婴幼儿时期，人类大脑快速发育，对作用于神经系统的药物特别敏感。由于全身麻醉药物可以通过血脑屏障直接作用于脑，因此全身麻醉药物对发育脑的影响是值得重点关注的公共卫生问题之一。七氟烷是目前临床上婴幼儿患者最常用的吸入全身麻醉药物。梅奥儿童麻醉安全性研究（Mayo Anesthesia Safety in Kids，MASK）提出多次接触全身麻醉会影响儿童的精细运动能力，且在二次分析后提出部分儿童对多次接触的麻醉药物更为敏感^［1］。2020年的一项研究^［2］对13 433名儿童进行详细的神经发育评估。该研究涵盖了46项不同的神经发育指标，结果显示，频繁接触七氟烷的儿童在运动功能、手部灵活性以及社交能力方面的表现普遍较差。动物研究发现出生早期长时间接受七氟烷麻醉或暴露于高浓度的七氟烷会导致发育脑的神经毒性，例如焦虑相关行为^［3-4］，并增加成年期认知功能障碍的可能性^［5］。这些发现表明七氟烷麻醉对神经发育具有潜在风险^［6］。基础研究更多地关注了七氟烷对神经元的影响，例如七氟烷暴露可诱导神经元凋亡、破坏突触可塑性并损害认知功能^［7-11］，而非神经元细胞在中枢神经系统中也起到了举足轻重的作用。

我们在前期研究中发现多次七氟烷麻醉能降低幼年小鼠嗅球髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）的表达量^［12］，且在原代少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cell，OPC）的体外实验中也观察到了这一现象^［13］。在发育过程中，OPC分化为少突胶质细胞，继而构成髓鞘。MBP是构成中枢神经系统成熟髓鞘的主要蛋白，约占髓鞘总蛋白的30%^［14-15］，是髓鞘的主要骨架成分。成熟的髓鞘包绕神经元轴突行使其生物学功能。研究^［16-17］发现出生第2日接触高浓度（4.9%）七氟烷会干扰幼年大鼠少突胶质细胞的增殖能力并影响髓鞘形成，且这一损伤可能是通过引发凋亡和氧化应激实现的。另有研究^［18］发现，多次七氟烷麻醉能造成幼年小鼠OPC、少突胶质细胞和髓鞘标志物的表达普遍降低，提示七氟烷对OPC、少突胶质细胞以及成熟髓鞘的广泛毒性。此外，在晚期胚胎时期接受2%七氟烷6 h全身麻醉也能抑制小鼠子代远期髓鞘形成^［19］。以幼年猕猴为模型，大于5 h的七氟烷接触会引起少突胶质细胞凋亡^［4，20］。但是近期的研究^［21］提出，早期七氟烷暴露对OPC增殖和成熟具有双向影响：全身麻醉后胼胝体和海马的OPC增殖能力立即增强，总体少突胶质细胞数量不变，但是成熟少突胶质细胞减少。单细胞测序结果也发现，七氟烷增加了雌性小鼠海马中少突胶质细胞系的丰富度^［22］。以上均提示发育脑的少突胶质细胞系对七氟烷存在动态应对。然而，七氟烷对少突胶质细胞系和髓鞘产生影响的具体环节依旧未知。

在前期的机制探索中我们发现，多次七氟烷麻醉可以通过抑制前额叶皮质YTH N⁶-甲基腺苷RNA结合蛋白1（YTH N⁶-methyladenosine RNA binding protein F1，YTHDF1）的表达影响小鼠精细运动能力^［23］。N⁶-腺苷酸甲基化（N⁶-methyladenosine，m⁶A）是mRNA表观修饰中最丰富的一种。YTHDF1是一种m⁶A识别蛋白，通过直接读取mRNA上的甲基化信号，促进靶基因RNA翻译，从而改变细胞特征，最终影响神经系统生物学功能。现有研究^［24］提示，YTHDF1对突触、轴突功能有保护作用，而轴突功能的实现和包绕它的髓鞘也紧密相关，因此YTHDF1在少突胶质细胞系以及髓鞘中的作用仍有待揭示。

