鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是一种革兰阴性细菌，是医院机会性感染中最常见的致病菌之一，甚至可引起院内感染流行。鲍曼不动杆菌感染是医院感染中最为棘手的病原菌^［1］，主要原因是它常常对碳青霉烯类抗生素呈现不同程度的耐药，大大缩小了抗菌治疗药物的选择范围^［2］。全球正面临着鲍曼不动杆菌耐药率和耐药性逐年上升的严峻趋势^［3］，这将对人类的健康造成极大的威胁。因此，迫切需要阐明鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制，探讨遏制鲍曼不动杆菌耐药的方法。该研究方向是目前院内感染控制领域的重点与热点。

已有研究^［4］发现，鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性往往与碳青霉烯酶、外排泵、孔蛋白和青霉素结合蛋白（penicillin binding protein，PBP）的功能有关。其中碳青霉烯酶起着关键作用。根据Ambler分类，碳青霉烯酶分为A、B、C和D 4个分子类别^［5］；在鲍曼不动杆菌的耐药性中占主导地位的碳青霉烯酶属于D类^［2］。进入细菌的抗生素可以通过外排泵排出，最常见且在耐药菌中常过度表达的外排泵基因属于耐药节结化细胞分化（resistance-nodulation-cell division，RND）家族^［6］。孔蛋白是外膜蛋白中的一种通道蛋白，在促进细菌适应抗生素和宿主应激方面发挥着独特的作用^［7］，其表达降低可减少抗生素进入细菌内部。PBP是细菌细胞壁的主要成分^［8］，该类基因的缺失不仅可导致鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药，同时还可引起对黏菌素的耐药^［9］。

与碳青霉烯类药物敏感的不动杆菌相比，耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌中碳青霉烯酶、外排泵、孔蛋白和PBP的基因表达都发生了改变。但这些耐药基因的表达水平高低与耐药性高低之间是否存在相关性，以及耐药性的高低与耐药基因的种类多寡是否存在联系，目前尚不清楚。为明确上述问题，我们通过改变细菌生存环境中抗生素压力诱导不同耐药水平的鲍曼不动杆菌，分析其耐药基因的种类变化和表达水平。

鲍曼不动杆菌标准敏感株ATCC19606由重庆市人民医院徐璐璐博士馈赠；鲍曼不动杆菌耐药临床株AB.2014由重庆医科大学感染免疫实验室馈赠。

Ex Taq PCR酶预混液（RR001Q）、总RNA提取液（RNAiso Plus，9108）、琼脂糖（5260）购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA纯化试剂盒（DP302）、溶菌酶（RT401）购自天根生化科技（北京）有限公司；Evo M-MLV反转录试剂盒（AG11705）、SYBR Green Pro Taq HS预混型试剂盒Ⅱ（AG11741）购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；LB培养基（10263/13004）购自青岛日水生物技术有限公司；美罗培南（meropenem，MEM；MB1129）大连美仑生物技术有限公司。DNA文库制备试剂盒（NEBNext^® Ultra™ Ⅱ DNA Library Prep Kit for Illumina®，E7645S）购自美国NEB公司。

低速冷冻离心机（Sorvall ST8R，美国Thermo Scientific公司），热循环仪（CFX96 Touch Deep Well，美国Bio-Rad公司），电泳仪（PowerPac HC，美国Bio-Rad公司），核酸成像系统（ChemiDoc^TM Touch，美国Bio-Rad公司），生物安全柜（MSC-Advantage BSC，美国Thermo Scientific公司），紫外分光光度计（AquaMate 7100，美国Thermo Scientific公司）。

所有鲍曼不动杆菌菌株的MEM敏感性均根据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会的建议，采用微量稀释法测定（http：//www.eucast.org）^［10］。

