流行病学调查显示，前列腺癌是高致死率的癌症之一^［1］。尽管目前前列腺癌的治疗方案具有较好效果，但患者仍然经常出现局部复发和晚期远处转移，是引起患者死亡的主要原因。肿瘤细胞可以通过在原发肿瘤处侵袭黏膜，浸润周围组织，或经由血液系统、淋巴系统等途径撒播并定植到远处器官，并最终导致患者死亡。这一过程常伴随着上皮-间质转化、免疫逃逸、抗药性产生、细胞干性重编程等肿瘤转移常见特性的出现^［2］。因此深入了解前列腺癌的发生发展机制对于发现新的治疗靶点、提高治疗效果具有重要意义。

多梳蛋白家族（polycomb group，PcG）是一类表观遗传抑制因子，主要通过对染色质组蛋白的修饰，在干细胞分化以及肿瘤的发生和转移中发挥重要作用^［3］。染色质组织调节框同源蛋白8（chromobox protein homolog 8，CBX8）是PcG中的重要成员之一。CBX8与其他蛋白相互结合形成多梳蛋白抑制复合体1（polycomb repressive complex 1，PRC1），进而通过识别PRC2介导转录抑制性标志物组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3）调节基因表达。然而近年来研究^［4］表明PRC1和PRC2复合物也存在很多相互招募的机制以及独立的作用功能。

PRC1复合体在肿瘤发生及转移过程中的调控作用比较复杂，在不同种类的癌症中的作用机制存在差异。PRC1复合体在双阴性前列腺癌中可以促进肿瘤细胞转移，而CBX家族蛋白作为其组成亚基在前列腺癌转移灶中有基因拷贝数扩增与基因表达升高的现象^［5］，但CBX8蛋白在前列腺癌中的生物学意义尚不清楚。在小鼠造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）中，CBX7有维持HSC自我更新与维持的作用^［6］；在之后的HSC分化成熟过程中，CBX8与CBX2、CBX4表达逐渐升高并组成新的PRC1复合体抑制CBX7及干细胞自我更新相关蛋白的表达，促进HSC向不同细胞类型方向分化；而CBX7若无法被其他CBX蛋白替换将导致HSC的过度增殖从而造成白血病^［7］。这提示了CBX同源蛋白在维持细胞干性与促进分化的能力上有所不同。近年来发现CBX2、CBX4、CBX8在急性髓系白血病与多种肿瘤如喉鳞状细胞癌、肺腺癌、骨肉瘤和肝癌中存在高表达^［8-12］，而CBX6、CBX7在乳腺癌、膀胱癌中存在低表达^［13-14］，这提示CBX蛋白家族在不同肿瘤中可能存在表达差异。研究发现在前列腺癌细胞系PC-3和DU145中敲减CBX7可以抑制细胞的增殖，CBX7呈原癌基因的功能^［15］；但Cbx7全身敲除小鼠模型则易产生肝癌与肺癌^［16］，提示其亦具有抑癌基因的作用。CBX8在喉鳞状细胞癌和结肠癌中促进癌细胞的增殖及迁移能力^{［12，17］}；在食管鳞状细胞癌中促进细胞增殖但抑制了肿瘤细胞的侵袭与迁移能力^［18］。这些研究表明特定CBX蛋白在不同肿瘤组织基因背景与细胞环境的差异中可能存在不同的生物学功能。CBX家族蛋白含有保守的Chromo（chromatin organization modifier）结构域，可以特异性地结合基因组上的H3K27me3修饰^［19］，而CBX8的Chromo结构域可以同时结合DNA与H3K27me3修饰。针对这一结构域设计的变构激活小分子可特异地结合CBX8 Chromo结构域，并显示良好的成药前景。因此，CBX8在前列腺癌中的生物学作用与意义亟待探究。

