耳蜗是声音信息编码的第一站，将声波的机械信号转化为电信号由螺旋神经元（spiral ganglion neuron，SGN）传入耳蜗核，并通过多个中继神经核团将信息传递到听皮层^［1-2］。基因组学研究表明，SGN存在多种亚型^［3-4］，但不同亚型的SGN发出的听神经纤维是否具有不同的路径、支配不同类型的耳蜗核神经元并编码不同的声音信号仍不清楚。除了听神经纤维，耳蜗内还有来自上橄榄核复合体的内、外侧耳蜗通路（medial olivocochlear efferents，MOC；lateral olivocochlear efferents，LOC）^［5］。MOC主要终止于外毛细胞，与耳蜗增益控制、声创伤保护和注意力有关；也有研究^［6］证实其与Ⅱ型SGN树突端形成突触，但其功能尚未明确。LOC主要终止于Ⅰ型SGN树突端；与MOC不同，LOC的记录、刺激或消融都极为困难，其生理功能及编码机制的研究罕有进展。已有基因组学研究^［5］探索了MOC和LOC的亚型区分及功能差异，但对其神经投射异质性的研究仍较为有限。

耳蜗的生理结构或神经功能异常会导致听力损失。近年来中重度听力损失的发病率逐年增加^［7-8］。虽然人工耳蜗植入为众多耳聋患者重建了听力^［9］，但仍有部分患者无法受益，且人工耳蜗植入本身会对耳蜗造成损伤^［10］，需要对疾病治疗前后耳蜗在三维空间的病理改变进行观察。上述问题亟需高分辨率三维成像技术，以呈现听神经和MOC、LOC等神经系统的生理结构及病理改变。

然而，耳蜗具有独特的蜗形管状结构，传统通过切片或基底膜铺片技术对耳蜗的成像观察，会造成空间信息的丢失^［11］。显微断层扫描（micro-CT）可以实现整体样品的三维成像，其射线光源可以穿透数厘米厚的样品进行成像，但其成像分辨率较差，最高仅为1~2 μm，且其成像结果无法同时清晰展示软组织及骨组织信息^［11-13］。电子显微镜可以实现低于10 nm级别横向分辨率的成像，但其成像深度局限于几十纳米；尽管序列切片后三维重建可以实现整体样品的成像，但成像速度较慢，样品范围局限在细胞水平，主要用于研究完整细胞背景下的亚细胞结构，无法描述介观尺度的神经投射信息^{［12，14］}。光片显微镜可以对组织透明化的样品进行三维成像，其成像深度可达数毫米，可以在保留完整耳蜗三维结构的同时，实现耳蜗亚微米级别分辨率的三维成像，还可以通过结合特异性荧光标记实现耳蜗生理或病理结构的三维可视化，其成像速度也快于micro-CT^［12］。

组织透明化是通过化学试剂处理使样品各组织均呈现透明状态，进而使激光可以穿透整个样品进行成像。已有研究采用iDISCO^［15］、cDISCO^［16］、Sca/eS^［17］等透明化方法，结合光片显微镜对耳蜗样本进行三维成像，成功观察到了耳蜗的骨骼结构，并获取了SGN与毛细胞的位置和数量信息^{［10，18-19］}。但光片显微镜的成像质量容易受到多种因素的影响，在检测耳蜗这类结构复杂的样品时容易产生光学像差，图像分辨率也较为有限^［20］。

近年来，组织透明化及三维成像技术也在不断更新。如：活体动物的组织透明化技术已经成为可能^［21］；vDISCO通过压力驱动的纳米抗体增强溶剂系统，对整只小鼠进行透明化的同时，能够长期维持较强的荧光信号^［22］；wildDISCO方法无需依赖转基因报告动物或纳米抗体即可实现小鼠全身的免疫标记和组织透明化^［23］；HYBRiD是在DISCO方法的基础上进行改良，发展出一种基于水凝胶成分的组织透明化方法，为小鼠全身透明化提供了经济且通用的解决方案^［24］；PEGASOS可以对同时包含软组织和硬组织的样品进行透明化^［25］，TESOS则可在此基础上对透明化样品进行包埋，从而使样品可以进行序列切片，突破高倍共聚焦显微镜的工作距离限制，实现大体积组织高分辨率的拍摄^［26-27］。

