钙离子转运ATP酶B2（ATPase plasma membrane Ca²⁺ transporting 2，ATP2B2）属于p型初级离子转运ATP酶家族，由Atp2b2基因编码，特异性表达于某些组织如内耳^［1］、脑^［2］、乳腺^［3］、心脏等^［4-5］。在内耳中，Atp2b2高表达于耳蜗外毛细胞和前庭毛细胞纤毛^［1］，在耳蜗内毛细胞及螺旋神经元中也有表达。ATP2B2在外毛细胞纤毛上可将细胞内钙离子外排至纤毛附近的内淋巴中，从而调节细胞内及内淋巴中的钙离子水平^［6-7］；ATP2B2在前庭系统中还可能通过维持细胞外钙离子浓度参与耳石的形成^［8］，是维持听觉及平衡觉功能的重要蛋白。已在遗传性耳聋家系中证实ATP2B2基因存在多个突变位点，能以单倍剂量不足（haploinsufficiency）的方式引起常染色体显性遗传非综合征性耳聋82（autosomal dominant non-syndromic hearing loss 82，DFNA82）^［9］。携带杂合突变患者通常可通过出生时听力筛查，部分患者3~6岁开始出现进行性高频听力障碍，前庭功能轻度异常^［10］。小鼠Atp2b2基因位于6号染色体上，与人的ATP2B2基因同源，目前已经报道了数个小鼠Atp2b2基因突变模型，如Atp2b2 Oblivion、dfw^2J 、dfwⁱ⁵ 、dfw^［11-13］等。Atp2b2 Oblivion杂合突变小鼠出现了与人类表型类似的高频听力障碍，而纯合突变小鼠除听力障碍外还可出现明显平衡功能障碍如头部震颤、打转等异常行为^{［8，11，14-15］}，表明Atp2b2纯合突变可能损伤前庭功能。Atp2b2杂合突变小鼠无明显的平衡功能障碍，但尚无报道证实其前庭结构及功能是否受到影响^［9，13］。本研究通过测试2月龄、8月龄Atp2b2 Oblivion杂合突变小鼠前庭电生理及行为学表现，结合前庭毛细胞的形态、计数及超微结构分析，研究Atp2b2 Oblivion杂合突变小鼠前庭功能障碍及可能的机制。

SPF级2月龄及8月龄雄性Atp2b2 Oblivion杂合突变小鼠及对照野生型C57BL/6J小鼠均购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（苏）2023-0009。在Atp2b2基因16号外显子引入S877F点突变（ENSMUST00000089003.11），即第877个氨基酸由丝氨酸突变为苯丙氨酸，对应的核酸序列由TCC突变为TTC。通过对小鼠尾基因组PCR扩增及Sanger测序分析确认基因型。所有小鼠均饲养于上海交通大学医学院附属第九人民医院实验动物中心，SPF级饲养环境，每日光照时间8:00至20:00，环境噪声低于60 dB，食物及饮水供应充足，实验动物使用许可证号为SYXK（沪）2020-0025。

多聚甲醛（16005，美国Sigma），戊二醛（96049，美国Ted pella），0.5 mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（E1170，北京索莱宝科技有限公司），曲拉通X-100（T8787，美国Invitrogen），驴血清（BMS0140，美国Abbkine），ATP2B2抗体（PA1-915，美国Invitrogen），Alexa Fluor 488鬼笔环肽（A12379，美国Invitrogen），转录因子SOX-2（SRY-box transcription factor 2）抗体（AF2018，美国R&D公司），肌球蛋白7A（myosin 7A，MYO7A）抗体（25-6790，美国Proteus BioSciences），Alexa Fluor 594驴抗兔抗体（R37119，美国Invitrogen），Alexa Fluor 647驴抗山羊抗体（A21447，美国Invitrogen），封片剂（36308ES20，翌圣生物科技上海股份有限公司），盐酸赛拉嗪（X1251，美国Sigma）及舒泰50（WK001，法国维克）。

听觉诱发电位工作站（System 3 RZ6 workstation，美国TDT），加速度传感器（14140，上海北智电子技术有限公司），小鼠转棒式疲劳仪（XR-6C，上海欣软信息科技有限公司），体视镜（Stemi 305，德国Zeiss），共聚焦显微镜（DMi8，德国Leica），扫描电子显微镜（扫描电镜，Gemini300，德国Zeiss），透射电子显微镜（透射电镜，HT7800，日本Hitachi），切片机（CM3050S，德国Leica）。

