每年由甲型和乙型流感病毒感染引起的季节性流感在全球范围造成巨大的疾病负担。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）估计，全世界每年有29万~65万例与流感相关的呼吸道死亡病例^［1］。接种疫苗依然是预防流感病毒感染的主要措施。现有流感疫苗的制造工艺多以鸡胚为基础，该工艺生产流感疫苗已有70多年的历史，可生产灭活疫苗和减毒（弱化）活疫苗，但其保护率仅为40%~60%^［2］，因此研发新型流感候选疫苗和改良其免疫策略有望成为提升疫苗保护作用的重要手段。

新型冠状病毒（新冠病毒）引起的全球疫情推动了mRNA疫苗的研发和推广应用。在获得美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的应急使用权后，mRNA疫苗已在全世界完成接种十数亿剂次^［3］，临床试验结果^［4］显示mRNA疫苗可提供高达95%的有效率，其安全性和有效性已得到真实世界数据的支持^［5］。在对不同类型的新冠病毒疫苗接种后的保护效果进行比较研究^［6］后发现，将腺病毒疫苗作为新冠病毒疫苗的第一针后，再进行mRNA疫苗加强免疫，可获得67%~79%的有效率，显著高于2针同源腺病毒疫苗提供的有效率（约50%）。国内研究^［7］亦发现接种2针剂全病毒灭活疫苗后，再进行亚单位疫苗加强免疫，可激发接种者体内更强而持久的体液免疫应答。因此，基于不同种类疫苗进行异源加强免疫的策略可能可以提供更好的免疫保护作用。如何借助mRNA平台快速研发具有高突变特征的流感病毒疫苗，并提出更高保护性的加强免疫策略，是流感疫苗研发的热点方向之一。

在早期的mRNA疫苗研究中，自复制mRNA（self-amplifying mRNA，SAM）制备平台的高速可转换性，为疫苗的快速制备和推广应用奠定了基础。如2013年甲型流感病毒H7N9亚型的血凝素（hemagglutinin，HA）基因编码序列被发布到网络数据共享系统，研究人员仅用8 d制备出候选疫苗，且免疫保护实验结果显示小鼠能产生具有保护性的血凝抑制中和抗体^［8］。后续出现的非自复制mRNA的制备平台凭借其更高的体内应用安全性，逐渐成为各大疫苗研发企业的主要制备策略。但是2种mRNA的免疫反应性还是存在差异，相比80 μg的非自复制mRNA，SAM只需要1.25 μg就可以诱导出相同的保护水平^［9］。

流感病毒表面的HA是主要的免疫原，已有研究^［10］表明基于HA的mRNA候选疫苗能够在小鼠模型中诱导出高滴度的抗体水平，并提供更好的抗流感病毒感染保护作用。为此，本研究选择WHO推荐的2018—2019年北半球流感季节病毒株甲型流感病毒H1N1亚型（influenza virus A/Michigan/45/2015）的血凝素蛋白（M15-HA）作为疫苗靶向分子，通过制备基于脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle，LNP）的M15-HA mRNA修饰核酸非复制型候选疫苗，在评价其免疫原性和介导抗病毒免疫保护作用的同时，探讨其结合传统亚单位疫苗进行异源接种后的免疫保护作用，为未来优化免疫接种策略提供前期理论基础。

SPF级雌性BALB/c小鼠，6~8周龄，购自上海灵畅生物科技有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2023-0003。实验动物委托上海交通大学医学院实验动物中心SPF级动物房饲养，饲养至7~9周龄进行实验，实验动物使用许可证号为SYXK（沪）2018-0027。人胚肾细胞HEK293T细胞由本实验室保存。

酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）用甲型流感病毒H1N1亚型（A/Michigan/45/2015）血凝素A（M15-HA）重组蛋白购自北京义翘神州科技股份有限公司，pUC57质粒购自铂尚生物技术（上海）有限公司，豚鼠红细胞购自南京森贝伽生物科技有限公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠IgG（H+L）、TMB显色液、显色终止液、荧光素酶底物D-luciferin、RIPA裂解液、ECL化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，牛血清白蛋白购自生工生物工程（上海）股份有限公司，T7 RNA聚合酶、NTP混合液、牛痘病毒加帽酶（vaccinia capping enzyme）、mRNA-2-氧甲基转移酶（mRNA cap 2´-O-methyltransferase）、I型DNA酶购自美国NEB公司，N1-甲基假尿嘧啶购自美国APExBIO公司，核酸递送类关键辅料ALC-0315、ALC-0159、二硬脂酰基磷脂酰胆碱（distearoyl phosphatidylcholine，DSPC）、胆固醇购自艾伟拓（上海）医药科技有限公司，抗M15-HA小鼠单克隆抗体、Lipofectamine 3000、RiboGreen、Imject Alum佐剂购自美国Thermo Fisher Scientific公司，96孔酶标板购自美国Corning公司，受体破坏酶（RDE）购自日本生研株式会社，血凝抑制试验用M15-HA蛋白购自英国生物标准品研究所。

微流控设备PZ-11AD-2（上海澎赞生物科技有限公司），Zetasizer纳米粒度电位仪Nano ZS（Malvern，英国），BioTek Synergy多功能微孔板检测仪Neo2（Agilent，美国），IVIS Spectrum小动物活体光学成像系统（Perkin-Elmer，美国），Thermo Labsystems Multiskan SkyHigh全波长酶标仪（Thermo Fisher Scientific，美国）。

本实验所用质粒DNA由铂尚生物技术（上海）有限公司制备获得。从NCBI网站获得萤火虫的荧光素酶蛋白（firefly luciferase，FLuc）核酸序列（GenBank No. M15077.1）和M15-HA核酸序列（GenBank No. APC60198.1）。将上述序列经过人源密码子优化后，人工合成全长基因，并经过HindⅢ和BspQⅠ双酶切后装载至pUC57质粒中，分别构建质粒pUC57-Fluc和pUC57-M15-HA。

以pUC57-Fluc和pUC57-M15-HA质粒为模板，使用T7 RNA聚合酶，通过体外转录（in vitro transcription，IVT）合成获得mRNA前体，通过酶促反应在mRNA前体添加5'帽结构，琼脂糖凝胶电泳鉴定mRNA纯度。

HEK293T细胞接种在6孔板中，用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM，放置于37 ℃和5% CO₂的培养箱中培养。使用Lipofectamine 3000转染试剂转染不同剂量FLuc mRNA（0、0.25、0.5、1.0 μg/孔）或M15-HA mRNA（3 μg/孔）。转染24 h后收集细胞并用RIPA裂解缓冲液裂解后等待检测。

将Fluc mRNA转染细胞后的裂解物转移到96孔板中，添加荧光素酶底物并避光孵育2 min，使用多功能微孔板检测仪测定荧光强度。

将M15-HA mRNA转染细胞后的裂解物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）并转印到PVDF膜上。随后加入含10%脱脂奶粉的PBST（含0.5% Tween20的PBS）封闭1 h。用抗M15-HA小鼠单克隆抗体孵育1 h，PBST洗涤；再用HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体继续孵育1 h，PBST洗涤；用ECL化学发光试剂盒检测。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参。

将Fluc mRNA或M15-HA mRNA溶解在柠檬酸钠缓冲液（pH=4）中，同时将核酸递送类辅料（ALC-0315、ALC-0159、DSPC和胆固醇）溶解在乙醇中，并使用微流控设备将乙醇相和水相按1∶3进行混合，制备mRNA-LNP。随后通过透析方法将mRNA-LNP溶剂置换成磷酸盐缓冲液，分装储存在-80 ℃待用。用纳米粒度电位仪检测mRNA-LNP表征，包括粒径和多分散性指数（polydisperse index，PDI）。将上述mRNA-LNP样品用TE缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH 7.5）稀释获得未裂解（NL）样品或用1% Triton X-100溶液裂解后获得裂解（L）样品，分别加入RiboGreen试剂，使用多功能微孔板检测仪在激发波长480 nm、发射波长520 nm下测量荧光强度。采用以下公式计算mRNA-LNP包封率（encapsulation efficiency）：包封率=［（荧光强度_L样品-荧光强度_NL样品）/荧光强度_L样品］×100%^［11］。