参考CHEN等^［11］的研究方法，将鲍曼不动杆菌标准株ATCC19606过夜培养物用LB培养基稀释至0.5 MCF（McFarland，麦氏浊度单位）标准细菌悬浮液。取15 μL细菌悬浮液，按照细菌悬浮液与LB培养基体积比1∶200接种至含有MEM的3 mL LB培养基中，MEM的浓度为ATCC19606的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的1/2（0.5 μg/mL），37 ℃培养24 h后，转种至含有相同药物浓度的LB培养基中继续培养3 d。然后采用上述方法，依次接种至2倍药物浓度梯度的含药培养液中，直至MEM浓度达到64 μg/mL。在药物浓度加倍之前采用微量稀释法测定细菌突变体的MIC值，将具有不同MIC的细菌衍生株于-80 ℃保存。

以上述相同的方式诱导不同耐药性的鲍曼不动杆菌AB.2014的衍生株。

将AB.2014菌株、抗MEM的ATCC19606衍生株（MIC为128 μg/mL）和AB.2014衍生株（MIC为64 μg/mL）的过夜培养物分别接种到不含MEM的6 mL LB培养基中，接种密度为5×10⁴ CFU/mL，37 ℃培养72 h。然后用LB培养基将培养物稀释为0.5 MCF标准细菌悬浮液，再转种到不含MEM的3 mL LB培养基中，37 ℃培养24 h，再次转种到不含MEM的LB培养基中，重复上述操作。每10 d检测1次上述菌株的MIC值，直至MIC值降低并稳定在某一水平。

将ATCC19606和AB.2014，及它们的耐药衍生株和复敏的衍生株分别接种到LB培养基中，接种密度为5×10⁴ CFU/mL，并在37 ℃的摇床中培养；分别在2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h取等分试样，测定它们在600 nm处的吸光度值［D（600 nm）］。

DNA提取：将上述不同耐药性的细菌株培养24 h后收集菌液，取菌液1 mL，常温条件下，8 000×g离心2 min获得菌体沉淀，然后使用通用DNA纯化试剂盒提取DNA（具体操作流程参考说明书），将获得的DNA于-20 ℃保存。

RNA提取：取菌液1 mL，于4 ℃下8 000×g离心2 min，去除上清液；加入100 μL 10 mg/mL的溶菌酶吹打混匀，放入37 ℃的水浴锅或者培养箱中孵育30 min。然后加入1 mL RNAiso Plus提取RNA（具体操作流程参考说明书）。RNA样本在1.5%琼脂糖凝胶上鉴定分析，并立即反转录成cDNA，于-20 ℃条件下保存。

使用PCR方法检测ATCC19606、AB.2014及其衍生株是否含有以下碳青霉烯酶基因：IMI、KPC、GES-1、IMP、VIM、NDM-1、OXA23、OXA24、OXA51、OXA58。PCR扩增所用引物见表1，部分引物序列参考了既往的文献，其他引物由宝生物工程（大连）有限公司设计，所有引物均由宝生物工程（大连）有限公司合成。PCR反应体系为50 μL，包含25 μL Taq预混液、10 pmol正向引物、10 pmol反向引物、100 ng DNA模板，然后添加无核酸酶水至50 μL。PCR扩增程序：94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延长1 min，共30个循环。获得的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析。采用GoldView核酸凝胶染色法对凝胶进行染色，用紫外透照法观察凝胶。

使用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法检测上述菌株中碳青霉烯酶基因OXA51，外排泵基因adeB、adeG、adeJ，孔蛋白基因carO、omp33-36、oprC，PBP相关基因ponA的mRNA水平，以16S rRNA作为内参。RT-qPCR所用引物见表2，部分引物序列参考了既往的文献，其他引物由宝生物工程（大连）有限公司设计，所有引物均由宝生物工程（大连）有限公司合成。

使用Evo M-MLV反转录试剂盒将mRNA反转录为cDNA，操作方法参考说明书。然后进行RT-qPCR：将cDNA用无核酸酶水稀释5倍后，使用热循环仪进行扩增。反应体系包括：1 μL cDNA模板、2 μL正向引物（10 pmol）、2 μL反向引物（10 pmol）和5 μL SYBR Green Pro Taq HS预混液。反应过程：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环；解离阶段。每个样本重复3次。目标基因计算采用2-ΔΔCT法。