本研究通过在前列腺癌患者数据中鉴定CBX8的表达情况，随后在前列腺癌细胞中敲低CBX8，研究CBX8对肿瘤细胞侵袭的影响，进一步通过转录组分析和染色质免疫沉淀测序研究其潜在作用机制，揭示CBX8在前列腺癌中的生物学意义和作用机制，并对其可能的下游靶点进行鉴定，以期为前列腺癌提供新的诊断与治疗靶点。

结晶紫购自美国Sigma-Aldrich；XhoⅠ酶、NotⅠ酶、StuⅠ酶、T4连接酶、Taq DNA聚合酶、碱性磷酸酶（CIP）、6×DNA loading buffer、10×NEB buffer 3.1购自美国New England Biolabs；Protein G免疫磁珠购自美国Thermo；Trizol购自美国Thermo Fisher；过硫酸铵（APS）、十二烷基硫酸钠（SDS）购自美国Fisher；琼脂购自美国BD；甲醇购自上海国药集团化学试剂公司；40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29∶1）溶液购自上海生工生物工程股份有限公司；硝酸纤维（NC）膜购自美国GE HealthCare；PBS、高糖DMEM培养基购自上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清（FBS）购自太仓依科赛生物科技有限公司；Opti-MEM培养基、胰酶、青霉素-链霉素双抗、嘌呤霉素、polybrene购自美国Gibco；Matrigel基质胶购自美国Corning；人Actin抗体（货号AC004）、人CBX8抗体（货号A6222）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；辣根过氧化物酶偶联抗兔二抗购自美国Jackson；16%多聚甲醛购自美国Thermo；0.45 μm孔径滤器、24孔板用Transwell小室（孔径5.0 μm）、24孔细胞培养板、96孔细胞培养板购自美国Corning；转膜用滤纸购自美国Whatman；VAHTS Universal DNA文库纯化试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

Leica TCS SP8共聚焦显微镜购自德国Leica；PCR仪、化学发光成像仪购自美国Bio-Rad；细菌培养箱购自知楚生物科技（上海）有限公司；稳压稳流电泳仪购自上海天能科技有限公司；半干转膜仪购自美国Ellard；显微镜购自日本Nikon；酶标仪购自美国Molecular Devices。

TOP10感受态大肠埃希菌为实验室制备；人胚肾上皮细胞系HEK-293T、人前列腺癌DU145细胞由上海交通大学医学院余健秀实验室惠赠。HEK-293T细胞及DU145细胞以高糖DMEM完全培养基（含10% FBS、1%青霉素链霉素双抗），以10 cm培养皿置于CO₂恒温恒湿培养箱中在5% CO₂、37 ℃条件下培养并传代。

pGIPZ-shControl-puro、pGIPZ-shCBX8-1-puro、pGIPZ-shCBX8-4-puro的短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）质粒购自上海交通大学基础医学院公共技术平台基因文库实验室。psPAX2、pMD2.G质粒为实验室自有。所含反向互补序列：shControl，5'- ATCTCGCTTGGGCGAGAGTAAG-3'；shCBX8-1，5'-AGATTATCTCTAGAGTTAT-3'；shCBX8-4，5'- GTGAGCTTGGCATAGTGAT-3'。

在cBioPortal数据库^［20］网站（https：//www.cbioportal.org/）分析CBX8在前列腺癌样本中对比健康组织基因表达情况，选择研究“Prostate Adenocarcinoma（TCGA，Cell 2015）”，选择研究基因CBX2、CBX4、CBX6、CBX7、CBX8；选择选择要研究的项目“Mutations，Putative copy-number alterations，mRNA Expression： z-Scores relative to diploid samples（RNA Seq V2 RSEM）”，导出数据保存。

