结直肠癌（colorectal cancer，CRC），包括结肠癌和直肠癌，是一种常见的高致死性恶性肿瘤。CRC在全球各类癌症中发病率排名第三，死亡率排名第二^［1］，5年生存率为65%^［2］。我国CRC的发病率近年来呈现上升的趋势^［3］。2020年，中国、欧洲和北美地区的CRC新发病例数量超过全球新发病例总数的一半^［4］。CRC的发病源自肠道腺上皮细胞的异常增殖^［5］，大多数患者被确诊时已处于中晚期^［6］。

CRC的发生发展是一个多基因、多因素、多阶段的过程^［7］。人体免疫系统在CRC的发生发展中发挥重要作用，主要效应细胞组分包括自然杀伤细胞（natural killer cell，NK细胞）、CD4⁺T细胞，CD8⁺T细胞、巨噬细胞和树突状细胞^［8］等。NK细胞是一类具有细胞毒性的固有淋巴细胞，无需预先致敏即可杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞^［9］。同时，NK细胞通过分泌细胞因子γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎性细胞因子，抑制肿瘤细胞增殖和血管生成等过程，参与抗肿瘤免疫的调控^［10］。研究^［11］显示肿瘤组织中NK细胞的浸润水平和患者的预后相关。有研究发现CRC患者外周血^［12］、肿瘤组织^［13］、转移性肝肿瘤^［14］中的NK细胞比例越高，均预示着患者的临床结局更好。

在CRC中，肿瘤浸润的NK细胞数量、表型和功能都会发生改变。HALAMA等人^［15］发现与癌旁组织相比，实体瘤中NK细胞的浸润数量显著减少。一项体外实验的研究^［16］将NK细胞和人结肠癌细胞共培养后发现，NK细胞凋亡比例增加，其表面活化性受体CD16分子表达下调。基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库的分析^［17］显示：预后较差的CRC患者，其肿瘤浸润的NK细胞表面表达程序性死亡受体1（programmed death 1，PD-1）、程序性死亡受体-配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）等免疫耗竭基因显著上调。另外，JOBIN等人^［18］发现CRC患者外周血中的NK细胞分泌细胞因子IFN-γ的含量降低。这些研究表明，CRC中NK细胞的活性和功能可能受损，阻碍其识别和杀伤肿瘤，介导了肿瘤的免疫逃逸。然而，现有研究对NK细胞在CRC肿瘤微环境中的表型和功能变化关注较少。

免疫疗法是当前治疗包括CRC在内的多种实体瘤的主流方法之一^［19］。由于NK细胞非特异性杀伤的特性，基于NK细胞的肿瘤免疫疗法在近年来不断涌现^［20］。临床研究^［19］发现，85%的CRC患者分子分型为错配修复稳定（proficient mismatch repair，pMMR）型或低频微卫星不稳定（low microsatellite instability，MSI-L）型，其对免疫检查点抑制剂疗法无响应或响应较差。深入研究肿瘤浸润NK细胞的表型和功能，有利于我们寻找更新的NK细胞治疗靶点，提高治疗反应性和响应率。

本研究使用患者的新鲜CRC肿瘤组织和癌旁组织，制备单细胞悬液，运用流式细胞术检测CRC肿瘤微环境中的免疫细胞组成，深入探索NK细胞的表型特征和功能状态，以期为精准预测和临床治疗提供参考，助力发展靶向NK细胞的治疗新策略。

选取2022—2023年在上海交通大学医学院附属瑞金医院胃肠外科就医的CRC患者为研究对象。所有样本均采集自患者手术当天。纳入标准如下：①患者既往均未接受抗肿瘤治疗。②患者过去5年未出现进展或需要治疗的其他恶性肿瘤。③术后病理诊断为CRC。