本课题结合PEGASOS和TESOS组织透明化技术、多尺度分辨率的成像技术、全组织免疫荧光染色等方法，构建适用于外周听觉神经系统的多尺度分辨率的三维成像平台，成功对耳蜗及其周围组织进行三维成像，探索耳蜗整体样品组织透明化与免疫荧光染色的兼容性，并进行了神经纤维走行的观察与单根纤维的追踪，旨在为探索生理性及病理性耳蜗信息传递结构提供技术支持。

胸腺细胞抗原1（thymus cell antigen 1，Thy1）驱动黄色荧光转基因小鼠（Thy1-YFP-16小鼠），8~12周龄，听力正常，引自北京脑科学与类脑研究中心赵瑚老师课题组，实验动物生产许可证号为SCXK（京）2022-0008。小鼠饲养于上海交通大学医学院附属第九人民医院浦东实验动物中心，实验动物使用许可证号为SYXK（沪）2020-0025。环境为SPF级屏障环境，屏障内维持12 h光照/12 h黑暗周期，提供充分的水和饲料，温度和湿度分别维持在25 ℃、60%~70%。

兔源抗神经丝蛋白200（NF200）抗体、山羊抗兔IgG二抗、叔丁醇（tB）、苯甲酸苄酯（BB）、免疫染色通透液、双酚A乙氧基化物二丙烯酸酯、聚（乙二醇）甲醚甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸羟乙酯（PEG500）、牛血清白蛋白（BSA）、2-（二甲氨基）甲基丙烯酸乙酯（Sigma-Aldrich，美国），碘化丙啶（PI）/核糖核酸酶（RNase）染色液（ThermoFisher，美国），EDTA脱钙液（慢脱）、通用型组织固定液［4%多聚甲醛（PFA）；武汉赛维尔生物科技有限公司］，N，N，N'，N'-四（2-羟基丙基）乙二胺（Quadrol；上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

RM2265石蜡切片机、SP8激光共聚焦显微镜（Leica，德国），AXR激光共聚焦显微镜（Nikon，日本）。

腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉小鼠，用PBS以及4%PFA对小鼠进行心脏灌注。随后将死亡小鼠断颈，解剖并分离出大脑以及连接的双侧耳蜗，将其浸泡在4%PFA中4 ℃过夜固定。

脱色液：使用去离子水配制25%的Quadrol溶液。

脱脂液：用去离子水分别将tB稀释为30%、50%、70%溶液，然后按3%加入Quadrol，调整pH值至9.5。

脱水液tB-PEG：75% tB+22% PEG500+3% Quadrol。

透明液BB-PEG：BB、PEG500、Quadrol的体积比为75∶25∶3。

透明液BB-BED：50%BB+30%双酚A乙氧基化物二丙烯酸酯+10% 2-（二甲氨基）甲基丙烯酸乙酯+10%甲基丙烯酸羟乙酯。

PEGASOS组织透明化流程：① 将4%PFA固定后的样品用PBS洗3次，每次10 min。② 加入EDTA脱钙液，于4 ℃摇床上脱钙2 d，每天换液。③ PBS洗3次，每次10 min。④ 加入25% Quadrol脱色液，于37 ℃摇床上脱色1 d。⑤ 依次更换30%、50%、70% tB脱脂液，分别于37 ℃摇床上脱脂约6、6、12 h。⑥ 加入脱水液tB-PEG，于37 ℃摇床上脱水2 d，每天换液。⑦ 加入透明液BB-PEG，于37 ℃摇床上透化1 d。

TESOS组织透明化流程：将经PEGASOS透化的组织样品先用BB-BED透明液于4 ℃下置换1 d，再进行透明包埋。即将样品置于包埋盒中，用BB-BED透明液包埋，随后用紫外线固化灯照射，形成透明胶块。