对ATCC19606、AB.2014及其不同耐药程度的衍生株进行全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）。使用DNA文库制备试剂盒（NEB）进行文库构建。在Illumina NextSeq 500平台上，使用配对末端150 bp的序列对汇集的文库进行测序。原始数据的质量由FastQC（v0.11.8）进行评估，然后使用Trimomatic（v0.39）^［18］进行质量剪切，以获得相对准确和有效的数据。参考GATK（v4.1.1.0）^［19］最佳实践推荐的设计过程，使用BWA（v0.7.17）将样本的有效数据与参考基因组进行比较（使用ATCC19606作为参考基因组，登录号为NZ_CP043953.1）。比较结果通过SAMtools（v1.9）进行格式转换和排序，使用GATK的重复标记来标记重复序列。根据比较结果进行冗余序列分析和插入片段分布分析。BEDTools（v2.28.0）用于深度覆盖率的统计分析。使用GATK的单倍型调用者分析每个样本和参考基因组之间的基因型差异，合并和整合不同样本的分析，以获得样本的变异信息。SnpEff（v4.3T）用于根据参考基因组的注释信息注释突变。使用R语言包topGO进行GO（Gene Ontology）富集分析。使用R语言包clusterProfiler^［20］进行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）路径和COG（Clusters of Orthologous Groups of Proteins）分类富集分析。

应用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析。定量资料用x±s表示，2组数据比较采用独立样本t检验，多组数据比较采用单因素方差分析。P<0.01表示差异具有统计学意义。

ATCC19606对MEM的MIC值为1 μg/mL。经诱导后，得到3株抗MEM的突变菌株，MIC值分别为8、16、128 μg/mL，分别命名为ATCC19606-R1、ATCC 19606-R2、ATCC19606-R3（表3）。ATCC19606原始株在不给药的环境下培养传代，每10 d检测其对MEM的MIC，其MIC值维持在1 μg/mL。

AB.2014对MEM的MIC值为16 μg/mL。在药物诱导培养后，获得了2个抗MEM的突变株，分别命名为AB.2014-R1和AB.2014-R2。它们对MEM的MIC值分别为64、128 μg/mL（表3）。AB.2014原始株在不给药的环境下培养传代，每10 d检测其对MEM的MIC，其MIC值维持在16 μg/mL。

在耐药菌株的诱导培养过程中发现，对原始株每24 h进行1次无药传代，每10 d测定1次MIC值，连续传代30代后，菌株的耐药性仍没有变化；但若改变培养条件，则菌株对MEM的敏感性又会提高。即将10 mL试管中原3 mL LB培养基增至6 mL，相应地管中氧气含量减少，培养时间延长至72 h，此时细菌生长已进入衰退阶段，然后再将其重新接种到正常培养条件下（10 mL试管中含3 mL LB培养基）进行无药传代培养，每10 d测量1次MIC值。

以这种方式处理后的ATCC19606、ATCC19606-R3、AB.2014、AB.2014-R1，经过衰退期后的10代无药传代，除ATCC19606外的其他菌株对MEM的敏感性均有所提高。ATCC19606-R3经10代无药传代后，获得ATCC19606-R3-S1（MIC由128 μg/mL降至64 μg/mL），经20代无药传代后获得ATCC19606-R3-S2（MIC进一步降至1 μg/mL，表3）。AB.2014经10代无药传代后获得AB.2014-S1（MIC由16 μg/mL降至8 μg/mL），40代后获得AB.2014-S2（MIC进一步降至2 μg/mL，表3）。AB.2014-R1经10代无药传代后获得AB.2014-R1-S1（MIC由64 μg/mL降至16 μg/mL），20代后获得AB.2014-R1-S2（MIC进一步降至8 μg/mL，表3）。

