲双胍被证实能够特异性抑制双链RNA依赖的蛋白质激酶（double-strand RNA-dependent protein kinase，PKR），从而通过PKR-磷酸化EIF2α（真核翻译起始因子2α，eukaryotic translation initiation factor 2α）通路来抑制C9ORF72（G₄C₂）_n RAN翻译，继而从源头上减少poly-GR的生成^［16］。

综上，本研究发现（GR）₅₀可引起线粒体功能及形态异常，并促进细胞凋亡；在机制层面，我们发现（GR）₅₀可通过负性调控磷酸化AKT水平引起线粒体功能障碍及细胞凋亡，且二甲双胍可有效恢复由（GR）₅₀诱导的磷酸化AKT水平降低，修复线粒体形态及功能损伤，并显著减少细胞凋亡。由于二甲双胍已广泛应用于临床，本研究的结果或可为C9ORF72 ALS/FTD治疗提供一个易于临床转化的新策略。