根据实验所需细胞数量提前传代铺板，当细胞增殖至70%~80%的密度时，以负压泵吸去培养基，更换为无血清培养基。对于慢病毒包装生产，按照目的质粒∶psPAX2∶pMD2.G质粒=4∶3∶1的质量比转染所需质粒。10 cm培养皿总计转染16 μg质粒。将提前准备好的质粒按照所需质量加至250 μL Opti-MEM无血清培养基，涡旋混匀后瞬时离心静置。按照1 μg质粒∶3 μL 1 mg/mL PEI溶液的比例，吸取PEI溶液加至250 μL Opti-MEM无血清培养基，涡旋混匀后瞬时离心。将含PEI的培养基加至含质粒培养基的离心管中，反复颠倒混匀后离心静置20 min。将混合好的质粒/PEI培养基溶液以中号枪头均匀滴至培养皿中。将细胞置于培养箱中孵育6 h，吸弃培养基，更换为8 mL完全培养基。

转染后48 h，以15 mL离心管收集培养基上清病毒液，将上清液以0.45 μm孔径的滤器过滤。提前传代好细胞，待密度约50%时将过滤后的病毒液加至培养皿内，以病毒液∶完全培养基体积比为1∶1的比例补加完全培养基，加入polybrene至终浓度8 μg/μL，摇匀，置于培养箱内感染16 h。换液为完全培养基，48 h后加药筛选。

采用含嘌呤霉素（终浓度2 μg/mL）的完全培养基进行筛选，同时将提前准备好的野生型细胞株同样更换为含嘌呤霉素的培养基一起加药处理。48 h后观察细胞，若作为对照的野生型细胞全部变圆漂起死亡，则可换为完全培养基。以蛋白质印迹法（Western blotting）检测目的基因敲低水平，并及时冻存细胞。计数200个细胞接种至10 cm培养皿，培养2周；当单细胞生长成包含50~100个细胞的细胞团时，显微镜下以中号加样枪头刮取细胞接种至96孔板，扩大培养并分离单克隆细胞系。

将细胞用PBS洗净后，加入200 μL 3×SDS loading buffer，冰上裂解。吸取全部样品至离心管后置于100 ℃金属浴5 min，转移至冰上冰浴5 min，反复3次。在1×Tris-甘氨酸-SDS电泳液（25 mmol/L Tris、250 mmol/L甘氨酸、0.1% SDS）中加样后恒流30 mA电泳45 min。将胶转移至半干转膜仪上加滤纸和5 mL转膜液（25 mmol/L Tris、250 mmol/L甘氨酸、0.1% SDS、200 mmol/L甲醇），以100 mA稳流转膜1 h。将膜放置于60 ℃烘箱中干燥20 min后，用水浸润，将膜置于含10%脱脂奶粉的TBST封闭液［10 mmol/L Tris·HCl （pH 7.5）、0.15 mol/L NaCl、0.05% Tween-20］中，室温水平摇晃封闭30 min。以含2%脱脂奶粉的TBST缓冲液冲洗，加入含2%脱脂奶粉的一抗TBST溶液，室温孵育2 h。洗去未结合的一抗后加入含有二抗和2%脱脂奶粉的TBST缓冲液，室温孵育45 min，以TBST缓冲液洗膜1次。将膜置于化学发光成像仪中，拍照记录。

待提前铺板的贴壁细胞密度达80%时消化重悬，计算细胞悬液密度。取1 000个细胞以100 μL完全培养基接种至96孔板中。每个时间点3个复孔，接种3组。在96孔板最外围孔内加入200 μL PBS减缓蒸发。接种后加入10 μL CCK8溶液，置于37 ℃培养箱2 h后读取450 nm波长下的吸光度值［D（450 nm）］。第二日吸弃培养基，加入含同样体积CCK8的培养基110 μL，置于37 ℃培养箱2 h后读取D（450 nm），同时给尚未读数的孔换液。第四日以同样方法测D（450 nm）。

