组蛋白翻译后修饰（post-translational modification，PTM）是真核生物表观遗传调控的主要方式。PTM通过对染色质中核小体的核心组蛋白进行甲基化、乙酰化和泛素化等多种共价修饰，动态地调节染色质结构来影响相关基因的表达^［1］。多梳抑制复合物1（polycomb repressive complex 1，PRC1）是一类具有催化组蛋白H2A第119位赖氨酸残基泛素化修饰（H2AK119ub）活性的表观遗传调控复合物^［2］，通过促进染色质凝缩发挥转录抑制功能^［3］。

PRC1.6复合物作为PRC1复合物的亚型之一，组成成分复杂，主要包含核心催化亚基RNF2（ring finger protein 2），以及辅助亚基PCGF6（polycomb group ring finger 6）、RYBP（RING1 and YY1 binding protein）、L3MBTL2（lethal 3 malignant brain tumor like protein 2）、CBX3（chromobox protein homolog 3）、E2F6（E2F transcription factor 6）和DP1（transcription factor Dp-1）等。由于包含转录因子亚基E2F6和DP1，PRC1.6复合物与DNA的结合具有较强的序列特异性，可以识别基因组中的特定位点进而发挥转录抑制功能^［4］。PCGF6亚基作为该复合物的特有成分，在干细胞干性维持^［5-6］和胚胎生长发育^［7］等生物学进程中发挥重要作用。同时，作为转录调节因子，PCGF6的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关。已有研究^［8］表明，PCGF6在乳头状肾细胞癌组织中显著高表达，且与患者的不良预后相关。PRC1.6复合物在雄性性腺发育和精子发生中也发挥重要的生物学功能，已有的动物实验研究表明，包括E2F6^［9］、CBX3^［10］和L3MBTL2^［11］在内的多个亚基与小鼠睾丸正常发育关系密切。由于PRC1.6复合物构成复杂，目前对于PRC1.6复合物发挥功能的具体机制仍然知之有限。

近年来，关于PRC1.6复合物中各亚基之间的相互作用已有部分研究，相关结构也有陆续报道。PRC1.6复合物的PCGF6与RNF2可通过各自的RING结构域形成异二聚体，其中PCGF6可增强RNF2的泛素连接酶活性，促进H2A第119位赖氨酸残基泛素化^［2］。目前已报道了RNF2和PCGF4（PCGF6同源蛋白）异二聚体结合并修饰核小体的冷冻电镜结构^［12］。RYBP亚基的N端含有一段锌指结构域，可以识别并结合组蛋白H2A第119位赖氨酸的泛素化修饰，而位于其C端的RAWUL结构域则可以与RNF2相互作用^［13-14］。L3MBTL2属于恶性脑肿瘤（malignant brain tumor，MBT）蛋白家族，关于L3MBTL2的晶体结构研究^［15］显示，其包含的4个重复MBT结构域呈不对称菱形结构，其中第4个MBT结构域可与甲基化多肽结合。CBX3亚基的chromodomain（CD）和chromoshadow domain（CSD）目前均有相关晶体结构的报道^［16-17］，结构研究^［18］显示：CBX3亚基N端CD结构域识别并结合组蛋白H3第9位赖氨酸的三甲基化修饰（H3K9me3），并与L3MBTL2亚基相互作用；C端的CSD结构域则与PXXVXL（X表示任意氨基酸）基序结合。转录因子E2F6可与DP1结合形成异二聚体后共同装配至DNA的E2F识别基序上^［19］。此外，不同于E2F家族的其他成员，E2F6不仅可以和DP1结合，同时可以与PRC1.6复合物组分的RNF2和RYBP 2个亚基相互作用^［20］。由于E2F6暂无任何结构报道，参考E2F4与DP1相互作用的晶体结构^［21］分析发现，两者主要通过各自的marked-box domain结合并形成异二聚体。

由于PRC1.6复合物的组分众多，其相关的结构生物学研究进展较为缓慢。目前已有研究仅包含1~2个亚基，无法阐明PRC1.6复合物整体的结构特征及其发挥生物学功能的分子机制。因此，解析人源PRC1.6复合物的结构，对于阐明其各亚基间相互作用关系以及在染色体修饰过程中的结构生物学分子机制十分关键，可为此后针对各类肿瘤靶点的药物研发奠定良好基础。

