›› 2011, Vol. 31 ›› Issue (2): 177-.doi: 10.3969/j.issn.1674-8115.2011.02.013
周莎莎, 李 嫔
ZHOU Sha-sha, LI Pin
摘要:
目的 构建大鼠NELL2基因真核表达载体pcDNA3.1(-)-NELL2的microRNA (miRNA)干扰质粒,观察其转染体外细胞系后对NELL2 mRNA表达的干预效应。方法 从SD大鼠下丘脑组织中提取总RNA,设计特异性引物,采用RT-PCR技术扩增NELL2基因全长cDNA,利用T载体将目的片段克隆至表达载体pcDNA3.1(-),得到重组质粒pcDNA3.1(-)-NELL2。针对NELL2基因分别设计4对pre-miRNA序列,通过T4连接酶克隆至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA表达载体构建干扰质粒(p-NELL2-miRNA1~4)。将p-NELL2-miRNA1~4分别与pcDNA3.1(-)-NELL2共转染人胚肾细胞系(HEK293)(p-NELL2-miRNA1~4干预组),采用Real-Time PCR技术检测转染后48 h细胞NELL2 mRNA表达;以转染pcDNA3.1(-)-NELL2细胞作为阳性对照组,以共转染pcDNA3.1(-)-NELL2和阴性对照干扰质粒pre-miRNA-neg细胞作为阴性对照组。结果 酶切和测序鉴定结果表明:重组质粒pcDNA3.1(-)-NELL2 和干扰质粒p-NELL2-miRNA的片段大小与预计相符,且克隆序列正确。Real-Time PCR结果显示:干预组细胞NELL2 mRNA表达显著低于阳性和阴性对照组(P<0.05或P<0.01)。结论 成功构建NELL2基因真核表达载体及其microRNA干扰质粒,证实干扰质粒对HEK293细胞NELL2 mRNA表达具有特异性的抑制效应。