对MEM耐药性增强的菌株的生长曲线如图1A所示，耐药性减弱的菌株的生长曲线如图1B所示。与ATCC19606相比，衍生株ATCC19606-R1、ATCC19606-R2、ATCC19606-R3的生长速率和生长峰值降低，并且随着耐药性的增加，下降趋势变得更加明显；同时，与ATCC19606-R3相比，耐药性降低的衍生株ATCC19606-R3-S1、ATCC19606-R3-S2，也呈现随着耐药性的降低，其生长速度和生长峰值增强的趋势。但AB.2014的衍生株并没有出现这种趋势。

ATCC19606、ATCC19606-R1、ATCC19606-R2、ATCC19606-R3、ATCC19606-R3-S2均包含3个碳青霉烯酶基因：OXA51、VIM和IMP。AB.2014、AB.2014-R1、AB.2014-R2、AB.2014-R1-S2的碳青霉烯酶阳性基因为OXA23、OXA51、VIM和IMP；但AB.2014-S2的阳性基因仅包括OXA51、VIM和IMP，即与AB.2014相比，AB.2014-S2丢失了OXA23基因。并且ATCC19606相较于AB.2014，ATCC19606缺少OXA23基因（图2）。

针对ATCC19606、ATCC19606-R1、ATCC19606-R2、ATCC19606-R3的RT-qPCR实验结果显示，测试的所有基因中，只有oprC的表达变化差异有统计学意义。随着菌株对MEM MIC值的逐渐增加，oprC的表达水平逐渐降低（图3A）。在AB.2014及其耐药衍生株中，除了omp33-36的表达随耐药性的增加呈现先降低后增加的现象，其余耐药基因的表达均随MIC增加而增加（图3B）。

针对ATCC19606-R3、ATCC19606-R3-S1和ATCC19606-R3-S2的RT-qPCR实验结果显示，除了adeB的表达在耐药性降低过程中先增加后降低以外，其他基因的总体表达水平随着耐药性的降低而降低（图3C）。在AB.2014、AB.2014-S1、AB.2014-S2的RT-qPCR实验中，所有耐药相关基因的mRNA水平都随着菌株MIC降低而降低（图3D）。而在AB.2014-R1、AB.2014-R1-S1、AB.2014-R1-S2中，2个复敏株的耐药基因表达水平均显著低于AB.2014-R1，除carO和adeJ外，其余基因表达水平随着耐药性的降低而降低（图3E）

我们采用成对比较的方式分析本研究中的菌株和衍生菌株，并对菌株所包含的独特变异基因进行功能富集分析。

与ATCC19606-R3相比，ATCC19606差异基因在分子功能（molecular function，MF）方面主要富集于辅因子跨膜转运蛋白活性和铁载体摄取跨膜转运体活性，在细胞成分（cellular component，CC）方面富集于细胞外包结构部分、细胞包膜和细胞外膜，但是在生物学过程（biological process，BP）方面没有统计学意义上的功能富集（图4A）。相对于ATCC19606，ATCC19606-R3的差异基因在MF、CC和BP均没有统计学意义上的功能富集。

与ATCC19606-R3-S2相比，ATCC19606-R3的差异基因在MF、CC和BP均没有统计学意义上的功能富集。而相对于ATCC19606-R3，ATCC19606-R3-S2的差异基因在CC方面主要富集于细胞外包结构部分、细胞包膜和细胞外膜，但在MF和BP方面没有统计学意义上的功能富集（图4B）。

与AB.2014-R3相比，AB.2014的差异基因在BP方面主要富集于细胞对化学刺激的反应，但在MF和CC方面没有统计学意义上的功能富集（图4C）。反之，AB.2014-R3的差异基因在CC方面主要富集于细胞外包结构部分和细胞外膜，但在MF和BP方面没有统计学意义上的功能富集（图4D）。

与AB.2014-S2相比，AB.2014的差异基因在BP方面主要富集于细胞对化学刺激的反应，在MF和CC方面没有统计学意义上的功能富集（图4E）。反之，AB.2014-S2的差异基因在CC方面主要富集于细胞外包结构部分、细胞包膜和细胞外膜，但在MF和BP方面没有统计学意义上的功能富集（图4F）。