流式抗体抗人CD16/32、CD3-PE-Cy7、CD45-APC、CD19-BV650、CD56-BV650、CD19-BV605、CD158a-PE、TNF-α-APC、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）- BB700（BioLegend，美国），流式抗体抗人CD3-BUV805、CD56-PE-CF594、CD11c-BV510、CD11b-BV786、CD14-APC-Cy7、CD16-BUV737、CD38-BV421、人类白细胞抗原-DR（human leukocyte antigen-DR，HLA-DR）-PE-Cy5、CD69-BB790、T细胞免疫球蛋白与黏蛋白结构域3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，TIM-3）-BB750、CD27-BUV496、CD57-BV786、NKp46-PE-Cy7、CD94-PE-CF594、IFN-γ-BV711、死活细胞染料Fixable viability stain 570（BD Biosciences，美国），二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、eBioscience^TM细胞刺激试剂盒、eBioscience^TM固定破膜叉头框蛋白P3（forkhead box protein P3，FOXP3）/转录因子（transcription factor）染色缓冲液试剂盒（赛默飞，美国），乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸［4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazine ethanesulfonic acid，HEPES］、RPMI1640培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibco，美国），Ⅷ型胶原酶（type Ⅷ collagenase，Col Ⅷ）、脱氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonuclease Ⅰ，DNase Ⅰ）（Sigma Aldrich，美国），淋巴细胞分离液Lymphoprep（Serumwerk Bernburg，德国），20×磷酸盐缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）（上海生工生物工程股份有限公司）。1300-A2生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，美国），5810R高速离心机（Eppendorf，德国），HX-20TS智能恒温摇床（上海沪析实业有限公司），FACSymphony A3流式分析仪（BD Biosciences，美国）。

取人新鲜抗凝全血，按照1∶1比例加入1×PBS将血液进行稀释，以降低血液黏稠度，轻柔混匀后备用。向无菌15 mL离心管内加入适量的Lymphoprep溶液，将稀释后的血样按体积比（Lymphoprep∶稀释全血）1∶2的比例缓慢平铺到Lymphoprep液面上方，注意保持两液面界面分层清晰。随后室温800×g离心20 min，设置升速5，降速1。离心结束后，管内液面从上至下依次为稀释血浆层、外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）层、分离液层和红细胞层，先吸走血浆层，再小心吸取中间白膜层即PBMC层并转移至15 mL离心管中，向离心管中加入10 mL的1×PBS重悬细胞，随后室温500×g离心5 min，弃上清液，再重复用1×PBS清洗1~2次即可用于后续试验。1 mL人外周血约能提取1×10⁶个PBMC。

将新鲜的肿瘤组织和癌旁正常组织样本转移到含有8 mL预冷过的RPMI1640培养皿中，用剪刀和镊子去除其上的脂肪、血管和纤维组织。用镊子夹住组织，使用预冷的1×PBS冲洗2次，用湿纸巾轻轻地吸干组织，称取癌旁正常组织和肿瘤组织各1 g用于消化。用剪刀将癌旁组织切成大小约为0.3 cm³的小块，将癌旁组织放入含有20 mL癌旁组织洗液的50 mL离心管中，在恒温摇床中37 ℃，1×g洗涤60 min。用剪刀把肿瘤组织剪成两半，放入含有20 mL肿瘤组织洗液的50 mL离心管中，在恒温摇床中37 ℃，1×g洗涤15 min。洗涤完成后，对于肿瘤组织，使用涡旋仪涡旋振荡2 min。对于癌旁组织，用手用力摇晃离心管2 min，振荡摇晃后，500×g离心5 min去除上清液，再用30 mL的1×PBS冲洗至少2次，以洗去残留的DTT或EDTA。随后，分别将肿瘤组织/癌旁组织放入1.5 mL的EP管中，用剪刀剪成小块。再分别转移至含有20 mL消化液的50 mL管离心管中，放入恒温摇床中，37 ℃，1×g消化30 min。消化结束后用手剧烈摇晃离心管3~5 min，直到肿瘤组织和癌旁组织变成小块，然后用100 μm细胞过滤器滤掉残余组织，将细胞悬液收集到新的50 mL离心管中，室温下500×g离心5 min后弃去上清，加入12 mL RPMI1640完全培养基重悬细胞。为去除样本中的肿瘤细胞、红细胞和碎片等，向50 mL离心管中加入12 mL Lymphoprep，在其上层等比缓慢加入前面制备好的细胞悬液，室温下1 400×g离心25 min，升速1，降速1，离心结束后弃去上层悬液，吸取中间层的淋巴细胞，加入10 mL PBS缓冲液，室温下500×g离心5 min，去除上清，加入适量RPMI1640完全培养基重悬细胞备用。肿瘤组织洗液、癌旁组织洗液及消化液配置相关信息见表1。