雌性BALB/c小鼠随机分为4组，每组3只。第0日（D0），通过后腿肌内注射不同剂量Fluc mRNA-LNP（0.7、3.5、7.0 μg）或PBS。分别于D1~D4进行小鼠活体成像：小鼠在含有3%异氟烷的小室中接受麻醉后，行腹膜内注射荧光素酶底物D-luciferin（2 mg/只）；注射5 min后，使用小动物活体成像系统，采用5 s或更长的曝光时间进行生物发光成像，使用Living Image软件（版本号：4.7.4）测量生物发光信号。

雌性BALB/c小鼠随机分为5组，每组6只，用于研究mRNA制剂免疫次数和剂量对免疫原性的影响。第0日（D0），通过后腿肌内注射不同剂量M15-HA mRNA-LNP疫苗制剂（20、10、5、1 μg）或PBS，在D21进行第2次免疫接种。在D0、D14、D35和D49，通过内眦取血，分离血清，用于血清抗体滴度检测。

另外为了研究同源加强免疫和异源加强免疫对免疫原性的影响，我们将已完成接种2针剂1 μg M15-HA mRNA-LNP的小鼠随机分成2组（每组3只）：其中一组在D61通过肌内注射1 μg M15-HA mRNA-LNP，另一组小鼠则通过肌内注射含有10 µg M15-HA蛋白和等量Imject Alum佐剂混合的亚单位疫苗制剂。分别在D75和D89通过内眦取血，分离获得血清。以肌内注射PBS为阴性对照组。

使用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液稀释M15-HA蛋白（2 μg/mL）后包被于96孔酶标板板底，2~8 ℃孵育过夜。用PBST洗涤5次后，室温下用含10% BSA的PBS封闭1 h。待测血清用样本稀释液（含10% BSA的PBST）稀释后，加入封闭过的96孔酶标板，37 ℃孵育1 h。用PBST洗涤5次后，加入HRP标记的山羊抗小鼠抗体（1∶500稀释），37 ℃孵育1 h。用PBST洗涤5次后，加入TMB底物，约10 min后终止显色反应。采用全波长酶标仪读取650 nm处的吸光度值。抗M15-HA特异性抗体滴度表示为吸光度值>0.1的最高血清稀释度的倒数。

每只小鼠取10 μL血清，加入30 μL RDE处理，37 ℃水浴孵育过夜；而后在56 ℃下孵育30 min，然后添加60 μL PBS，将血清稀释10倍后，再进行后续2倍梯度稀释。在U形底96孔板中使用4个血凝单位（HAU）的M15-HA蛋白和1%豚鼠红细胞进行血凝抑制试验。每块板上还包括反滴定以确认抗原剂量（4 HAU/25 μL）以及阴性对照样品（PBS或初始对照血清）。致血凝完全抑制的血清最高稀释度为血凝抑制滴度。

应用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析，定量资料数据以x±s表示，组间比较采用双因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

我们选择FLuc作为报告基因，通过IVT和酶加帽的方式制备mRNA，全长2 000个核苷酸（图1A）。在HEK293T细胞系中采用Lipofectamine 3000转染不同剂量的FLuc mRNA。24 h后在细胞裂解物中可检测到荧光素酶蛋白表达，并随转染剂量升高而增强（图1B）。制备获得的FLuc mRNA-LNP疫苗的平均粒径为79.73 nm（图1C），PDI为0.082，包封率>90%。