与AB.2014-R2-S2相比，AB.2014-R2的差异基因在MF、CC和BP方面均没有统计学意义上的功能富集。反之，AB.2014-R2-S2的差异基因在3个方面也均没有统计学意义上的功能富集。

与AB.2014相比，ATCC19606的差异基因在MF方面主要富集于催化活性，在CC方面主要富集于细胞外周、细胞内膜-有界细胞器和质膜，在BP方面主要富集于细胞有机物分解代谢过程、细胞生物胺分解代谢过程、非核糖体肽生物合成过程、含儿茶酚化合物代谢过程、铁载体代谢过程（图4G）。反之，AB.2014的差异基因在MF方面主要富集于辅酶结合、醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，NAD）活性和催化活性，在CC方面主要富集于细胞内细胞器腔、细胞内膜-有界细胞器和细胞膜-封闭腔，在BP方面主要富集于有机羟基化合物生物合成过程（图4H）。

与ATCC19606-R3相比，ATCC19606的差异基因在细菌分泌系统，氨基糖和核苷酸代谢，硒化合物代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，嘧啶代谢，抗坏血酸和醛酸代谢通路中富集（图5A）；反之，ATCC19606-R3的差异基因在群体感应中富集（图5B）。与ATCC19606-R3-S2相比，ATCC19606-R3的差异基因富集在细菌分泌系统、群体感应以及抗坏血酸和醛酸代谢通路（图5C）；反之，ATCC19606-R3-S2的差异基因没有统计学意义上的通路富集。

与AB.2014-R3相比，AB.2014的差异基因富集在RNA聚合酶和阿特拉津降解通路（图5D）；反之，AB.2014-R3的差异基因没有统计学意义上的通路富集。与AB.2014-S2相比，AB.2014的差异基因富集在RNA聚合酶和阿特拉津降解通路（图5E）；反之，AB.2014-S2的差异基因没有统计学意义上的通路富集。与AB.2014-R2-S2相比，AB.2014-R2的差异基因没有统计学意义上的通路富集；反之，AB.2014-R2-S2的差异基因富集在细菌分泌系统、核糖体和脂多糖生物合成通路（图5F）。与AB.2014相比，ATCC19606和AB.2014-R2的差异基因均没有统计学意义上的通路富集。

在COG分析结果中，并没有发现统计学意义上的分类富集。

鲍曼不动杆菌是医院感染中最为常见的病原菌，且常常对多种抗菌药物耐药，尤其是对治疗院内感染最主要的药物碳青霉烯类抗生素呈现不同程度的耐药，导致治疗方案的选择十分棘手。有研究显示鲍曼不动杆菌面临的抗生素压力会影响其耐药程度，至于不同耐药程度是否与耐药基因种类和表达水平差异存在联系，目前尚不清楚。我们通过观察鲍曼不动杆菌在接触不同浓度碳青霉烯类药物MEM后的变化，探讨其对MEM耐药的机制。

我们研究中的鲍曼不动杆菌标准株ATCC19606最初对MEM敏感，其MIC仅为1 μg/mL；临床分离株AB.2014对MEM耐药，其MIC为16 μg/mL，是敏感细菌的16倍。我们观察到两者的衍生株在相同的生长条件下，表现并不相同：ATCC19606及其耐药衍生株的生长速度和峰值随着耐药性的增加而降低，同时ATCC19606-R3及其敏感衍生株的生长速率和峰值随着耐药性的降低而增加；然而，AB.2014及其衍生菌株并没有表现出相似的变化。有研究^［21］表明细菌为了抵抗抗生素会降低孔蛋白的表达进而降低膜通透性，但同时重要的营养素也同时被排除在周质之外。由此推测，ATCC19606在对MEM敏感性转变的过程中，为了获得对MEM的抗性，其生长速度减慢，可能是由于孔蛋白基因oprC表达减少导致营养吸收受阻所致；而临床耐药菌AB.2014经诱导后耐药性增加可能并不是通过这个途径。