越来越多的研究开始关注七氟烷诱导的髓鞘发育毒性。本研究提取大鼠原代OPC进行体外增殖分化培养，旨在观察多次七氟烷处理对少突胶质细胞成髓鞘能力的影响，并进一步探讨七氟烷具体影响了OPC发育为成熟髓鞘过程中的哪一作用环节。通过这一研究，以期更深入地了解麻醉药物对髓鞘发育的影响，为之后研究七氟烷诱导的OPC增殖、分化、凋亡改变等所涉及的信号通路提供方向，并为探索减轻多次七氟烷麻醉所致的髓鞘发育损伤提供潜在靶点。

出生当日（postnatal day 0，P0）的SD大鼠（性别不限），无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级，由浙江维通利华实验动物技术有限公司提供。实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2024-0001。动物实验于上海交通大学医学院附属第九人民医院中心实验室进行。实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2020-0025。

正置荧光显微镜（Nikon，日本），生物安全柜、CO₂培养箱（Thermo Fisher Scientific，美国），电泳槽、稳压电泳仪（Bio-Rad，美国），超灵敏多功能成像仪（GE HealthCare，美国），多功能酶标仪（BioTek，美国）。

Neurobasal培养基、DMEM培养基、胎牛血清、B27无血清补充剂、F-12培养基、N-2添加剂、胰酶（Gibco，美国），苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）（上海赛酷生物科技有限公司），RIPA裂解液、抗体稀释液（新赛美生物科技有限公司），多聚赖氨酸（poly-L-lysine，PLL）、髓鞘关联糖蛋白（myelin associated glycoprotein，MAG）小鼠单克隆抗体、5-溴脱氧尿嘧啶（5-bromo-z-dcoxyuridine，BrdU）、血小板源性生长因子AA（platelet-derived growth factor AA，PDGFaa）、人碱性成纤维细胞生长因子（human basic fibroblast growth factor，hBFGF）（Sigma，美国），髓磷脂碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）大鼠单克隆抗体、BrdU大鼠单克隆抗体、Ki67（肿瘤增殖细胞核抗原）兔多克隆抗体、血小板源性生长因子受体A（PDGF receptor α，PDGFRα）兔单克隆抗体、Hoechst染料、山羊抗大鼠IgG H&L（Alexa Fluor^® 488）、山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor^® 488）、山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor^® 594）、山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor^® 488）（Abcam，英国），半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）兔多克隆抗体（Novus Biologicals，美国），DNA酶、封闭用驴血清（北京索莱宝科技有限公司），Cell Counting Kit 8（CCK8）细胞增殖毒性检测试剂盒［东仁化学科技（上海）有限公司］，青霉素-链霉素溶液（×100）（北京兰杰柯科技有限公司），预染蛋白分子量标准（Thermo Fisher Scientific，美国），SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（×5）、脱脂奶粉、Tween-20（上海碧云天生物技术有限公司），七氟烷（上海恒瑞医药有限公司），PAGE凝胶快速制备试剂盒、增强型化学发光检测试剂盒（上海雅酶生物医药科技有限公司），磷酸盐缓冲液、TBS缓冲液［生工生物工程（上海）股份有限公司］，YTHDF1兔多克隆抗体、β-actin小鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记亲和纯化山羊抗兔IgG（H+L）、HRP标记亲和纯化山羊抗小鼠IgG（H+L）、HRP标记亲和纯化山羊抗大鼠IgG（H+L）（武汉三鹰生物技术有限公司），慢病毒FUGW-UBI-YTHDF1-3×FLAG-2A-mCherry-WPRE［和元生物技术（上海）股份有限公司］。

将纯化的OPC分离并进行体外培养^［25］。提取P0大鼠的皮层组织，在解剖液中剪碎，加入胰酶和DNA酶放入37 °C、CO₂浓度为5%的培养箱消化25 min。终止消化后，800×g离心10 min。弃去上清液，加入新鲜完全培养基（DMEM+10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素溶液）重悬在PLL包被的培养瓶中。培养2周后，以每分钟200转的速度振荡15 h。将收集的细胞悬浮液静置在没有PLL的培养皿中50 min，小胶质细胞和星形胶质细胞附着到培养皿中，得到的细胞悬浮液即为纯化的OPC。

