10号染色体磷酸酶和张力同源蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN）是一种重要的抑癌因子^［1-2］，参与调控细胞的生长、增殖、代谢等多种重要生命活动^［3］。PTEN既可作为脂质磷酸酶，也可作为蛋白磷酸酶，主要依赖其双重特异磷酸酶活性起作用。其作为脂质磷酸酶可以通过使底物磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PIP3）去磷酸化，抑制丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine kinase，Akt）信号通路，从而发挥抑癌功能^［4-5］。此外，PTEN也可以进入细胞核发挥“脚手架”功能，调节细胞周期^［6］。近年来，PTEN还被报道与前体mRNA的可变剪接有关^［7］。

前体mRNA的可变剪接是真核系统调控蛋白表达的重要机制。它能使同一基因编码产生多种转录本，丰富蛋白的表达形式^［8］。可变剪接不但在细胞表达调控、生物体发育中发挥重要作用，而且与肿瘤等系统性疾病的发生密切相关。在肿瘤细胞中，一些重要基因通过可变剪接产生不同于正常细胞的剪接异构体，并直接导致肿瘤的发生和发展^［9］。此前，我们发现PTEN敲低会引起一系列基因前体mRNA的可变剪接异常，其中就包括叉头框转录因子M1（forkhead box M1，FoxM1）。

FoxM1属于Forkhead家族，与细胞的增殖、氧化压力保护以及染色体稳定性有关。在许多类型的肿瘤中均检测到FoxM1的高表达^［10］。FoxM1前体mRNA通过可变剪接可产生3种经典亚型。其中，FoxM1A在人正常细胞中的丰度最低，且为失活状态^［11］。目前有关FoxM1B的报道相对较多。FoxM1B参与调控细胞周期^［12］，其表达上调会引发基因组不稳定并诱导肿瘤产生^［13］；FoxM1B又可以促进血管生成和肿瘤转移^［14］。FoxM1C被报道能拮抗高压氧诱导的衰老，并维持癌细胞干性^［15］；在胰腺癌中，FoxM1C与上皮间质转换（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和肿瘤转移有关^［16］。根据文献报道，FoxM1B和FoxM1C的功能比较接近，因此传统观点认为不同的亚型只是作为FoxM1的备份，以便在某一种亚型功能失常时由其他亚型代偿其功能。

我们在之前关于PTEN与前体mRNA可变剪接的研究中，通过二代测序发现FoxM1的可变剪接是PTEN所调控的可变剪接事件之一^［17］。本研究拟利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）在PTEN敲低细胞中对这一现象进行验证，并探究PTEN敲低对FoxM1B和FoxM1C mRNA产生的影响，从而进一步探讨FoxM1可变剪接对肿瘤细胞迁移的影响及其潜在机制。

人胚肾293T细胞，人前列腺癌DU145细胞，人结肠腺癌RKO细胞，人结肠癌SW480、SW620细胞，均购自中国科学院细胞库。使用添加10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，于37 °C、含5% CO₂的细胞培养箱中培养。

胎牛血清购自德国Sigma，TRIzol购自美国Invitrogen，反转录随机引物购自日本Takara，M-MLV反转录酶购自德国Promega，SYBR BR Green PCR Master Mix购自美国Applied Biosystems，硝化纤维素膜购自德国Bio-Rad，辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国Cell Signaling Technology，ECL化学发光试剂盒购自德国Merck Millipore，荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega，4%多聚甲醛、磷酸盐缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司，PTEN兔单克隆抗体（货号9188）购自美国Cell Signaling Technology，Flag-HRP抗体（货号A8592）购自德国Sigma，β-actin兔单克隆抗体（货号GB15003）购自武汉赛维尔生物科技有限公司。生物安全柜、CO₂细胞培养箱、qPCR仪来自美国Thermo，荧光显微镜、Leica TCS Sp8STED共聚焦显微镜来自德国Leica。