提前将孔径8 μm的Transwell小室置于24孔板中，在上室加入无血清培养基500 μL润化。置于37 ℃培养箱中30 min。将提前一日置于4 ℃冰箱中冰上融化的基质胶（matrigel）原液以4 ℃预冷的无血清培养基冰上稀释20倍至浓度0.5 mg/mL。吸去上室中的培养基，以预冷枪头向孔中加100 μL稀释的matrigel，置于37 ℃培养箱中凝胶1 h。消化提前铺板的密度约80%的细胞，离心后重悬并计数，将细胞悬液密度调整至3×10⁶个/mL。吸去上室的培养基或凝胶后的上清液，向每孔加100 μL细胞悬液（3×10⁵个细胞）。在下室加入600 μL完全培养基，置于培养箱中培养24 h后收集样品。吸弃上室与下室液体，在下室加600 μL 4%多聚甲醛室温固定20 min。将小室转移至600 μL 0.1%结晶紫PBS染液中室温染色。PBS洗去多余染液，将上室内的细胞用棉签擦去，再在PBS中洗涤2次，倒扣晾干。将小室置于培养皿盖上，用拍照显微镜以20×物镜随机选取2~5个视野照相记录。使用ImageJ软件计数每个视野中染色的细胞。

CBX8稳定敲低细胞株与对照细胞株抽提RNA后由北京安诺优达基因科技公司进行RNA转录组测序（RNA-seq）建库和测序。用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，加入片段化缓冲液（fragmentation buffer）将mRNA进行随机打断，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链；加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase Ⅰ合成第二条cDNA链；利用AMPure XP磁珠纯化双链cDNA，进行末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads进行片段大小选择，通过PCR富集得到cDNA文库。文库构建完成后，分别使用Qubit2.0荧光计和Agilent 2100生物分析仪对文库浓度和插入片段大小进行检测，使用qPCR对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。质检合格后，用NovaSeq 6000测序平台进行高通量测序，采用150 bp的双端测序读长。使用Trim Galore软件对测序结果中的接头和低质量读长进行过滤和清除，使用STAR软件把测序结果比对到人类hg38基因组。比对完成后用featureCount读取转录本的数目，并用edgeR软件包进行标准化，标准化方法为logCPM（counts per million reads）。使用Hiplot Pro平台（https：//hiplot.com.cn/）对应工具绘制转录差异基因热图，并进行基因本体论（Gene Ontology，GO）功能分析和京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。

用胰酶消化细胞后加入多聚甲醛至终浓度为1%，常温摇晃10 min进行交联，加入1/10体积的1.25 mol/L甘氨酸（约889 μL），常温摇晃10 min终止交联。以4 ℃的PBS重悬细胞后加入染色质免疫沉淀测序（ChIP）裂解液LB1（50 mmol/L Hepes、140 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、10%甘油、0.5% NP-40、0.25% Triton X-100）至10⁶个/mL的细胞密度，4 ℃旋转摇晃10 min，4 ℃、1 350×g离心5 min，弃去上清液。以1 mL ChIP裂解液LB2（10 mmol/L Tris、200 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L EGTA）裂解液重悬细胞，加入LB2至1.67×10⁷个/mL的细胞密度，常温旋转摇晃10 min，以4 ℃、1 350 ×g离心5 min，弃去上清液。用ChIP裂解液LB3（10 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L EGTA，0.1%脱氧胆酸钠，0.5%N-月桂酰肌氨酸钠，0.1% SDS）重悬细胞至2×10⁹个/mL的密度，超声破碎细胞，以4 ℃、16 000×g离心10 min，弃去沉淀保留上清液。在300 μL上清液中加入600 μL LB3及100 μL 10% Triton X-100，加入10% SDS至终浓度为0.1%。取950 μL样品用于ChIP，取50 μL作为无抗体处理的5% Input对照样本，分别置于新的离心管。向ChIP样本中加入2 μg抗体摇匀，4 ℃旋转摇晃12 h。取100 μL混匀的Protein G磁珠，以1 mL BSA封闭剂置于磁力架上洗涤3次，静置并弃去上清液后，加入约1 mL的抗体/染色质，于4 ℃孵育4 h。以高盐、低盐洗涤液和氯化锂洗涤液［250 mmol/L氯化锂、1% NP-40、1 mmol/L EDTA、10 mmol/L Tris·HCl（pH 8.0）、1%脱氧胆酸钠］洗涤珠子，加入洗脱液（50 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，1% SDS）于65 ℃金属浴上去交联5 h，以QIAquick Spin滤柱纯化DNA，加入样品离心后加入50 μL EB缓冲液（10 mmol/L Tris·HCl，pH 8.5），静置2 min后16 000×g离心1 min收集洗脱液。