取消化好的细胞先按体积比1∶100加入Fc端封闭剂（Anti-CD16/32），4 ℃孵育10 min。对于细胞表面染色，首先使用死活细胞染料Fixable viability stain 570室温孵育10 min来标记死细胞，细胞表面蛋白标志如CD45、CD3、CD56、CD11b、CD11c等的染色按体积比1∶200比例稀释抗体，4 ℃避光孵育30 min，然后加入1×PBS离心洗涤。对于细胞内部蛋白如IFN-γ、TNF-α及GM-CSF等的染色，先用Foxp3/转录因子染色缓冲液试剂盒将细胞4 ℃固定透化45 min，再按体积比1∶100比例稀释胞内抗体，4 ℃避光孵育1 h，1×PBS洗涤后用200 μL PBS重悬细胞等待上机检测。染色过程中离心程序均为400×g，5 min。流式细胞分析检测使用BD FACSymphonyA3流式分析仪，数据分析使用FlowJo™ v10.9.0软件。

本研究使用GraphPad Prism 8.0软件进行数据的统计学分析。定量资料用x±s表示，组间比较采用Student's t检验或Mann-Whitney U检验。定性资料以频数（百分比）表示。P<0.05表示差异具有统计学意义。

研究共纳入CRC患者病例25例，收集临床样本包括25例肿瘤组织及配对的癌旁组织、15例匹配的外周血样本（取自前述25例患者）。患者的临床和病理特征详见表2。

取CRC患者的新鲜肿瘤组织和配对的癌旁组织样本制备成单细胞悬液，运用流式细胞术检测肿瘤微环境中浸润的各类免疫细胞的比例。根据流式抗体组合标记将免疫细胞分为各类亚群（图1A）：T淋巴细胞（CD45⁺CD3⁺ ）、B淋巴细胞（CD45⁺CD3^-CD19⁺ ）、NK细胞（CD45⁺CD3^-CD19^-CD56⁺）、巨噬细胞（CD45⁺CD3^- CD19^-CD56^-CD11b⁺CD14⁺）、树突状细胞（CD45⁺ CD3^-CD19^-CD56^-CD11b^-CD14^-HLA-DR⁺CD11c⁺）、单核细胞（CD45⁺CD3^-CD19^-CD56^-CD11b^-CD14^-HLA-DR^-CD11c^-CD14⁺），其中巨噬细胞、树突状细胞和单核细胞统称为髓系细胞。使用FlowJo软件对肿瘤组织和癌旁组织中的免疫细胞进行t-SNE（t-distributed stochastic neighbor embedding）降维分析（图1B），可见肿瘤微环境中主要的免疫细胞亚群为T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、髓系细胞（myeloid cells）和其他细胞。对比肿瘤组织和癌旁组织中这5类细胞的比例（图1C），结果显示T淋巴细胞（P=0.000）和髓系细胞（P=0.026）在肿瘤组织中的比例明显高于癌旁组织，而NK细胞（P=0.007）在肿瘤组织中的比例明显低于癌旁组织。