293T细胞生长密度达80%时进行慢病毒包装。在1.5 mL无菌EP管中加入470 μL减血清培养基和30 μL聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI），室温静置5 min。将Δ8.9、PMDG、目的质粒按照6∶3∶9的比例加至1.5 mL无菌EP管中，再加入500 μL静置后的PEI悬液。振荡5 s后室温静置10 min，旋转缓慢滴入预先铺好293T细胞的培养皿内，于37 ℃、含5% CO₂的细胞培养箱中继续培养。24 h后换成新鲜培养基，收集慢病毒感染24 h、48 h的细胞。对于过表达慢病毒包装，目的质粒为PLVX-EV-Flag-ZSG（对照）和PLVX-FoxM1B/C-Flag-ZSG；对于敲减慢病毒包装，目的质粒为PGIPZ-shEV（空载）和PGIPZ-shPTEN#1/#2。对照及针对PTEN的短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）序列见表1。

收集过表达和敲减慢病毒液，添加至293T、DU145、RKO、SW480和SW620细胞中。培养48 h后在荧光显微镜下通过绿色荧光强度观察病毒感染效率；使用qRT-PCR和蛋白印迹法（Western blotting）验证PTEN敲减效率，随后进行后续实验。

用TRIzol裂解293T、DU145、RKO、SW480和SW620细胞，每毫升TRIzol加267 μL三氯甲烷，抽提mRNA。定容后用反转录随机引物和M-MLV反转录酶反转为互补DNA（complementary DNA，cDNA）。将cDNA稀释20倍。扩增需要的引物序列如表2所示。扩增体系为：5 μL 2×SYBR，1 μL模板，0.2 μL上、下游引物，3.8 μL无菌水。将上述液体充分混合，加至384孔板中，每孔10 μL，每组设置3个复孔。设置如下反应程序：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，20 s，72 ℃，30 s；60 ℃，1 min。循环数为40。使用2-ΔΔCT方法分析目的基因的表达量。

细胞用含溴酚蓝的1×SDS裂解，105 ℃加热10 min，冰上静置5 min，再次105 ℃加热10 min。细胞裂解液用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，将凝胶转移到硝化纤维素膜。用1×磷酸盐缓冲液配制5%的脱脂奶粉，室温封闭1 h，用一抗PTEN抗体（1∶100）、Flag-HRP抗体（1∶1 000）、β-actin抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜。第2日用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2 000）在室温孵育1 h。使用辣根过氧化物酶底物试剂盒进行显影检测。

FoxM1B/C过表达DU145细胞提前饥饿24 h，取5×10⁴个细胞加入Transwell小室的上室。下室加入500 µL含胎牛血清的培养基，常规培养6~8 h。取两室中间隔膜，风干，用0.1%结晶紫染色。去离子水清洗浮色，使用扫描仪扫描细胞图像，使用Image J软件统计细胞数量。

用记号笔在6孔板背面，以直尺为参照，每隔0.5 cm均匀地划横线。在孔中加入约5×10⁵个FoxM1B/C过表达DU145细胞，使其过夜能铺满孔板。第2日用枪头尽量垂直于横线划痕。用磷酸盐缓冲液洗去划下的细胞，加入无血清培养基。放入37 ℃含5% CO₂的细胞培养箱培养。培养0、6、12、24 h后取出6孔板，在解剖镜下拍照，使用Image J软件对细胞的迁移距离进行分析。

将2×10⁵个瞬时转染0.5 μg Plvx-FoxM1B-Flag和Plvx-FoxM1C-Flag的293T细胞，培养在含载玻片的6孔板内。第2日取出载玻片，用4%多聚甲醛固定，用0.3%的Triton-X透化15 min，再用2%的牛血清白蛋白室温封闭1 h。4 ℃一抗β连环蛋白（β-catenin）抗体和Flag-HRP抗体孵育过夜，第2日洗涤后使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的山羊抗兔荧光二抗和四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）标记的山羊抗鼠荧光二抗在湿盒中避光孵育1 h，漂洗后加入带淬灭剂的DAPI，封片。使用共聚焦荧光显微镜观察并拍摄荧光图片。