在透明化流程中进行免疫荧光染色：在PEGASOS组织透明化第⑤步梯度脱脂后，依次用50%、30% tB脱脂液，于37 ℃摇床上振荡2 h；再用PBS洗3次，每次30 min。随后用封闭液（PBS、免疫染色通透液、BSA按95∶5∶5的体积比例混合）于4 ℃下振荡过夜，再根据需要更换为染料试剂或相应的一抗/二抗。用孵育液（PBS、免疫染色通透液、BSA按100∶0.3∶5的体积比例混合）分别按1∶500和1∶1 000稀释一抗和二抗，用PBS按1∶1 000溶解PI/RNase染色液。染色液和一抗于4 ℃摇床上孵育2~3 d，二抗于4 ℃摇床上孵育1 d。染色液/抗体孵育后的样品用PBS清洗3次，每次2 h，再依次用梯度脱脂液于37 ℃摇床上振荡各2 h。随后继续进行脱水、透化等流程。

对于透明化后的样品，可以直接用AXR激光共聚焦显微镜4×/NA 0.2物镜和SP8激光共聚焦显微镜10×/NA 0.5物镜进行成像。样品置于激光共聚焦培养皿中，加入BB-PEG溶液，取一块盖玻片轻轻压在样品表面，确保盖玻片下方无气泡。将共聚焦培养皿置于显微镜的载物台支架上，即可进行常规共聚焦显微镜成像操作。本研究中，中等分辨率成像使用的激光波长为488 nm。4×/NA 0.2镜头的成像参数：x、y轴分辨率为2.88 μm，z轴分辨率为10.00 μm，z轴总拍摄深度为3 mm。10×/NA 0.5镜头的成像参数：x、y轴分辨率为1.00 μm，z轴分辨率为5.00 μm，z轴总拍摄深度为1.00 mm。

将TESOS透明化胶块用紫外线固化胶水黏附于特定的磁吸载物台上。在石蜡切片机的样品夹上固定另一磁吸底座，该底座与磁吸载物台可相互吸附。在共聚焦显微镜载物台的支架上固定盖玻片，在盖玻片上滴加少量BB-BED透明液，将胶块样品面朝下放置胶块-磁吸载物台，使用SP8激光共聚焦显微镜63×/NA 1.4油镜对切割前后的样品面进行80~100 μm厚度的成像，随后用上述石蜡切片机切除一层厚度小于成像厚度10%的胶块，随后循环重复上述拍摄‒切片的流程，直到目标区域被完整拍摄。本研究中，单细胞分辨率成像使用的激光波长为405、488、568 nm。63×/NA 1.4油镜的成像参数：x、y轴分辨率为0.24 μm，z轴分辨率为1.50 μm，每次拍摄的成像深度为80~100 μm，整体样品的拍摄深度总计约为1 mm。

使用ImageJ 1.53c对高分辨率成像结果进行拼接，使用Imaris 9.9.0软件对各分辨率整体数据进行图像处理、观察及单根神经纤维追踪和长度统计，MATLAB R2024a计算路径曲率，GraphPad Prism 9.5.0进行统计分析。定量资料用x±s表示，组间比较采用配对t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

通过PEGASOS方法对Thy1-YFP-16转基因小鼠的耳蜗及周围前庭、全脑组织样品进行透明化，随后使用共聚焦显微镜对整体样品直接成像，建立了中等分辨率三维成像平台。首先，通过探索不同试剂浓度和处理时间，获得了更适用于耳蜗这一复杂结构的标准化透明流程（图1A）。双侧耳蜗及全脑组织在透明化试剂处理后均表现为一致的高透明度，可以透过样品清晰观察下方网格结构（图1B）。

使用AXR共聚焦显微镜4×镜头对透化样品直接成像，获得了分辨率为2.88 μm×2.88 μm×10.00 μm的双侧耳蜗及全脑组织的三维图像（图1C）。使用Imaris对耳蜗及耳蜗核进行图像分割及颜色改变，在图像中可以观察到耳蜗为形似蜗牛壳的螺旋管状结构，尖端朝下，底部紧贴脑干双侧下方并连接耳蜗核。双侧耳蜗核包绕在脑干延髓和脑桥的交界处。

使用SP8共聚焦显微镜10×镜头对耳蜗及周围1/4脑样品进行透明化后的整体成像，得到分辨率为1.00 μm×1.00 μm×5.00 μm的听觉外周神经通路及周围组织的三维图像。使用Imaris分割区域，分别展示了耳蜗骨壁及内部螺旋神经节和听神经、耳蜗核、前庭和前庭神经及部分脑干组织（图2A）。成像显示耳蜗‒耳蜗核连接处与前庭‒前庭核连接部位重叠，该区域内纤维毗邻交错，难以分割。而既往研究^［28］通过间接标记法也发现耳蜗核可能通过神经投射支配前庭，故推测耳蜗、耳蜗核、前庭之间可能存在信号交互。