我们使用FLuc mRNA表达确定LNP的最佳配方参数为46.3% ALC-0315、1.6% ALC-0159、9.4% DSPC和42.7%胆固醇（均为摩尔比例）^［12］，并对小鼠体内mRNA-LNP递送能力进行评估。注射不同剂量（0.7、3.5或7.0 μg）的FLuc mRNA-LNP制剂，采用生物发光成像法检测FLuc mRNA-LNP接种后荧光素酶的活性。结果发现，D1时各剂量组均能在小鼠体内检测到荧光素酶的表达，其中高剂量组（7.0 μg）相比其他剂量组在D4时依旧可在部分小鼠中检测到荧光素酶活性（图2），因此我们确定后续M15-HA mRNA疫苗的最低免疫剂量为1 µg。上述结果表明，采用本研究方法制备的FLuc mRNA-LNP制剂可以在体内进行有效递送和蛋白表达。

我们采用M15-HA作为流感mRNA疫苗的靶抗原，并制备经核酸修饰的M15-HA mRNA-LNP，用于小鼠免疫模型的评估。采用IVT和酶加帽的方式制备的M15-HA mRNA为2 100个核苷酸的全长基因（图3A）。在HEK293T细胞系中转染M15-HA mRNA，细胞裂解物经Western blotting鉴定，检测到M15-HA蛋白的表达（图3B）。制备获得的M15-HA mRNA-LNP颗粒的平均粒径为67.35 nm（图3C），PDI为0.124，包封率>90%。

我们在BALB/c雌性小鼠中评估M15-HA mRNA-LNP的免疫原性，免疫方案见图4A。单次免疫2周后（D14）评估血清中的M15-HA特异性IgG的水平，结果显示所有mRNA接种组均可检测到M15-HA特异性IgG抗体，显著高于免疫前血清抗体水平（均P=0.000），且抗体水平随接种mRNA制剂剂量升高而升高（均P<0.05），20 µg、10 µg、5 µg和1 µg免疫组抗体几何平均滴度（geometric mean titer，GMT）分别为4 677、1 044、1 298、173。在第2次免疫后，所有mRNA接种组M15-HA特异性IgG抗体水平均显著上升（P=0.000），且在D35时已经达到平台期，20 µg、10 µg、5 µg和1 µg免疫组抗体GMT分别为218 700、87 548、218 700及60 703，D49时为218 700、87 548、218 700及42 089（图4B）。以上结果提示，肌内注射M15-HA mRNA-LNP制剂2次（1~20 µg）可在小鼠体内诱导产生较高水平的M15-HA抗原特异性IgG。

采用同一病毒株来源的HA抗原进行血凝抑制试验可以进一步评价小鼠体内功能性抗体的水平。结果显示，在第2次免疫后（D35和D49），4个免疫组M15-HA功能性抗体水平相对于PBS对照组均上升，其中20 μg和10 μg免疫组在D35和D49时功能性抗体滴度水平均显著高于PBS组（均P<0.05）。但是，20 μg组在D49时，功能性抗体滴度水平较D35时显著衰减（P=0.000）。D35时20 µg、10 µg、5 µg和1 µg免疫组功能性抗体GMT分别为905、160、359及127，D49时分别为285、202、101及40（图5）。

由于1 μg剂量M15-HA mRNA-LNP免疫组在第2次免疫4周（D49）后功能性抗体水平下降明显，我们在D61时对其进行第3针加强免疫。将该组小鼠分为2组，分别注射1 μg M15-HA mRNA-LNP制剂（同源加免组）和10 µg M15-HA重组蛋白及等量佐剂（异源加免组）（图6A）。在第3次免疫2周后（D75），2种免疫方式都能够在小鼠外周诱导出较强的免疫反应，其中异源加免组抗体水平较加强免疫前显著上升（均P=0.025）。与同源加免组相比，异源加免组诱导的抗体水平略高，但差异无统计学意义。其中同源及异源加免组在D49（第3次免疫接种前）血清中的总IgG抗体GMT分别为50 546和35 047，加强免疫2周后（D75）GMT分别为258 032和650 199，加强免疫4周后（D89）GMT分别为258 032和650 199。因此，第3次免疫4周后小鼠外周血清总IgG水平能持续保持在较高滴度（图6B）。