染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）采用VAHTS Universal DNA文库纯化试剂盒进行建库，测序由安诺优达公司完成，测序平台为Illumina NovaSeq 6000，采用150 bp的双端测序读长。测序结果以Trimmomatic软件进行接头过滤，使用bowtie2软件进行人类基因组hg38比对。比对完成后使用MACS2软件对H3K27me3修饰富集的区间结果进行峰值获取（peak calling）。以deeptools软件的plotHeatmap和plotProfile命令进行热图和峰图绘制。

应用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）软件^［21］对RNA-seq结果进行基因富集分析和前沿分析（leading edge analysis），参考基因集数据选取自分子特征数据库（Molecular Signatures Database，MSigDB）^［22］。基因排名方式（metric for ranking genes）选择Diff_of_classes，其余选项为默认。代表性变化基因由软件根据基因排名选出。

采用Graphpad Prism 9.0软件对数据进行统计和分析。定量资料采用x ±s表示，采用配对t检验或者非配对t检验对数据进行统计学分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

为了确定表观调控复合体PRC1在肿瘤发生过程中的作用，首先利用cBioPortal数据库提供的可视化工具分析TCGA来源的290例前列腺腺癌患者样本（The Cancer Genome Atlas-Prostate adenocarcinoma，TCGA-PRAD）中PRC1复合物亚基CBX2、CBX4、CBX6、CBX7和CBX8的表达及其与癌症的相关性。结果显示，包括CBX8在内的所有CBX家族蛋白的mRNA水平在前列腺腺癌肿瘤样本中均存在表达升高与基因拷贝数扩增现象（图1），其中CBX8的基因变化率（alteration rate）为5%。

为进一步探究CBX8在前列腺癌细胞中的生物学作用，在人源前列腺癌细胞系DU145中利用shRNA方法建立了稳定敲低CBX8细胞株。Western blotting结果表明在CBX8敲低细胞株中基本检测不到CBX8蛋白表达（图2A）。选择shCBX8-1及shCBX8-4转染的细胞株进行后续试验。为了研究CBX8对前列腺癌细胞增殖的影响，利用shCT对照细胞和2种不同shCBX8处理的单克隆细胞株shCBX-1 #8和shCBX8-4 #5（分别代表1号shRNA处理的第8号单克隆细胞株和4号shRNA处理的第5支单克隆细胞株）进行CCK8细胞增殖实验。结果表明，敲低CBX8没有显著改变DU145细胞的增殖（P>0.05，图2B）。同时利用Transwell实验检测CBX8敲低对肿瘤细胞侵袭能力的影响。结果显示敲低CBX8可以明显促进DU145细胞的侵袭能力（P<0.05，图2C、D）。