单独观察耳蜗‒耳蜗核的听神经通路（图2B）。在听神经离开蜗轴进入耳蜗核之前的位置，可以看到一团游离的神经元。根据既往文献^［29］的报道，推测其为耳蜗根神经元，参与声音惊吓反射的神经环路。单独观察耳蜗核，可以分辨耳蜗核的3个亚区（图2C），分别为前腹侧核（anterior ventral cochlear nucleus，AVCN）、后腹侧核（posterior ventral cochlear nucleus，PVCN）和背侧核（dorsal cochlear nucleus，DCN）。

分离Thy1-YFP-16转基因小鼠的单个耳蜗样品，进行组织透明化的同时使用NF200抗体和PI荧光染料对其标记，随后结合TESOS透明包埋系统^［26］与连续切拍共聚焦成像方法，对耳蜗进行单细胞分辨率的整体三维成像，获得了分辨率为0.24 μm×0.24 μm×1.50 μm的小鼠耳蜗的三维图像（图3A）。

三维成像显示，几乎所有外毛细胞和内毛细胞都至少与1个THY1⁺神经纤维末梢形成突触，且部分支持细胞也与THY1⁺神经纤维末梢接触（图3B、C），每30~80根THY1⁺神经纤维聚集成束，伴行穿过耳蜗骨质的疆孔结构（图3D）。

THY1⁺神经纤维通过疆孔后进入螺旋神经节区域。进入该区域前，部分纤维在外侧骨壁周围形成盘旋状神经路径后再穿过螺旋神经节（图3E），部分直接进入并连接SGN（图3F）。随后，神经纤维继续经过中心螺旋骨壁孔洞，以成束的状态进入蜗轴（图3G），在蜗轴中大量神经纤维顺着骨壁方向延伸；但还有一部分神经与蜗轴呈水平方向行走，交错于纵向神经纤维（图3H）。由此推测，SGN树突端及蜗轴内不同走行的神经纤维可能具有不同功能。

此外，NF200抗体全组织免疫荧光染色可清晰标记SGN的胞体、树突（图3I）及轴突（图3J），与THY1⁺内源性荧光信号强度接近。这一方面验证了TESOS组织透明化与全组织免疫荧光染色的兼容性，另一方面，NF200⁺和THY1⁺纤维的不完全共定位现象提示耳蜗内不同的神经纤维具有不同的基因表达倾向。使用不同抗体对神经纤维进行特异性标记，更有利于特定神经通路的研究。

由于观察到THY1⁺神经纤维通过疆孔后进入螺旋神经节区域时有不同的走行特点，因此使用Imaris在螺旋神经节附近区域进行单根神经纤维追踪（图4A）。结果证实有2类走行的神经纤维：一类在到达螺旋神经节外侧时沿其外侧边缘多绕行一段距离，并与其他几根类似的纤维汇聚成一根主干，再穿过螺旋神经节所在区域并入蜗轴纤维（图4B）；另一类则直接从毛细胞位置连接到对应位置的SGN胞体，再沿螺旋结构进入蜗轴（图4C）。根据既往文献中对耳蜗内神经纤维种类的认知，推测第一类纤维代表上橄榄核复合体传入耳蜗的神经通路（即MOC/LOC）^［5］，第二类为听神经纤维^［1］。

成功追踪3根听神经纤维和3根MOC/LOC从毛细胞侧到蜗轴的路径（图4D），使用Imaris量化比较2类神经纤维的长度。对于听神经纤维，我们统计从SGN至毛细胞端这一段纤维的长度；而对于MOC/LOC，由于其胞体位于脑干，且在耳蜗内存在多条分支，我们统计其在耳蜗内从分叉点开始到毛细胞端的各条分叉的长度总和。结果显示，MOC/LOC的分支结构在耳蜗内局部纤维总长度显著大于听神经纤维（图4E，P=0.002）。通过MATLAB计算的曲率分析显示，MOC/LOC的平均弯曲程度略高于听神经纤维，但差异无统计学意义（图4F，P=0.113）。