取FoxM1B、FoxM1C过表达及空载293T稳转细胞系，共转染Firefly和Renilla的双荧光素酶质粒，培养24 h后收集样品。加入裂解液，室温裂解细胞15 min。向40 µL的LAR Ⅱ中加入10 µL细胞裂解液，吹打混匀后，检测读数，即为萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）的活性。加入40 µL Stop&Glo试剂，再次读数，即为海肾荧光素酶（Renilla luciferase）的活性。计算每管Firefly luciferase/Renilla luciferase活性的比值（Luc/Ren）。再将空载组的比值定为单位1，即可得到不同处理组相对空载组的luciferase活性，也就是该处理组基因转录的调控活性。

数据采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析。定量资料以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

为了验证PTEN敲低可能引起FoxM1的A1外显子逃逸，导致转录本FoxM1C向FoxM1B转换，首先我们分别构建FoxM1B和FoxM1C过表达及对照293T细胞系，并有针对性地设计3对qRT-PCR引物，分别检测FoxM1B、FoxM1C以及总体FoxM1的mRNA水平。发现所设计的引物确实能分别特异性识别目标mRNA（图1A、B）。

用2条针对PTEN的shRNA，敲低293T、DU145、RKO、SW480和SW620细胞内的PTEN。Western blotting结果显示，2条shRNA均可有效降低293T和DU145细胞内的PTEN蛋白的表达水平（图1C）。qRT-PCR检测发现，在293T和DU145细胞中，与对照（shNC）细胞相比，PTEN敲低后的细胞中的FoxM1B形式的mRNA均显著增多，而FoxM1C形式的mRNA表现为减少或不变，FoxM1的mRNA总体水平没有显著变化（图1D）。在RKO、SW480和DU145细胞中，与对照细胞相比，PTEN敲低后的细胞中FoxM1B形式的mRNA也显著增多，而FoxM1C形式的mRNA同样表现为减少或不变，FoxM1的mRNA总体水平依然没有显著变化（图1E）。这些结果说明在PTEN敲低后，FoxM1在转录水平并没有发生变化，但其可变剪接发生了改变：其他形式的FoxM1向FoxM1B转换。因此，细胞内PTEN敲低影响FoxM1的可变剪接。

DU145是一种PTEN单拷贝缺失的前列腺癌细胞系；PTEN表达量较低，可以很好地模拟PTEN缺失状态下肿瘤细胞的生理特性^［18］。利用DU145细胞构建FoxM1B和FoxM1C稳定过表达的细胞系。Western blotting结果显示，对应亚型蛋白的表达上调，表明FoxM1B和FoxM1C过表达成功（图2A）。通过Transwell细胞迁移实验发现：相较于空载（EV）组，FoxM1B过表达组DU145细胞迁移数量更多（P=0.024），迁移能力增强；有趣的是，与空载组相比FoxM1C过表达组细胞迁移数量减少（P=0.000），迁移能力减弱（图2B）。

接下来我们又进行了细胞划痕实验，发现过表达FoxM1B组的细胞与空载组相比，其愈合能力显著增强（P=0.001），而过表达FoxM1C的细胞愈合能力则比空载组弱（P=0.021）（图2C）。这说明FoxM1B能促进DU145细胞愈合，增强DU145细胞的迁移能力；而FoxM1C则会抑制DU145细胞愈合，减弱DU145细胞的迁移能力。FoxM1B/C对于肿瘤细胞的迁移起着截然相反的作用：FoxM1B发挥促进肿瘤细胞迁移的功能，而FoxM1C则表现为抑制肿瘤细胞迁移。