为了研究CBX8调控前列腺癌的作用机制，利用RNA-seq探究敲低CBX8后DU145细胞基因表达谱的变化。敲低CBX8导致750个基因上调，951个基因下调（图3A）。火山图（volcano plot）显示了表达上调和下调最为明显的基因（图3B），其中上调最明显的基因为蛋白S100A6（protein S100A6）、肽基精氨酸脱亚胺酶Ⅲ型（protein-arginine deiminase type-3，PADI3）、tribble同源蛋白3（tribbles homolog 3，TRIB3）、支链氨基酸转氨酶1（branched-chain-amino-acid aminotransferase 1，BCAT1）、溶质载体家族1成员5（solute carrier family 1 member 5，SLC1A5）、溶质载体家族3成员2（solute carrier family 3 member 2，SLC3A2）；下调最明显的基因为信号转导和转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）、炭疽毒素受体1（anthrax toxin receptor 1，ANTXR1）、肌球蛋白IB（myosin IB，MYO1B）、schlafen家族成员11（schlafen family member 11，SLFN11）、亮氨酰和胱氨酰氨肽酶（leucyl and cystinyl aminopeptidase，LNPEP）和肝配蛋白A1（ephrin-A1，EFNA1）。值得注意的是，上调的支链氨基酸代谢相关酶BCAT1与肺癌、肝癌等肿瘤的转移高度相关^［23-24］，一定程度上暗示敲低CBX8导致的DU145细胞侵袭能力升高可能是BCAT1介导的。另一方面，GSEA分析显示，敲低CBX8后上调的基因富集了敲低PRC1复合体另一核心组分多梳蛋白家族RING指蛋白2（polycomb group RING finger protein 2，PCGF2，又称MEL18）上调的基因（图3C），如糖原磷酸化酶脑型（glycogen phosphorylase brain form，PYGB）、丛蛋白A1（plexin-A1，PLXNA1）等；同样地，敲低CBX8后下调的基因也富集了敲低多梳蛋白家族RING指蛋白4（polycomb group RING finger protein 4，PCGF4，又称BMI1）下调的基因（图3D），如BMI1、四跨膜蛋白1（tetraspanin-1，TSPAN1）等。以上结果表明作为PRC1亚基之一的CBX8，其影响基因转录的作用机制很大程度是依赖于PRC1复合体功能。

在获得RNA转录差异基因后，进一步利用GO功能分析和KEGG信号通路富集分析确定这些基因引起的细胞功能变化。结果显示，在DU145细胞中敲低CBX8提高了很多生物学过程（biological process，BP）中相关基因的表达，包括蛋白质翻译相关的氨基酸活化、转运RNA（transfer RNA，tRNA）氨酰化以及内源性凋亡信号通路；另一方面，CBX8敲低抑制了有丝分裂相关的DNA复制及核分裂过程（图4A）。在分子功能（molecular function，MF）层面，CBX8敲低上调了氨酰-tRNA连接酶活性和蛋白质异二聚化活性，而抑制了钙黏蛋白结合、ATP水解等作用的相关基因表达（图4B）。在细胞组分（cell component，CC）层面，上调基因主要富集于核糖体，下调基因多对应有丝分裂相关的染色质、染色体端粒区、纺锤体等，而细胞与基底连接、黏着斑相关基因存在明显的上调与下调（图4C）。KEGG信号通路分析同样显示，上调基因主要对应核糖体与氨酰-tRNA合成等，而下调基因主要对应细胞周期、磷脂酰肌醇3-激酶-RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）（图4D）；与KEGG分析结果类似，GSEA通路分析表明敲低CBX8后下调的基因主要富集在细胞周期通路（图4E）。值得注意的是，敲低CBX8后细胞与基底连接相关基因的表达发生较大变化，包括49个下调基因及45个上调基因，提示敲低CBX8影响细胞与基底连接，从而促进肿瘤侵袭（图4F）。