选取2月龄及8月龄Atp2b2 Oblivion杂合突变小鼠（Obl/+组）及对应月龄C57BL/6J小鼠（Wt组）各10只。首先通过前庭诱发电位（vestibular evoked potential，VsEP）、前庭肌源性诱发电位（vestibular evoked myogenic potential，VEMP）、转棒实验、平衡木实验检测所有小鼠的前庭功能，然后每组每个月龄小鼠取3只用于免疫荧光实验观察小鼠椭圆囊纤毛结构（左侧耳）及毛细胞存活情况（右侧耳），3只用于扫描电镜观察椭圆囊纤毛结构（双侧耳），4只用于透射电镜观察椭圆囊毛细胞的超微结构（双侧耳）。

利用TDT听觉诱发电位工作站系统进行VsEP检测。小鼠以20 mg/kg盐酸赛拉嗪和50 mg/kg舒泰腹腔注射麻醉，然后置于37 ℃电加热垫上维持体温。将记录电极置于颅顶正中皮下，参考电极置于待测耳侧乳突下，接地电极置于另一侧大腿皮下。使用非侵入性头夹将小鼠头部固定在振动发生装置上，振动发生装置沿鼻枕轴的方向振动，从而刺激小鼠球囊和椭圆囊。采用持续时间为2.0 ms的矩形脉冲进行刺激，通过加速度传感器设定振动脉冲由51 dB（相当于2×g/ms）输出开始，逐次递减，每次3 dB，直至27 dB（相当于0.125×g/ms），记录并分析波形。

利用听觉诱发电位工作站系统进行VEMP检测。按“1.2.2”的方式麻醉、保温。使用定制的支架固定小鼠，在检测过程中，小鼠呈俯卧位，头部抬高，与水平线呈45°，保持小鼠颈部过度伸展状态。将记录电极置于待测耳侧胸锁乳突肌内，参考电极置于颅顶正中皮下，接地电极置于另一侧大腿皮下。给予小鼠2~20 kHz声音刺激，刺激速率为5次/s，从120 dB开始，逐次递减，每次5 dB，记录并分析波形。

转棒实验：转棒测试转速为8、25、35 r/min。正式测试前小鼠需连续训练3 d，每日每种转速训练3次。正式测试前小鼠至少休息30 min，初始转速为5 r/min，然后再调整至测试转速，记录小鼠掉落的时间，限时300 s。每只小鼠进行同一转速的重复测试之间间隔10 min，在进行另一转速测试前需至少间隔30 min。每只小鼠每种转速测试3次，计算平均值作为该转速下的停留时间。

平衡木实验：平衡木为一根长100 cm、宽1 cm的木条，将鼠笼放在木条下提供保护。正式测试前小鼠需连续训练3 d，要求小鼠可自行单向通过平衡木且没有明显停顿或折返，小鼠通过平衡木后提供水果果冻作为奖励；如果小鼠在平衡木上排泄，需清理排泄物并用乙醇擦拭去除气味。记录小鼠在平衡木上移动80 cm的时间，每只小鼠测试3次，计算平均值作为小鼠的通过时间。

小鼠按“1.2.2”的方式麻醉后，颈椎脱臼处死。断头，取出耳蜗，体视镜下快速取出椭圆囊，于4%多聚甲醛中室温固定40 min，继续于0.5 mol/L EDTA中室温脱钙15~18 min，随小鼠月龄增长适当延长脱钙时间。将椭圆囊在室温下用含8%驴血清和0.1%曲拉通X-100的PBS（10 mmol/L，pH 7.4）封闭1 h，以此封闭液稀释一抗和二抗。一抗4 ℃孵育过夜，一抗包括ATP2B2抗体（1∶300）、MYO7A抗体（1∶300）、SOX2抗体（1∶300），ATP2B2抗体用于标记野生型及突变ATP2B2蛋白，MYO7A抗体用于标记前庭毛细胞，SOX2抗体用于标记前庭Ⅱ型毛细胞及支持细胞的细胞核。次日用含有0.1%曲拉通X-100的PBS清洗3次，二抗及Alexa Fluor 488鬼笔环肽（1∶100）室温孵育1 h，二抗包括Alexa Fluor 594驴抗兔抗体（1∶300）、Alexa Fluor 647驴抗山羊抗体（1∶300），鬼笔环肽用于标记前庭毛细胞细胞骨架。封片后在共聚焦显微镜下观察。

按“1.2.5”的方式取出小鼠椭圆囊，用2.5%戊二醛室温固定30 min后，用蛋白酶在37 ℃下消化前庭组织耳石膜3~5 min，随小鼠月龄增长适当延长消化时间；分离耳石膜以暴露下方纤毛，随后用1%四氧化锇于室温下固定1 h，洗涤后用1%硫代卡巴肼于室温下避光反应30 min，洗涤后再次用1%四氧化锇于室温下固定1 h，洗涤后进行梯度乙醇脱水，临界点干燥，喷金，扫描电镜观察。