体外培养1、2、3 d，对OPC在添加2% B27的Neurobasal培养基中以3%七氟烷+100% O₂处理2 h；每次七氟烷处理结束后，更换新鲜的添加2% B27的Neurobasal培养基继续培养；体外培养4、5、6 d后，进行后续实验。

待OPC贴壁5~6 h后，更换为OPC基础培养基（DF-12+1∶50 B27+1∶100 N-2+1∶1 000 hBFGF+1∶1 000 PDGFaa+1∶100 青霉素-链霉素溶液）继续培养24 h，细胞密度在30%时按照感染复数（multiplicity of infection，MOI）=10加入慢病毒实现过表达YTHDF1。感染72 h后，倒置荧光显微镜观察感染效率；待感染效率达到80%，更换新鲜的添加2% B27的Neurobasal培养基。

分化培养5 d的OPC在室温下用4%多聚甲醛固定15 min。用PBS冲洗细胞3次，每次5 min。0.3% Triton X-100通透细胞10 min后，用PBS冲洗细胞3次，每次5 min。用添加10%驴血清的MBP抗体、Ki67抗体、MAG抗体（稀释度为1∶200）在4 °C孵育过夜。第2日用含有Hoechest（稀释度为1∶1 000）的荧光素-异硫氰酸盐结合二抗（稀释度为1∶1 000）在室温下孵育细胞1 h。用PBS冲洗细胞3次，每次5 min。使用正置荧光显微镜拍照。通过人工计数确定抗体阳性细胞的数量。对目标通道进行Hoechest归一化处理。

为了评估细胞的增殖速度，使用原代培养的纯化OPC进行BrdU结合实验。在分化培养4 d的培养基中加入BrdU（10 mmol/L），在培养箱中培养细胞16 h。弃去培养基后，用4%多聚甲醛固定细胞15 min。用PBS冲洗细胞3次，每次5 min。向细胞中加入2 mol/L盐酸处理15 min后，加入0.1 mol/L、pH值为8.5的硼酸钠处理15 min。细胞通透10 min后，用PBS冲洗细胞3次，每次5 min。用添加10%驴血清的BrdU一抗（稀释度为1∶200）在4 °C孵育过夜。第2日用含有Hoechest（稀释度为1∶1 000）的荧光素-异硫氰酸盐结合二抗（稀释度为1∶1 000）在室温下孵育细胞1 h。二抗孵育结束后，用PBS冲洗细胞3次，每次5 min。使用正置荧光显微镜拍照。通过人工计数确定抗体阳性细胞的数量。对目标通道进行Hoechest归一化处理。

使用细胞裂解液（RIPA+1∶100 PMSF）收集各组细胞的蛋白。使用12.5%浓度的分离胶进行蛋白电泳，将蛋白条带转移到PVDF膜上。转膜完成后，10%脱脂奶粉封闭膜上蛋白，MBP抗体、caspase-3抗体、YTHDF1抗体和β-actin抗体（稀释度均为1∶1 000）在4 °C下孵育过夜。第2日用TBST冲洗膜3次，每次5 min。使用HRP结合的IgG二抗（稀释度为1∶2 000）孵育1 h后使用增强化学发光显像。使用ImageJ软件进行定量分析。

以每孔1 000个细胞的密度将OPC接种于PLL包被的96孔板中，连续3 d用3%七氟烷处理2 h，每次处理后更换新鲜培养基。根据组别每孔加入10% CCK8试剂，在培养箱中培养1~2 h后，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。根据下述公式计算细胞存活率。细胞存活率=［（实验孔吸光度-空白孔吸光度）/（对照孔吸光度-空白孔吸光度）］×100%。

使用GraphPad Prism 10软件进行数据分析。定量资料采用x±s表示。使用t检验进行两组间比较，使用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行多组间比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。