通过流式细胞术发现肿瘤组织中NK细胞的比例（P=0.007）显著低于癌旁组织（图2A）。为进一步了解NK细胞的亚群及表型特征变化，对NK细胞的表面活化分子进行检测。对比患者外周血、肿瘤组织和癌旁组织中NK细胞上CD16的表达（图2B），发现在肿瘤组织和癌旁组织中NK细胞表面CD16分子的表达（P=0.000）显著低于外周血，而肿瘤组织中NK细胞的CD16分子表达（P=0.008）显著高于癌旁组织，说明肠道组织中的NK细胞表型与外周血差异较大。此外，通过检测细胞表面早期分化标志CD27、早期活化标志CD69、晚期活化标志HLA-DR、细胞耗竭标志TIM-3分子在肿瘤组织和癌旁组织中的表达情况（图2C），发现CD27（P=0.000）和CD69（P=0.001）在肿瘤组织中表达显著下调，HLA-DR（P=0.000）和TIM-3（P=0.024）表达显著上调。检测结果提示肿瘤组织中的NK细胞呈现晚期活化和耗竭表型。

通过检测CD38分子在NK细胞上的表达水平，将NK细胞根据CD38分子的表达高低分为CD38^highNK和CD38^lowNK 2个亚群。对比CD38^highNK细胞亚群在肿瘤组织和癌旁组织中的比例（图3A），结果可知，相比癌旁组织，肿瘤组织中的CD38^highNK细胞比例明显降低（P=0.003），而CD38^lowNK细胞无显著差异，同时CD38^highNK相比CD38^lowNK高表达早期分化标志CD27分子。为进一步探索CD38^highNK细胞亚群的表型和功能特征，分别检测细胞表面标志：活化性受体CD16、活化性受体NKp46、晚期分化标志CD57、细胞表面受体CD94、晚期活化标志HLA-DR、抑制性受体CD158a在NK细胞中的表达水平（图3B）。对比上述细胞表面标志物在CD38^highNK和CD38^lowNK这2个亚群中的表达水平，结果可知，肿瘤组织中CD38^highNK细胞亚群的CD16（P=0.000）、NKp46（P=0.000）、CD57（P=0.000）、CD94（P=0.000）、HLA-DR（P=0.000）、CD158a（P=0.000）表达都明显低于CD38^lowNK细胞亚群，说明该亚群活化程度极低（图3C）。综上结果，CRC肿瘤组织中减少的NK细胞主要是CD38^highNK细胞亚群，并且CD38^highNK细胞是一群处于早期分化和未活化状态的NK细胞。

为进一步探究肿瘤免疫微环境中NK细胞的功能变化，对NK细胞分泌的IFN-γ（图4A）、TNF-α（图4B）、GM-CSF（图4C）在肿瘤组织和癌旁组织中的表达水平进行了检测，对比可知，肿瘤组织中的IFN-γ（P=0.032）、TNF-α（P=0.042）、GM-CSF（P=0.019）表达均明显低于癌旁组织。综上结果说明肿瘤微环境中的NK细胞分泌细胞因子的能力减弱，提示NK细胞的功能受损。

肿瘤微环境是肿瘤细胞赖以生存的复杂环境，在肿瘤的发生和发展过程中起到关键作用^［21］。肿瘤微环境中存在各类免疫细胞组分，其组成结构和功能状态在不同疾病和患者体内不尽相同^［22］。本研究发现，在CRC患者的肿瘤组织中T细胞和巨噬细胞、树突状细胞等髓系细胞的比例相比癌旁组织明显上升，而NK细胞（CD45⁺CD3^-CD19^-CD56⁺）比例明显下降。说明CRC的肿瘤微环境中NK细胞浸润减少，提示其抗肿瘤杀伤作用在实体瘤中可能受限。

人类NK细胞可以根据CD56分子的表达分为CD56^bright和CD56^dim 2个亚群^［23］。近年来的研究^［24］发现，NK细胞在不同组织中可以分化发育为不同的亚群。肠道、肝脏、肾脏等不同组织部位驻留的NK细胞表型呈现出高度的异质性^［25］。本研究发现，CRC患者的癌旁组织和肿瘤组织中表达CD16分子的NK细胞比例均明显少于外周血，说明肠道组织中NK细胞的表型与外周循环NK细胞相比差异较大。CD16分子是NK细胞的经典活化性表面受体，参与抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）^［26］。研究同时发现，CRC肿瘤组织中CD16⁺NK细胞比例明显高于癌旁组织，猜测可能是肿瘤中浸润的NK细胞受到肿瘤微环境信号刺激，激活程度更高。