PrimeScript Ⅱ（cDNA合成试剂盒）购于日本TaKaRa公司，DNA聚合酶试剂盒购于北京全式金生物技术股份有限公司，一步克隆试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司，去内毒素质粒提取试剂盒购于江苏康为世纪生物科技有限公司，聚乙烯亚胺（PEI）购于美国Polysciences公司，哺乳动物细胞悬浮培养基购于永联生物科技（上海）有限公司，抗DYKDDDDK标签G1亲和树脂购于南京金斯瑞生物科技有限公司，3×Flag标签肽购于上海万生昊天生物技术有限公司，三羟甲基氨基甲烷（Tris）和十二烷基硫酸钠（SDS）均购于生工生物工程（上海）股份有限公司，蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）购于台湾生工有限公司，苄脒盐酸盐（benzamidine hydrochloride）购于美国ChemCruz公司，二硫苏糖醇（DTT）购于上海昂一生物科技有限公司，蛋白酶抑制剂盐酸亮抑酶肽（leupeptin hydrochloride）、胃蛋白酶抑制剂（pepstatin）和Bradford法蛋白质定量检测试剂盒均购于美国Sigma公司，氯化钠（NaCl）和丙三醇（甘油）均购于国药集团上海有限公司，分子筛Superdex 200 Increase 10/300 GL购于美国Cytiva公司，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜购于德国Merck Millipore公司，3%乙酸双氧铀（UA）购于河南锐欣实验用品有限公司，兔源H2AK119ub抗体和兔源H3抗体均购于美国Cell Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔抗体购于武汉爱博泰克生物科技有限公司。高分辨率轨道阱质谱仪（型号：Q-Exactive HF）购于美国Thermo Fisher Scientific公司，碳膜铜网购于北京中镜科仪技术有限公司，Talos L120C透射电子显微镜（电镜）购于美国FEI公司。

哺乳动物细胞表达载体pMLink、大肠埃希菌DH5α菌种、人胚肾Expi293F细胞、人胚肾HEK293T细胞、HRV-3C蛋白酶、泛素激活酶E1（UBA1）、泛素结合酶E2（UbcH5c）、泛素（ubiquitin）蛋白和核小体核心颗粒（nucleosome core particle，NCP）均由本实验室保存。

鉴于PRC1.6复合物的RNF2和PCGF6亚基发挥泛素化活性，RYBP亚基结合泛素修饰的组蛋白，L3MBTL2和CBX3亚基与甲基化组蛋白相结合，E2F6和DP1亚基结合特定序列DNA（图1A），我们将这7个亚基作为PRC1.6复合物的主要组成成分进行研究。首先，通过提取HEK293T细胞的RNA并进行反转录，建立该细胞的cDNA文库。设计引物（表1）并通过PCR方式从文库中扩增得到人源RNF2、PCGF6、RYBP、L3MBTL2、CBX3、E2F6和TFDP1（DP1的基因名）全长的基因片段（图1B），所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用一步克隆试剂盒，通过同源重组的方式将7个目的片段分别连接至N端带有6×His-3×Flag纯化标签的pMLink载体中，获得相对应的重组蛋白表达质粒，并进行DNA序列测定［由生工生物工程（上海）股份有限公司完成］。使用去内毒素质粒提取试剂盒进行质粒提取。

在2份25 mL哺乳动物细胞悬浮培养基中分别加入7种重组质粒（共0.8 mg）和3倍于总质粒量（2.4 mg）的PEI，均轻柔颠倒混匀后于室温静置15 min；随后将含有PEI的培养基缓慢加入含有质粒的培养基中并充分混匀，继续室温静置30 min；最后将50 mL转染混合液加入500 mL的Expi293F悬浮细胞中，此时细胞密度保持在2×10⁶个/mL~2.5×10⁶个/mL（指数生长期）。转染后的细胞继续培养50~52 h；离心收集细胞沉淀用于后续蛋白纯化。