按“1.2.5”的方式取出小鼠椭圆囊，2.5%戊二醛4 ℃固定过夜，后用1%四氧化锇于室温下固定2 h，随后用0.1 mol/L PB缓冲液洗涤，乙酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，洗涤后依次在乙醇和丙酮中进行梯度脱水，在环氧树脂中包埋、聚合，之后将椭圆囊切片、染色，透射电镜观察。

使用GraphPad Prism 10.0软件进行数据统计分析，定量资料用x±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

通过免疫荧光实验观察2月龄和8月龄Wt组及Obl/+组小鼠椭圆囊纤毛结构以及ATP2B2表达情况，发现2月龄及8月龄Obl/+组小鼠纤毛结构正常，ATP2B2表达于前庭毛细胞纤毛，与Wt组无明显差别（图1A）。

观察2月龄及8月龄的2组小鼠椭圆囊毛细胞（图1B），对椭圆囊微纹区（striola zone，S zone）及纹外区（extra-striola zone，ES zone）毛细胞分别计数，结果显示2月龄和8月龄Obl/+组小鼠椭圆囊微纹区及纹外区毛细胞数量与Wt组差异无统计学意义（图1C）。

扫描电镜观察2月龄及8月龄Wt组及Obl/+组小鼠椭圆囊毛细胞纤毛形态。2月龄和8月龄时2组小鼠椭圆囊毛细胞纤毛形态正常，均由一根较长动纤毛及数排静纤毛组成，有正确的纤毛朝向，未观察到明显异常（图2）。

透射电镜观察2月龄及8月龄Wt组及Obl/+组小鼠椭圆囊毛细胞（以Ⅰ型毛细胞为代表）表皮板附近线粒体和神经连接部位线粒体，以及带状突触结构（图3）。结果显示：2月龄Obl/+组小鼠线粒体和突触均无明显异常，在毛细胞底部还观察到数个带状突触形成的“聚合体”；而8月龄Obl/+组小鼠前庭毛细胞表皮板附近部分线粒体出现空泡样变性，毛细胞底部线粒体及带状突触结构仍无明显异常。

2月龄时，Obl/+组小鼠VsEP阈值较Wt组小鼠显著上升，P1潜伏期延长，P1N1波幅降低，VEMP阈值显著上升，差异均有统计学意义（图4A~F，均P<0.05）。转棒及平衡木实验结果显示，Obl/+组2月龄小鼠与Wt组小鼠平衡功能无明显差异（图4G、H）。

8月龄时，Obl/+组小鼠VsEP阈值较Wt组小鼠显著上升，P1潜伏期延长，P1N1波幅降低，VEMP阈值显著上升，差异均有统计学意义（图5A~F，均P<0.05）。转棒及平衡木实验结果显示，Obl/+组8月龄小鼠平衡功能较Wt组显著变差（图5G、H），差异均有统计学意义（均P<0.05）。

在内耳中，ATP2B2高表达于耳蜗外毛细胞以及前庭毛细胞的纤毛部位^［1］。作为真核细胞重要的钙离子通道^［16］，ATP2B2对钙离子有较高亲和性^［17］，因而对维持细胞内局部区域较低水平的钙离子有重要作用^［6-7］。除此之外，ATP2B2还可影响纤毛附近内淋巴的钙离子浓度，进而影响耳石器表面所覆盖的耳石膜的维持^［8］，是维持听觉及平衡觉功能的重要蛋白。

遗传性耳聋家系研究证实ATP2B2基因存在多个突变位点，可导致常染色体显性遗传非综合征性耳聋^［9］，仅少数患者伴有前庭功能轻度异常^［10］。小鼠Atp2b2基因位于6号染色体上，目前也有数个小鼠Atp2b2基因突变报道，杂合突变小鼠表现出与人类表型类似的高频听力障碍，但未表现出明显的因前庭障碍导致的行为异常^{［11-15，18］}。与之不同的是，在Atp2b2敲除及纯合突变小鼠可观察到明显的前庭相关的行为异常，如头部震颤、打转等^{［4，8-9］}，提示ATP2B2在维持正常的前庭功能中起到一定的作用。但在既往研究^［8］中，并未观察到Atp2b2敲除小鼠前庭系统椭圆囊及球囊位觉斑的异常，仅观察到敲除小鼠部分耳石缺失；然而由于内耳样品制作过程中有脱钙处理，可能出现假阳性的结果。在Atp2b2敲除小鼠的小脑中观察到浦肯野细胞数量增加、颗粒细胞数量减少、分子层变薄，然而这些变化不足以解释其严重的平衡缺陷^［8］，因此ATP2B2在前庭系统中的作用机制仍有待探索。