血凝抑制试验结果显示，异源加强免疫2周后（D75），可在小鼠外周诱导出更高滴度水平的功能性抗体（P=0.008）；加强免疫4周后（D89）同源和异源加免组功能性抗体水平均有所下降，但其水平仍然略高于未加强免疫前。同源及异源加免组在D49（第3次免疫接种前）血清中的功能性抗体GMT分别为40和25，D75时为127和202，D89时为80和101（图7）。由此可见，2种加强免疫策略均可诱导产生较高水平的特异性IgG抗体及功能性抗体滴度，并能维持较长时间，2种免疫策略间无明显差异。

核酸修饰的mRNA-LNP疫苗已成为控制传染病的重要疫苗制备平台。包封在LNP中的mRNA疫苗，接种后可在宿主细胞内释放mRNA，随后表达所编码的蛋白质抗原，这些蛋白质（通常是病原体的抗原）刺激机体产生免疫效应分子，最终达到清除病原体和保护机体的目的。目前的mRNA疫苗制备主要采用非复制的方式。在确定抗原序列后，体外合成获得编码抗原的核酸序列，制备质粒模板后，再经体外转录和酶加帽获得核酸修饰的mRNA，经微流控设备处理与脂质分子进行混合，被LNP包封后完成制备。目前获批上市或紧急使用的新冠病毒mRNA疫苗，如Pfizer-BioNTech的BNT162b2^［4］、Moderna的mRNA-1273^［13］、沃森联合中国军事科学院军事医学研究院及艾博生物共同研发的AWcorna^［14］和石药集团的SYS6006^［15］等均采用类似的制备流程。本研究中，我们以制备流感病毒mRNA疫苗为目标，搭建了从靶抗原（HA分子）mRNA的序列设计、体外转录合成、LNP包封的完整制备平台，免疫结果也显示制备获得的HA mRNA-LNP在小鼠中可以有效地诱导特异性抗体，并显示出良好的中和活性。

针对流感病毒流行株的多样性和复杂性，借助mRNA疫苗平台的通用性，使制备含有多种流行株的mRNA疫苗的路径更为直接。目前季节性流感mRNA疫苗以四价疫苗为主，抗原组成为WHO推荐的H1N1亚型、H3N2亚型和2种乙型流感病毒株的HA，如Moderna公司的mRNA-1010疫苗即编码WHO推荐的用于南半球预防流感的4种流感病毒株的HA蛋白。最近公布的Ⅲ期临床试验^［16］中期分析显示，相对于传统灭活疫苗，mRNA-1010疫苗能够有效诱导针对H1N1亚型和H3N2亚型的抗体，但针对2种乙型流感病毒的效果均弱于现有疫苗。此外全球有多个流感mRNA疫苗临床试验在同时开展。Pfizer于2022年9月在美国开展的修饰核酸流感mRNA疫苗Ⅲ期临床试验，目前还未公布相关数据。2023年6月Sanofi通过媒体报道其流感mRNA疫苗临床试验观察到与Moderna类似的结果，即只能诱导出针对甲型流感病毒的抗体^［17］。CureVac和GSK合作研发的流感病毒mRNA修饰核酸疫苗于2023年第4季度开展了Ⅱ期临床试验^［18］。美国国家卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）也于2023年5月开展了Ⅰ期临床试验，用于测试通用型流感病毒mRNA疫苗^［19］。在本研究中，我们初步建立了基于M15-HA的mRNA-LNP疫苗，理化分析结果显示出良好的均一性，同时在细胞中可以有效表达。2次免疫小鼠后，4种剂量的mRNA疫苗均能够诱导较高水平的HA特异性抗体的产生，并具有较好的中和活性。比较4种免疫剂量，在第2次免疫后可以发现虽然HA特异性抗体的水平相当，但是其中和活性随着接种剂量的减少而降低，特别是在第2次免疫4周后抗体中和活性下降更为明显。其中的原因在于不同免疫剂量的mRNA可能在体内翻译后产生的抗原水平不同，进而所诱导产生的具有中和活性的抗体水平也不相同。因此，如果需要维持高水平的中和抗体活性，需采用高剂量的mRNA免疫，或在低剂量组中采用多次加强免疫的策略。