将原代OPC接种到预先涂有PLL的孔板上，连续3 d七氟烷（3%七氟烷+100% O₂）处理，每日1次，每次2 h。为了验证七氟烷对OPC分化成熟的影响，通过免疫荧光染色法观察原代OPC的分化状态。结果显示，表达成熟髓鞘表面标志物MBP（P=0.030；图1A、B）和MAG（P=0.026；图1C、D）的细胞数目显著下降。Western blotting实验验证了免疫荧光染色结果，多次七氟烷处理显著下调原代少突胶质细胞中MBP的表达水平（P=0.001；图1E、F）。这一发现表明，七氟烷处理会对OPC的正常分化产生不利影响。

进一步观察七氟烷处理对原代OPC的影响，其中我们重点关注OPC增殖、凋亡的改变。分别对原代OPC进行了1、2和3次梯度七氟烷处理，每日1次，每次2 h。CCK8结果表明，七氟烷对OPC产生显著的细胞杀伤作用。随着七氟烷处理次数的增加，OPC的存活率下降（图2A）。虽然1次处理和2次处理、2次处理和3次处理之间的细胞存活率差异无统计学意义，但1次处理和3次处理之间细胞存活率的差异有统计学意义（P=0.020），提示七氟烷对OPC的杀伤作用可能存在累积效应（图2A）。

为了探究七氟烷处理对OPC的杀伤作用是否存在持续影响，随后的实验统一选取3次七氟烷进行处理，评估处理后第1、2、3日的OPC存活率。OPC存活率在各观察日间差异无统计学意义（图2B），提示七氟烷处理对OPC造成的损害是短期影响，但在之后的3 d中这种损害较为稳定，没有减轻也没有加重。上述结果中使用的体外模型也为相关基础研究提供了一个比较宽泛的时间窗。

此外，我们试图研究OPC的凋亡途径。Western blotting实验结果显示caspase-3蛋白表达增加（P=0.012；图2C、D），提示多次七氟烷处理能诱导OPC凋亡。

综上，我们深入研究七氟烷处理对OPC的细胞杀伤作用，证实了反复接触七氟烷会加剧细胞损伤，且损伤程度与暴露次数成正比。细胞凋亡途径可能参与介导这种杀伤作用。

为全面了解多次七氟烷处理对OPC增殖能力的影响，采用外源性BrdU标记和免疫荧光染色BrdU、Ki67来观察细胞增殖情况。体外实验结果发现多次七氟烷处理后，细胞的增殖能力呈现出显著增加趋势（P=0.008，P=0.007；图3A~D）。但是，在七氟烷处理组中，Hoechst染色阳性细胞的数量明显少于对照组。结合上述OPC细胞存活率实验（图2A、B）结果，研究结果提示多次七氟烷处理后，在整体细胞数目下降的情况下，存活细胞出现了增殖能力增加。

之前的研究成果揭示了YTHDF1能够减轻七氟烷对小鼠认知和精细运动发育的不利影响^［23］，在此基础上，我们试图探索YTHDF1在少突胶质细胞系中的作用。Western blotting实验结果提示，七氟烷处理后OPC中YTHDF1蛋白的表达明显减少（P=0.011；图4A、B）。

之后我们对OPC转染过表达YTHDF1的慢病毒。如前文所述^［23］，转染后第3日检测转染效率和过表达效率，其均达到80%。通过CCK8评估过表达YTHDF1对暴露于七氟烷的OPC的影响，结果表明过表达YTHDF1上调了多次七氟烷处理导致的OPC存活率下降（图4C）。

既往研究更多关注七氟烷对神经元的损伤，而本研究聚焦七氟烷对神经胶质细胞的影响，试图加深关于麻醉对发育脑影响的理解。本研究通过体外培养原代少突胶质细胞发现多次七氟烷处理阻碍原代OPC分化并诱导其凋亡；且随着七氟烷处理次数的增加，OPC的存活率下降，表明这种损伤存在累积效应。这一发现提示多次麻醉暴露对少突胶质细胞分化成髓鞘过程中的起始阶段存在损害。尽管我们观察到七氟烷的细胞杀伤作用，但有趣的是，多次七氟烷处理反而增强OPC增殖能力。此外，多次七氟烷处理下调了OPC中YTHDF1（RNA表观修饰中的关键参与者）的表达水平，而过表达YTHDF1可以部分修复七氟烷对OPC造成的损伤。这一发现提示，多次麻醉对髓鞘造成损害的机制可能与麻醉药物对RNA造成的表观修饰作用有关。该具体机制仍需要进一步研究。