本研究涉及的Atp2b2 Oblivion突变是经乙酰基亚硝基脲诱导形成的突变体，该突变为错义突变，突变蛋白可正常表达^［19］。纯合突变表现为听力和前庭功能障碍；杂合突变小鼠1月龄即出现底圈外毛细胞的丢失和高频听力下降并进行性加重，至3月龄仍未出现明显前庭相关的行为异常^［15］。此前关于Atp2b2突变小鼠前庭功能的研究主要在行为学层面，结果显示出生后5周Atp2b2dfwⁱ⁵ 杂合突变小鼠转棒测试结果以及出生后6周杂合突变小鼠游泳测试结果均与野生型小鼠无显著差异^［13］。然而前庭有代偿机制，简单的行为学功能检测无法早期发现和定量外周前庭功能改变。通过对Atp2b2 Oblivion杂合突变小鼠前庭功能检测，我们发现虽然2月龄Atp2b2 Oblivion杂合突变小鼠在行为学测试中与野生型小鼠无显著差异，但是前庭电生理指标异常；前庭功能异常在8月龄时明显加重，表明Atp2b2 Oblivion杂合突变导致前庭功能渐进性下降，提示Atp2b2单倍体剂量不足现象在前庭系统亦存在。

Atp2b2 Oblivion杂合突变小鼠前庭毛细胞ATP2B2表达未见明显改变，2月龄及8月龄杂合突变小鼠椭圆囊微纹区及纹外区毛细胞数量较野生型小鼠无显著差异。扫描电镜也未发现前庭毛细胞纤毛结构异常。结合此前研究结果，Atp2b2 Oblivion杂合突变小鼠耳蜗毛细胞纤毛形态观察显示残余的外毛细胞纤毛大多有正常的“W”形态，尤其是顶圈部位的纤毛，仅少量退化的毛细胞纤毛出现融合^［15］。这表明Atp2b2 Oblivion杂合突变基本不影响毛细胞的发育及纤毛的结构。

ATP2B2是毛细胞钙外排重要通道，感觉毛细胞钙稳态对机械感觉适应、突触传递和传出调制尤其重要^［20］。为探究Atp2b2 Oblivion杂合突变导致前庭功能障碍机制，我们利用透射电镜观察前庭毛细胞的超微结构。钙离子通过机械传导通道进入纤毛后，迅速与内源性钙离子螯合剂结合^［21］，可将钙离子限制在纤毛附近^［22］。此外，集中在表皮板下方的线粒体也可储存大容量的钙离子^［23］，钙离子还可快速被纤毛处ATP2B2输出至内淋巴^［6］，从而维持细胞内钙稳态。因此ATP2B2的功能异常可能会对毛细胞顶部乃至整个毛细胞的钙离子浓度产生影响，并通过多种途径引起功能障碍和细胞死亡。我们对毛细胞表皮板附近的线粒体进行观察，2月龄杂合小鼠线粒体结构无明显异常，8月龄杂合小鼠部分线粒体出现空泡样变性，而对照组小鼠并没有出现此异常，提示可能是表皮板附近区域钙离子浓度过高导致的线粒体损伤^［24］。此外我们也观察了毛细胞神经连接部位的结构，此处钙离子浓度及线粒体功能可对毛细胞带状突触产生影响^［25］，由于钙超载引起的线粒体损伤可导致突触病变^［26］。通过透射电镜观察2月龄及8月龄Atp2b2 Oblivion杂合突变小鼠前庭毛细胞底部带状突触及线粒体结构，均未发现明显异常。提示Atp2b2杂合突变通过影响纤毛附近区域钙稳态导致前庭功能障碍。

本研究对前庭终末器官椭圆囊开展了较为细致的形态学观察，发现Atp2b2 Oblivion杂合突变小鼠随年龄增长出现线粒体轻微结构改变；通过电生理及行为学检测证实Atp2b2 Oblivion杂合突变小鼠2月龄即出现显著前庭电生理改变，随时间进行性加剧，至8月龄时由于前庭中枢对外周功能障碍的失代偿或伴有前庭中枢自身的迟发病变^［27］而出现行为学改变。由于本研究仍处于初步探索阶段，仅凭借形态学观察无法对前庭功能障碍机制做出明确阐述，仍需深入研究，并进一步探索前庭毛细胞退行性改变的机制，为前庭功能障碍的防治提供思路。