MEI等^［27］利用单细胞多组学手段揭示了CRC中免疫抑制性的肿瘤微环境。长期暴露于肿瘤微环境中的NK细胞受到抑制性环境信号的影响，会发生功能减退，呈现耗竭状态^［28］。本研究发现，晚期活化标志HLA-DR分子和细胞耗竭标志TIM-3分子在CRC患者肿瘤浸润NK细胞中的表达相比癌旁组织均明显升高。提示CRC肿瘤微环境中的NK细胞表型发生改变，呈现耗竭表型。

CD38是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，相对分子质量为45 000，同时具有胞外酶活性和细胞受体功能。在激活钙信号，调控免疫细胞的成熟、分化、激活和免疫耐受等过程中发挥关键作用^［29］。CD38分子被认为是T淋巴细胞的经典活化标志，但在NK细胞上的作用还不甚明确。本研究根据CD38分子的表达量将NK细胞分为CD38^highNK细胞和CD38^lowNK细胞2个亚群。统计学分析结果发现相比于癌旁组织，肿瘤组织中CD38^highNK细胞的比例显著减少，而CD38^lowNK细胞的比例无差异，说明肿瘤组织中减少的NK细胞主要为CD38^highNK细胞亚群。进一步分析CD38^highNK细胞亚群后发现，其细胞表面一系列表型和功能标志：活化性受体CD16、活化性受体NKp46、晚期分化标志CD57、细胞表面受体CD94、晚期活化标志HLA-DR、抑制性受体CD158a的表达均显著下调，而早期活化分子CD27表达显著上调，表明此群细胞正处于早期分化且未活化的状态。有体外实验^［30］发现，CD38分子参与了NK细胞与靶细胞之间免疫突触的形成。因此CRC中CD38^highNK细胞亚群的减少，可能导致了肿瘤浸润NK细胞杀伤能力的下降。

NK细胞作为人体免疫系统发挥抗肿瘤免疫监视的重要组分之一，不仅可以快速识别和杀伤肿瘤细胞，还可以通过分泌IFN-γ、TNF-α、GM-CSF等细胞因子和趋化因子，招募其他免疫细胞，并有效促进T细胞和B细胞发生二次免疫应答^［28］。本研究通过检测上述3个主要细胞因子的表达水平，发现CRC肿瘤浸润NK细胞分泌IFN-γ、TNF-α、GM-CSF的能力对比癌旁组织均显著降低。证明CRC患者的NK细胞在肿瘤微环境中存在功能受损。综上所述，CRC肿瘤微环境中NK细胞的一系列变化可能促进了肿瘤的发生发展。

通过整理25例CRC患者的临床病理分期信息，发现大部分患者都处在TNM分期^［31］的Ⅱ期和Ⅲ期：Ⅱ期（12例）、Ⅲ期（10例）。经过分析后发现不同病理分期患者的肿瘤组织和癌旁组织中NK细胞的表型和功能特征没有明显的差异，可能是由于大部分患者处在相近的疾病发展阶段。未来研究中将纳入更多Ⅰ期和Ⅳ期的患者样本，以期通过比较不同分期患者获得更多有关CRC发生发展的发现。

本研究发现CD38^highNK亚群在肿瘤组织中比例降低，但CD38分子除在多发性骨髓瘤等肿瘤细胞上高表达外，还在T细胞、B细胞、髓源抑制细胞等免疫细胞中存在高表达亚群，并发挥不同功能^［32］。还需要对CD38^high免疫细胞亚群进行更深入的研究，以阐明CD38在CRC实体瘤中的具体作用。

综上所述，本研究通过探索CRC患者肿瘤组织NK细胞的表型和功能特征，阐述肿瘤微环境中NK细胞呈现的功能受损和耗竭状态，揭示肿瘤细胞免疫逃逸的可能原因，以期为临床治疗和发展靶向NK细胞的免疫治疗提供新思路。