CBX8是表观调控复合体PRC1的重要组成部分，且RNA-seq的结果证明CBX8对基因转录的调控是通过PRC1复合体进行的（图3）。为了进一步探究CBX8敲低导致的表观修饰变化在肿瘤细胞侵袭中的作用，在CBX8敲低及shCT对照的DU145细胞中进行H3K27me3的ChIP-seq分析。结果显示，敲低CBX8后全基因组H3K27me3水平略有下降（图5B、C）。值得注意的是，鉴定出H3K27me3峰值信号出现明显下降的683个位点中，有97个位于敲低CBX8后上调的基因（图5A），进一步证实了RNA-seq的结果。尤其需要引起重视的是，在RNA-seq分析中鉴定出的受CBX8敲低影响、转录水平上调较强的支链氨基酸代谢关键酶BCAT1基因的转录起始位点区域，其H3K27me3修饰水平明显下降（图5D），提示CBX8/PRC1在该位点可能存在直接作用。在前列腺癌细胞中，CBX8/PRC1可能通过直接结合在肿瘤侵袭关键基因BCAT1的转录起始位点抑制其转录，从而破坏肿瘤细胞的转移过程。

本研究结果显示CBX8在前列腺腺癌中存在高表达和基因拷贝数扩增现象，敲低CBX8未影响前列腺癌细胞的增殖，但显著促进其侵袭能力，提示CBX8主要通过抑制前列腺癌细胞转移能力而发挥其功能。在食管鳞状细胞癌及结直肠癌中，CBX具有促进肿瘤细胞增殖但抑制其侵袭的能力^{［18， 25］}，与本研究中在前列腺癌细胞中发现的CBX8生物学功能类似。值得注意的是，在肝癌细胞中CBX8促进癌症细胞的增殖和转移^［11］，体现了CBX8在肝癌与其他癌症类型中功能的差异。这种现象体现了CBX8在肿瘤细胞生物学中功能的复杂性，也提示了CBX8的生物学功能有组织特异性。

本文的RNA-seq结果为揭示CBX8的作用机制提供了关键线索。基因富集分析提示敲低CBX8使PRC1复合体的抑制性功能受到影响，其直接作用的下游靶基因表达可能因此去抑制且已激活转录，比如BCAT1；其所翻译蛋白功能与氨基酸代谢相关，在肺癌及肝癌中均有报道可促进肿瘤细胞的迁移与转移^［23］。BCAT1在CBX8敲低后基因转录上调明显，且其转录起始位点H3K27me3修饰明显下降，结合CBX8敲低后基因转录变化符合PRC1复合体功能下调的结果，提示含CBX8的PRC1复合体可能在该位点存在定位并抑制BCAT1转录，进而对前列腺癌的支链氨基酸代谢重编程介导的转移过程发挥重要调控功能。近年有研究^［23］发现BCAT1可以通过降低α-酮戊二酸进而促进SRY盒转录因子2（SRY-box transcription factor 2，SOX2）表达，介导肺癌细胞获得干性并促进转移。为了确认相似的CBX8-BCAT1-SOX2调节轴是否在前列腺癌细胞的转移中发挥同样功能，还需要在未来的工作中进一步阐明前列腺癌细胞中CBX8与下游可能的调节靶点的关系。敲低CBX8的DU145细胞中有丝分裂、细胞黏附相关基因表达下调。一系列研究显示，下调最明显的基因中TRIB3在T细胞中可以抑制STAT1^［26］，而抑制STAT1表达可以抑制前列腺癌细胞的增殖并促进其凋亡^［27］，提高前列腺癌细胞的迁移能力^［28］；在非小细胞肺癌中，抑制STAT1表达可促进细胞的迁移能力^［29］。有研究发现，在人脐静脉内皮细胞中，S100A6可以抑制STAT1，从而抑制细胞的增殖^［30］；在肺癌细胞中，S100A6可以抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力^［31］。本研究发现敲低CBX8可以造成前列腺癌细胞侵袭能力明显上升，转录组分析发现敲低CBX8后前列腺癌细胞的细胞周期通路基因下调，细胞底物-连接通路基因表达失调，钙粘黏蛋白结合通路基因表达下调，因此前列腺癌中可能存在CBX8抑制性调控通路，由CBX8抑制TRIB3或S100A6进而促进STAT1表达，最终抑制肿瘤细胞的侵袭能力。