为此，我们在研究中还初步分析了完成2次低剂量（1 μg）mRNA-LNP疫苗接种后，进行异源蛋白疫苗（10 μg HA蛋白）或同源mRNA疫苗（1 μg）加强免疫后的免疫反应性和中和活性的比较。事实上，新冠病毒疫苗的临床研究^［20］发现，相比BNT162b2 mRNA疫苗同源加强免疫，S-268019-b刺突蛋白疫苗异源加强免疫产生的与刺突蛋白受体结合域（receptor-binding domain，RBD）结合的IgG维持时间更长。人群研究^［21-22］也发现，对mRNA疫苗、病毒载体疫苗或灭活新冠病毒疫苗采用异源初免-加强策略比同源加强免疫，能诱导出更强的免疫反应。在流感疫苗领域，PR8 HA mRNA（influenza virus A/Puerto-Rico/8/34病毒株）疫苗动物实验^［23］结果显示，免疫顺序也会影响疫苗诱导的体液反应强度，与HA蛋白初免+HA mRNA疫苗加强免疫相比，HA mRNA疫苗初免+HA蛋白加强免疫可诱导更高滴度的IgG2a；在对小鼠进行PR8病毒攻毒实验后，不同免疫顺序所诱导的CD4⁺或CD8⁺ T细胞产生的细胞因子水平也不同。因此，通过设计更优的异源疫苗接种策略提高疫苗的免疫应答的有效性和长效性，也具有重要的现实意义。在我们的研究结果中，2次低剂量的M15-HA mRNA疫苗免疫后，进行同源mRNA疫苗和异源HA蛋白疫苗接种2周后，均能诱导产生更高水平的HA特异性抗体，并在4周后仍然维持在较高的水平；表明低剂量的HA mRNA疫苗接种后，可以通过低剂量的mRNA疫苗或蛋白疫苗加强免疫提高疫苗接种的有效性。虽然在我们的研究结果中，未能观察到2种加强免疫策略的显著差异，这可能与我们初次接种mRNA疫苗的量和加强免疫用的抗原的量的配比尚未优化有关；也提示在进行异源加强免疫策略的实验设计中，需要设计更多的实验组别，在获得最低疫苗使用量后，再确定加强策略的最佳免疫效果。而已有报道^［24-27］发现，蛋白亚单位疫苗在获得理想的免疫效果的同时，可降低多次使用mRNA疫苗所诱导的不良反应，提示mRNA疫苗+蛋白疫苗的综合免疫策略的建立，有可能是未来疫苗接种策略研究方向之一。

综上所述，本研究成功建立了修饰核酸mRNA疫苗制备平台，并根据WHO推荐的来自于H1N1的HA抗原为靶抗原，制备了单价M15-HA mRNA LNP疫苗；该疫苗接种小鼠后显示出较好的免疫原性和血凝抑制活性。对低剂量的mRNA疫苗接种组进行mRNA疫苗和蛋白疫苗的加强免疫可以诱导更高水平的免疫反应。后续我们将进一步构建针对WHO推荐的北半球流行流感病毒株的多价mRNA疫苗，设计异源疫苗接种策略，为mRNA流感疫苗的转化研究提供重要的前期基础。