使用裂解缓冲液［50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、150 mmol/L NaCl、10%甘油、1 μg/mL pepstatin、1 μg/mL盐酸亮抑酶肽、5 mmol/L胃蛋白酶抑制剂、1 mmol/L PMSF、1 mmol/L DTT］将收集的细胞进行充分重悬，随后使用高压均质机破碎细胞。将破碎后的细胞悬液在4 ℃条件下46 000×g离心1 h，将上清液和抗DYKDDDDK标签G1亲和树脂混合，置于旋转混合仪上4 ℃低转速旋转5 h。之后，将混合液在4 ℃条件下135×g离心10 min，去除上清液后将树脂转移至层析柱中。使用裂解缓冲液缓慢流经树脂，同时利用蛋白定量试剂盒检测流穿液的蛋白含量，当检测不到杂蛋白流出后，加入洗脱缓冲液［50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、150 mmol/L NaCl、10%甘油、1 mmol/L DTT、500 μg/mL 3×Flag标签肽］洗脱目的蛋白并收集，在蛋白溶液中加入HRV-3C蛋白酶冰上静置8~10 h。为了去除6×His-3×Flag标签和HRV-3C酶，将去除标签后的蛋白样品使用超滤浓缩管浓缩至约800 μL，取出蛋白样品后于4 ℃条件下16 000×g离心10 min，取上清液后利用分子筛Superdex 200 Increase 10/300 GL和快速蛋白液相色谱（FPLC）缓冲液［25 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、150 mmol/L NaCl］进一步分离纯化蛋白质。对出峰位置进行取样并采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）进行蛋白质组分的鉴定。收集目的蛋白组分后浓缩至约200 μL，通过10%~30%质量百分比的甘油密度梯度离心，在4 ℃条件下184 500×g超速离心15 h，离心完成后从上至下按照每份175 μL分样，使用SDS-PAGE鉴定复合物组分。

通过液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）鉴定纯化后蛋白样品中的组分信息。将蛋白进行还原烷基化后加入胰蛋白酶酶解；酶解肽段经C18色谱柱除盐后进行LC-MS/MS分析；质谱原始数据提交到Proteome Discoverer 3.0软件中，并使用UniProt数据库中的人源蛋白质组数据库进行检索。

将纯化得到的PRC1.6七元复合物分别进行泛素化活性实验和电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）。泛素化活性实验的反应体系包括0.03 μmol/L UBA1、0.9 μmol/L UbcH5c、0.9 μmol/L泛素连接酶E3（PRC1.6七元复合物）、10 μmol/L泛素、1 μmol/L NCP、3 mmol/L ATP和泛素化缓冲液［50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、75 mmol/L NaCl、1 mmol/L DTT、10 μmol/L ZnCl₂、2 mmol/L MgCl₂］。该反应体系在30 ℃孵育1 h，使用SDS-PAGE和Western blotting检测反应产物。首先，将PVDF膜（0.2 μm）放入甲醇中激活，使用快速湿转转膜仪将SDS-PAGE后凝胶上的蛋白转移至已激活的PVDF膜上，随后加入封闭液在室温孵育1 h；弃去封闭液，分别加入H2AK119ub抗体和H3抗体在4 ℃下孵育12~14 h；使用TBST清洗后加入HRP标记山羊抗兔抗体，室温孵育1 h；经TBST清洗后使用高灵敏化学发光反应液进行显色，通过成像仪记录显色结果。EMSA实验体系包括PRC1.6七元复合物和NCP。分别按照复合物与NCP的摩尔比例1∶1、4∶1、8∶1、16∶1、32∶1加入缓冲液［25 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、150 mmol/L NaCl］，其中NCP的浓度保持在0.3 μmol/L。冰上孵育1 h后取样，使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）和SDS-PAGE进行组分的鉴定与分离。

首先，在辉光放电仪中将碳膜铜网正面朝上放置，按照电流15 mA、时间25 s的设置进行亲水化处理。用镊子夹取铜网使其正面朝上，取5 μL浓度约为0.05 mg/mL的蛋白样品滴加在铜网上，孵育1 min，确保蛋白样品与铜网充分接触。随后，使用带有毛边的滤纸靠在载网边缘并停留10 s，以吸去多余蛋白溶液。为了防止载网中残留过多的蛋白溶液，向载网中滴加5 μL 1.5%乙酸双氧铀溶液，并立即使用滤纸吸去溶液；再次向铜网中央滴加5 μL 1.5%乙酸双氧铀溶液，静置孵育1 min，同样用滤纸靠在载网边缘停留10 s，吸去多余的溶液。最后，将碳膜铜网正面朝上，使用红外灯烘烤5 min，直至水分全部蒸干。将制备的样品在120 kV透射电镜下观察，放大倍数为57 000倍，设置欠焦值为-1.0~-2.0 μm，并选择样品颗粒分散且均一的区域进行照片收集。利用数据处理软件RELION 4.0^［22］对收集的图像进行处理，并生成相应的三维电子密度图。