CBX8作为PRC1抑制性复合体的关键亚基，其作用机制复杂。多梳蛋白抑制复合物PRC1和PRC2存在互相调控机制，二者均会在翻译后修饰组蛋白。PRC1在Lys119位点单泛素化组蛋白H2A（H2Ak119ub1），而PRC2在Lys27位点单甲基化、二甲基化和三甲基化组蛋白H3（H3K27me1/2/3）；经典PRC1复合体可通过H2AK119ub1泛素修饰能力促进PRC2复合体的招募，进而巩固H3K27me3修饰^［32］。而且，PRC1和PRC2倾向于在基因组中的相同位点空间聚集以形成Polycomb染色质域，发挥抑制转录的作用。在敲低CBX8后，PRC2催化的H3K27me3可能因PRC1定位先一步产生变化而受到干扰；PRC2催化的H3K27甲基化分布较广且H3K27me3可以被CBX家族其他蛋白成员识别并结合，推测这是敲低CBX8后部分上调基因与下调H3K27me3信号产生交集的原因。虽然PRC1复合体作为表观遗传调控因子其直接作用的靶基因存在广泛的下游影响，但近年来有观点认为PRC1-CBX8也可正向调控基因的表达。研究显示在肿瘤细胞中CBX8具有正向调控转录因子Snail^［18］或上皮间质转化过程关键蛋白β-catenin^［12］的表达的作用。在胚胎干细胞和肿瘤中存在二价染色质（bivalent chromatin）区域，这些区域存在于启动子与暂停状态的增强子（poised enhancer）上，可同时存在转录活性标志组蛋白H3第四位赖氨酸三甲基化（H3K4me3）修饰和转录抑制标志H3K27me3修饰。有观点认为这种二价染色质修饰状态可以在细胞谱系分化中暂停重要调控基因的转录，并在之后能去抑制从而激活^［33］。有报道称在黑色素瘤中这种二价染色质状态也存在于调控上皮间质转化的转录因子基因上^［34］；CHAN等^［35］则发现，PRC1在正常乳腺上皮细胞与乳腺癌细胞中会定位在这种二价的超级增强子区域，并同时正向/负向调控其靶基因的表达。研究^［36］发现，在小鼠上皮细胞和乳腺癌细胞中，CBX8与可以催化H3K4me3修饰的混合谱系白血病（mixed lineage leukemia，MLL）甲基转移酶复合体中的亚基WDR5结合，并结合在基因组H3K4me3修饰区域，促进基因的转录。有研究^［17］发现在化学治疗耐药的结肠癌组织中，CBX8可以通过招募H3K4me3的甲基转移酶KMT2B蛋白至LGR5启动子区域，促进LGR5的转录。本研究发现敲低CBX8后存在基因的转录上调与下调，尤其在细胞与基底组织连接通路存在明显的基因转录上调与下调变化，因此在前列腺癌中CBX8是否可以直接调控特定基因的转录，是否存在与相关转录共调控因子（复合物）间的协同调控，以及是否和组蛋白修饰间具有相关性，有待进一步探讨。

综上所述，本研究发现CBX8在前列腺癌中存在高表达，并且在前列腺癌细胞中存在抑制肿瘤侵袭能力的作用；通过转录组分析与表观遗传组分析，发现CBX8可通过其PRC1复合体相关功能影响包括BCAT1在内的靶基因启动子区域H3K27me3修饰水平，进而调控其靶基因的转录；这些靶基因具有包括调控细胞与基底连接等细胞组分在内的多种功能。近年来针对CBX家族蛋白开发组蛋白甲基化识别结构域抑制剂的研究较多。本研究表明CBX8具有抑制前列腺癌细胞侵袭的作用，提示在治疗前列腺癌选择抑制剂时应关注CBX8的功能；注意提高针对不同CBX蛋白抑制剂的选择特异性，避免针对其他CBX蛋白的抑制剂脱靶作用于CBX8而导致前列腺癌转移。本研究为前列腺癌的小分子药物开发提供了参考。