七氟烷作用于发育期大脑时，可通过多种分子途径（JNK/c-JUN/AP-1、ERK1/2 MAPK等）引起抗凋亡因子（BCL-2、BCL-XL、MCL1）下调和促凋亡因子（BAX/BAK）上调，进而导致caspase-3的激活和神经细胞凋亡^［26-33］。本研究发现七氟烷暴露与OPC凋亡途径的激活有关，这一途径可能是导致七氟烷对OPC产生杀伤作用的机制之一，并最终介导了七氟烷对正常髓鞘发育过程的损伤。值得注意的是，七氟烷诱导OPC凋亡所涉及的信号通路尚未完全了解，仍需要进一步研究来阐明。

既往研究观点认为七氟烷抑制少突胶质细胞系的增殖能力，从而影响髓鞘功能^{［16，34］}。但也有观点提出七氟烷暴露并不改变各发育阶段的少突胶质细胞总体数量，而是减少成熟少突胶质细胞的比例，最终导致有功能的髓鞘减少^［21］。虽然现有研究就七氟烷对少突胶质细胞分化成为成熟髓鞘这一过程的具体机制和影响环节仍有不同推论，但可达成一致的是：七氟烷暴露可引起髓鞘损伤。机制研究出现不同结论的原因有多种。首先，在这些研究中，七氟烷处理的时间点、次数和浓度等实验条件并不完全相同；其次，不同研究的目标脑区也存在差异，涵盖了海马、皮质等。另有研究^［35-36］探索了异氟烷等其他吸入麻醉药对髓鞘的影响。在本次体外实验中我们发现，多次七氟烷处理对整体OPC产生杀伤作用，但部分OPC表现出的增殖上调可能是一种代偿修复作用。具体来说，七氟烷引起了一部分OPC的直接损伤或死亡，为了弥补OPC总数的减少，神经系统也代偿性激活了另一部分OPC的增殖能力。尽管增殖能力的代偿性上调对于维持细胞数量具有一定的积极作用，但总体而言，七氟烷对OPC的主要作用仍是损伤性的，最终导致OPC的髓鞘形成能力下降。我们的结果提示，七氟烷对髓鞘发育的损伤作用可能不止体现在对OPC的增殖抑制上，也可能通过抑制细胞分化来实现，该结论尚需要进一步深入研究。

本研究也存在局限性。首先，尽管体外研究能够提供更为纯净的实验背景，但无法完全反映大脑的复杂情况。体外研究还可能放大了七氟烷对OPC的作用，例如放大了凋亡/死亡比例等。为避免该项局限性，后续研究将注重体内、体外研究结合以及OPC-少突胶质细胞与神经元、星形胶质细胞等其他神经细胞的相互作用。其次，本研究未检测OPC从开始发育到分化成为少突胶质细胞的全过程，因此无法准确评估七氟烷对髓鞘形成的具体影响环节。同时，七氟烷暴露后的OPC分化成的少突胶质细胞是否具有包绕神经元的能力也需要进一步研究。最后，尽管结合课题组的前期研究基础和本次研究结果，揭示出m⁶A修饰以及YTHDF1在七氟烷引起的髓鞘发育障碍中的关键作用，但七氟烷通过调控RNA表观修饰水平影响髓鞘功能的具体靶点仍需要通过进一步的探索来阐明。综上，未来的研究需要继续深入探讨七氟烷对OPC分化成髓鞘的具体作用环节、七氟烷的RNA表观修饰靶点、RNA表观修饰和髓鞘发育损伤间的关系等方面，从而更全面地理解七氟烷对幼年大脑髓鞘发育损伤的机制，寻找更有效的防治髓鞘损伤的干预策略。