OXA23属于D类β-内酰胺酶。有研究^［22］提到，在重症监护病房患者中表达OXA23的鲍曼不动杆菌菌株的传播与多种医疗相关风险因素和高死亡率有关。在碳青霉烯酶的检测中，我们发现与AB.2014相比，ATCC19606缺少OXA23。同时，与AB.2014相比，AB.2014的敏感突变体AB.2014-S2缺失了OXA23基因。一方面，说明OXA23在鲍曼不动杆菌对MEM耐药机制中具有重要地位；另一方面，当鲍曼不动杆菌生活在低氧等环境中，不接触碳青霉烯类药物时，细菌可能会丢失质粒上的碳青霉烯酶OXA23基因。OXA23是由质粒携带的基因^［23］，这可能可以解释为什么OXA23容易丢失。

抗生素可以通过孔蛋白进入细菌^［24］。当细菌的生存环境中存在抗生素时，菌株可能会降低孔蛋白的表达，降低其膜通透性，从而减少抗生素的进入，但同时也会大大降低营养素的吸收。KNOPP等^［21］的研究提出了细菌在对抗生素产生耐药性过程中的适应成本。当面临抗生素压力时，细菌会做出最佳的牺牲和改变来换取生存。这也解释了在我们的实验中2种菌株的oprC表达的不同变化：ATCC19606对MEM敏感，接触MEM后，它会降低oprC的表达，以减少MEM进入细菌；然而，AB.2014最初对MEM具有耐药性，再次接触MEM后，oprC的表达变得更强。oprC是革兰阴性细菌中铜的TonB依赖性转运体^［25］。ZHANG等^［26］报道，铜冲击负荷试验可导致菌株对抗生素的耐药性增加。我们推测，耐药菌再次暴露于MEM后，oprC表达的增加可以增强菌株对铜的吸收，从而增强细菌的耐药性。

OXA51和RND家族外排泵基因的过度表达是细菌产生耐药性的原因之一^{［11，27］}。我们发现，不论是ATCC19606还是AB.2014，当鲍曼不动杆菌对MEM的耐药性增加时，OXA51和外排泵基因的表达均会增加；但当耐药性降低时，OXA51和RND外排泵的过度表达会逆转。PBP相关基因ponA也发生了同样的变化趋势。PBP是碳青霉烯类药物的靶标，与细菌的生物活性密切相关，ponA的失活可导致部分细胞裂解和细菌生长抑制^［28］。因此，ponA的表达水平可能与细菌耐药性的强弱有关。

在GO分析结果中，我们发现在敏感株接触MEM并获得对MEM耐药性的过程中，表达变化的基因没有出现明显富集。当环境失去MEM的压力后，菌株对MEM重新敏感，表达变化基因的功能富集焦点才回到细胞外膜。但对于临床耐药株AB.2014，无论是在再次接触抗生素后其耐药性增加，还是在环境中MEM压力丧失后其耐药性降低，都与细胞外膜上的基因突变密切相关。

群体感应是微生物群落与周围环境联系的重要通信工具，也是细菌用来协调集体行为的细胞间通信程序，它依赖于细胞外信号分子（称为自诱导物）的产生、释放和检测^［29-30］。我们通过KEGG分析结果发现，耐药衍生株ATCC19606-R3对应于标准株和敏感衍生株的变异基因在群体感应中富集，这提示当细菌接触到威胁其生存的抗生素时，它们会改变群体感应相关的基因功能，以调节群体内部以及群体与环境之间的关系，从而实现最佳生存。

总之，鲍曼不动杆菌敏感株在碳青霉烯类药物环境中可演变为耐药菌，但敏感细菌的耐药性增高机制与耐药细菌不完全相同；而当生活环境中没有MEM时，细菌在衰退期后的后续传代中耐药性降低，孔蛋白、外排泵、OXA51和ponA表达基本上随耐药性的降低而降低。