通过蛋白质结构数据库（Protein Data Bank，PDB）检索获得PRC1.6七元复合物亚基RNF2（PDB ID：4R8P）、PCGF6（PDB ID：2DJB）、RYBP（PDB ID：3IXS）、L3MBTL2（PDB ID：3CEY）、CBX3（PDB ID：3TZD、5T1I）和DP1（PBD ID：5TUU）已发表的高分辨率结构，以及获得E2F6的AlphaFold2预测结构（AF-O75461-F1），利用USFC Chimra软件将以上结构与本研究重构获得的PRC1.6七元复合物三维模型进行拟合，最终确定7个亚基在PRC1.6复合物中的大致分布情况。

将N端均带有6×His-3×Flag标签的7种人源蛋白重组质粒，RNF2、PCGF6、RYBP、L3MBTL2、CBX3、E2F6和DP1通过PEI共同瞬时转染至Expi293F细胞中表达。在进行抗DYKDDDDK标签G1亲和树脂亲和层析后，使用SDS-PAGE鉴定洗脱液组分，结果表明，7个蛋白组分被共纯化，并通过相对分子质量（M_r）比对后确认PRC1.6复合物的7个蛋白组分完整（图2A）。为了进一步去除杂蛋白，以及分离目标M_r范围内的目的蛋白，对蛋白样品进行浓缩，并使用分子筛进行凝胶过滤层析（图2B），对出峰位置的流出组分进行取样并使用SDS-PAGE电泳分离鉴定（图2C）。结果显示7个目的蛋白能够较好地与部分杂蛋白分开，且理论M_r约为278 000的七元复合物出峰位置在11.5~12.7 mL处，该位置对应的M_r为158 000~440 000，与预期相符，收集该处的蛋白溶液用于后续实验。其中，PCGF6样品条带为2条，这与文献^［23］报道一致。此外，2种非特异性杂蛋白TRIM28（tripartite motif containing 28）和热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70），以及HRV-3C酶无法通过分子筛与目的蛋白分离。因此，为了进一步提高蛋白复合物的纯度和均一性，将样品通过甘油密度梯度离心进一步分离纯化。按照175 μL/管的方式，将密度梯度离心后的样品从上至下分离，并使用SDS-PAGE电泳鉴定蛋白溶液组分，选取7个蛋白组分含量比例较为一致、纯度较高的样品（泳道9）进行后续电镜观察（图2D）。

将经过标签亲和层析和凝胶过滤层析纯化后得到的PRC1.6七元复合物使用LC-MS/MS鉴定，鉴定结果显示纯化得到的复合物中含有RNF2、PCGF6、RYBP、L3MBTL2、CBX3、E2F6和DP1共7个组分（表2）。7个蛋白的二级肽段谱图数（PSM）值均较高且差异不大，说明经质谱检测的蛋白样品中7个组分可信度高，且相对含量较为均一。同时，unique peptide结果表明检测到的蛋白质肽段特异性较好。上述结果说明纯化得到的产物为完整的PRC1.6七元复合物。

经过凝胶过滤层析并获得足量的PRC1.6复合物蛋白样品后，通过泛素化活性实验和EMSA分别验证纯化得到的复合物在体外的泛素化活性和NCP结合亲和力。在按照泛素化反应体系进行实验后，使用SDS-PAGE和Western blotting验证组蛋白H2A第119位赖氨酸泛素化修饰的产量。结果显示，PRC1.6复合物能够较为有效地在体外将底物NCP的H2AK119位点修饰上不同数量的泛素（图3A）。在EMSA实验中，PRC1.6复合物与NCP按照不同比例孵育，随着PRC1.6复合物蛋白量的增加，NCP结合蛋白的量增多，条带逐渐向上迁移，证明PRC1.6复合物在体外能够与NCP很好地结合（图3B）。综上，本实验中纯化的PRC1.6七元复合物在体外具有较好的泛素化活性和核小体结合亲和力，表明该蛋白复合物能够较好地保持其在细胞内的原始生理状态。

经过甘油密度梯度离心后获得了纯度较高、均一性良好的PRC1.6七元复合物蛋白样品，将蛋白样品稀释到合适浓度并使用乙酸双氧铀制备负染样品，将负染样品干燥处理后置于120 kV透射电镜的真空环境中观察。电镜下的样品衬度合适，蛋白颗粒分散度良好，大小较为均一，多数颗粒长度为14~18 nm，与预期大小一致（图4A）。放大57 000倍后，对上述状态的样品收集115张电镜照片。使用RELION 4.0软件自动挑选颗粒，并对挑出的颗粒进行筛选，去除背景噪音后选用22 156个颗粒进行二维分类（2D classification），结果显示二维分类中的蛋白复合物形态多样，包含了复合物在多个角度下的信息（图4B）。在进行三维分类（3D classification），以及3D auto-refine和Post-processing等优化处理后，筛选出的颗粒角度分布均匀（图4C），蛋白颗粒的三维重构效果良好，最终得到分辨率为15.2 Å（1 Å=10^－10 m）的人源PRC1.6七元复合物的电子密度图（图4D）。