在维持耳蜗三维整体结构的条件下，对耳蜗的生理功能和病理改变进行观察一直是听觉研究领域的热点，而耳蜗整体成像的关键是组织透明化技术。耳蜗由复杂的双层骨壁螺旋结构组成，双层骨壁间及蜗轴骨壁内侧包含螺旋神经元及神经纤维等重要软组织结构。因此，同时保证耳蜗高透明度及组织完整性是获得高质量三维成像的重要前提。

我们在PEGASOS组织透明化原理的基础上，对试剂浓度和处理时间进行调整，构建耳蜗及周围组织的标准透明化流程。无论是耳蜗样品，还是耳蜗连接的脑组织都达到极高的透化率，激光共聚焦显微镜可直接获得完整样本深度的整体成像。成像结果显示，耳蜗在透明化过程中实现了在不发生形变的基础上等比例缩小。随后，在样品透明化的基础上结合TESOS的透明包埋系统，使用连续切拍的共聚焦成像技术，实现了耳蜗单细胞分辨率的整体成像。不同于荧光显微光学切片断层扫描技术（fluorescence micro-optical sectioning tomography，fMOST）通过1 μm的超薄连续切片及表面成像进行三维重构^［30］，TESOS对透明样本进行包埋后，切片厚度达80~100 μm甚至更厚，能够在高倍物镜的工作范围内进行最大深度的成像，从而减少图像拼接误差，并且仅通过石蜡切片机和磁吸模块即可实现，可在普通实验室开展。

与既往的耳蜗三维成像研究相比，本研究基于PEGASOS和TESOS组织透明化技术构建的单细胞分辨率成像平台，成功克服了样品体积与成像分辨率之间的技术矛盾，实现了更高分辨率的全耳蜗三维成像，对耳蜗内神经纤维的展示更为清晰，直观地展示了听神经通路与周围组织尤其是前庭神经通路交错复杂的纤维分布，提示耳蜗、耳蜗核、前庭之间可能存在信号交互。在单细胞分辨率的耳蜗图像中，还可以观察到耳蜗内神经纤维在骨质结构中穿行的不同路径，以及THY1⁺神经纤维末梢与内、外毛细胞和支持细胞的普遍接触。这些现象在光学显微镜和microCT的成像结果中均无法被观测，进一步证实了该成像平台在较大体积样品高分辨率三维成像中的优越性。

此外，本实验还将组织透明化与全组织免疫荧光染色流程相结合，实现了对耳蜗整体样品的抗体标记和三维成像，且转基因小鼠的内源性荧光信号和抗体的外源性荧光信号在三维成像中都得到了较好的呈现；由此推断，可以通过抗体的特异性标记对耳蜗不同类型的神经纤维进行三维成像相关的研究。在耳蜗单细胞分辨率的三维图像中，单根神经纤维清晰可辨，通过计算机软件对神经纤维进行追踪，描绘了耳蜗内螺旋神经节附近神经纤维的可能路径，证实了神经纤维追踪的可能性，为耳蜗内神经网络的深入研究提供了新方法。

上述基于多尺度分辨率的耳蜗内神经纤维的三维成像平台为生理模式下的耳蜗结构和神经通路的研究提供了方法，还可以用于研究耳蜗内神经的可塑性及病理变化、不同类型神经纤维的空间分布及功能关系、耳蜗根神经元与声音惊吓反射等。此外，将单细胞分辨率成像的样品范围从耳蜗扩大到其与耳蜗核甚至与脑干的整体组织，可以进行耳蜗传入、传出神经通路的整体三维重构，进而推动对耳蜗上游听觉编码机制及耳蜗接受的下行投射调节机制的研究。

本研究尚存在一些不足之处。本研究建立的高分辨率三维成像方法更适合体积较小的整体样品，虽然如全脑大小的组织在原理上可以实现高分辨率成像，但其成像时间过长，容易出现成像平面偏移或样品干裂等问题。此外，在数据分析方面尚未建立从图像拼接到纤维追踪的规范化流程，若后续开展神经网络的研究，则需要对数据处理方法进一步完善。