文献^［18］报道，FoxM1可引起β-catenin入细胞核。但我们通过免疫荧光实验发现，无论是FoxM1B还是FoxM1C过表达，都没能引起β-catenin入细胞核（图3A）。FoxM1B和FoxM1C作为转录因子，对肿瘤细胞转移调控的差异是否是两者转录活性不同导致的呢？用荧光素酶报告基因系统可以检测转录因子的转录能力（图3B）。我们首先构建了FoxM1B或FoxM1C过表达的293T稳转细胞系，然后共转染Firefly和Renilla的双荧光素酶质粒。Western blotting检测到FoxM1B和FoxM1C成功表达（图3C）。但荧光素底物检测发现FoxM1B或FoxM1C过表达细胞内报告基因的表达差异没有统计学意义（P>0.05，图3D），这说明FoxM1B和FoxM1C的转录活性没有差别。因此FoxM1B和FoxM1C在调控肿瘤转移方面的差异也不是由β-catenin转位到细胞核介导的。其具体机制还需要利用其他实验进一步探究。

本研究发现PTEN可以调控FoxM1的可变剪接；证实在PTEN敲低细胞中，存在FoxM1的其他亚型通过可变剪接向FoxM1B亚型转换，从而增加肿瘤细胞迁移能力。人类FoxM1基因有10个外显子；通过外显子的可变剪接，主要产生3个变体：FoxM1A、FoxM1C和FoxM1B。FoxM1B和FoxM1C是转录激活因子，而FoxM1A则没有转录活性^［19］。此外，有研究^［20-21］报道，在肿瘤中FoxM1B或FoxM1C的表达水平较高，而FoxM1A的表达水平较低。故本研究侧重对FoxM1B和FoxM1C亚型进行研究。

既往报道^［22］多集中于FoxM1的促癌效应，研究最多的是FoxM1B。其对肿瘤转移的功能早有报道，并发现其与肿瘤细胞增殖、血管生成密切相关^［23-24］。FoxM1B在口腔鳞状细胞癌早期异常上调，通过诱导遗传不稳定性发挥致瘤作用^［25］。同样，FoxM1B被发现在76.9%的宫颈鳞状细胞癌中过表达，提示其对宫颈癌的发展至关重要^［26］。关于FoxM1C，一些研究报道了其促肿瘤的功能^［22］。FoxM1C过表达与胰腺癌的上皮间质化和转移有关^［27］，与卵巢癌的细胞增殖、锚定性生长、迁移和侵袭有关^［28］。此外，FoxM1C通过转录调控干扰素调节因子1的表达，促进食管癌转移^［29］。目前大量研究侧重于FoxM1B和FoxM1C在肿瘤转移、迁移中的作用，故本文也主要研究其对肿瘤转移而非增殖方面的影响。有研究把不同的FoxM1亚型归结为功能相互代偿的备份体。然而本研究发现FoxM1B和FoxM1C在肿瘤转移过程中存在相反的效应。在人类前列腺癌中，PTEN突变和缺失发生频率很高，有40%的病例发生PTEN基因失活，且与较差的预后和较高的转移能力相关^［30］。本研究在PTEN敲低细胞中发现FoxM1的其他亚型通过可变剪接向FoxM1B转换；在PTEN单拷贝缺失的前列腺癌细胞DU145中发现FoxM1B起着促进肿瘤迁移的功能，而FoxM1C则表现为抑制肿瘤迁移的功能。

这对关于FoxM1变异体的传统认知是一种挑战。但是FoxM1B和FoxM1C的转录活性并没有明显差别，在肿瘤迁移中截然相反的效应似乎与它们的转录活性没有关系。不过FoxM1B和FoxM1C之间存在15个氨基酸的差异。这15个氨基酸的差别是否会使它们各自调控特定基因的转录呢？另外这种差异对其与其他蛋白的相互作用是否有影响？这些都可能是引起两者在肿瘤迁移中差异作用的因素，这背后具体的联系和机制仍有待探索。

FoxM1与多种肿瘤具有关联性，在肿瘤中的重要地位使其具备成为一个靶点的潜力。对FoxM1不同变异体差异性功能的解读有助于我们更深入理解FoxM1和肿瘤的关系。本研究发现，FoxM1B发挥促进肿瘤迁移的功能，而FoxM1C则表现为抑制肿瘤迁移。FoxM1B/C对于肿瘤细胞的迁移起着截然相反的作用，通过增加FoxM1C的表达水平或抑制FoxM1B的表达可以帮助我们在针对FoxM1的肿瘤治疗上寻找新思路。