根据获得的三维结构可知整个PRC1.6七元复合物大小约为160 Å×100 Å×100 Å（图5A）。利用UCSF Chimera软件^［24］将PDB中已有的PRC1.6组分相关高分辨率结构（4R8P^［12］、3IXS^［14］、2DJB、3CEY^［15］、3TZD^［16］、5T1I^［17］）与已获得的电子密度图进行拟合与匹配。对于E2F6，使用AlphaFold2预测结构（AF-O75461-F1）进行拟合，依据此前已发表的关于E2F4与DP1相互作用的晶体结构（5TUU^［21］），我们将E2F6的预测结构按照E2F4的空间位置和DP1放置在一起，使得两者的marked-box domain靠近，此时，E2F6的DNA结合结构域位于复合物外侧。最终大致确定了RNF2、PCGF6、RYBP、L3MBTL2、CBX3、E2F6和DP1 7个亚基在PRC1.6复合物负染结构中的定位（图5B）。位置分布显示，RNF2位于整个复合体顶部，可以更好地结合NCP并发挥泛素化活性。L3MBTL2与CBX3则位于复合物另一侧，用来结合相应位点的甲基化组蛋白。

非经典型PRC1亚型众多。其中，由于PRC1.6复合物的组成成分较为复杂，以往研究中的PRC1.6组分略有不同，但其核心组分保持一致，主要包含泛素催化活性亚基、多种转录因子亚基以及多个甲基化多肽结合活性亚基等。这些亚基共同装配形成PRC1.6复合物，后者对核小体进行泛素化修饰，并重塑染色质结构，最终在细胞分化、胚胎发育和精子发生等一系列生理过程中发挥关键作用^［25］。近年来，主要围绕PRC1.6复合物的组成部分以及生物学功能开展了一系列研究，但有关的结构生物学研究仍然十分缺乏。因此，解析PRC1.6的结构信息对于确定复合物中各亚基的相互作用关系，并揭示其在染色质修饰和功能调控中的分子机制都具有十分重要的意义。

在本研究中，我们通过蛋白过表达和标签亲和纯化的方式获得了人源PRC1.6七元复合物。凝胶过滤层析结果表明PRC1.6七元复合物的组分较为均一，蛋白整体状态良好，同时在体外仍然具有高效的泛素化活性和核小体结合亲和力。经过密度梯度离心后，获得了更为均一、完整的复合物；随后借助负染及透射电镜，和单颗粒重构技术，对PRC1.6七元复合物进行结构解析，最终获得了PRC1.6七元复合物的三维电子密度图。从整体轮廓上看，PRC1.6复合物大小与预期较为一致。已有RNF2、PCGF6、RYBP、L3MBTL2、CBX3和DP1亚基的部分结构与E2F6的预测结构均能较好地匹配到重构获得的电子密度图中，其中多余的电子密度则可能是PCGF6、RYBP和DP1等尚未解析的结构模型所在区域。

鉴于在负染样品制备中使用的重金属乙酸双氧铀可能会遮蔽蛋白复合物的部分结构信息，并且在样品的制备和观察过程中，复合物处于脱水状态从而可能影响其生理构象，因此为了得到更为完整且接近生理构象的PRC1.6复合物，未来可以加入MAX（MYC associated factor X）、MAG（MAX gene-associated protein）和WDR5（WD repeat-containing protein 5）等PRC1.6复合物的其他亚基，以获得更加稳定和完整的复合物蛋白样品，通过冷冻电镜的单颗粒重构技术解析获得PRC1.6复合物的高分辨率电镜结构。此外，实验结果显示PRC1.6复合物与核小体具有一定的结合亲和力，因此在后续研究中可以引入核小体，通过解析PRC1.6复合物-核小体的高分辨率电镜结构，进一步获得PRC1.6复合物结合并修饰核小体的详细结构信息。这些都有助于阐明PRC1.6复合物发挥泛素化活性从而调控染色质结构的分子机制，为揭示PRC1.6复合物在胚胎发育和生殖调节等生物学功能中的分子机制奠定基础。