经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）作为急性ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI）的首选治疗策略，可显著降低患者的急性期死亡率^［1-2］。然而，再灌注治疗后心力衰竭的发生率依然不容忽视。流行病学调查^［3-4］显示，STEMI患者接受PCI治疗后5年内，心力衰竭的发生率高达31.3%。及时的PCI治疗虽能够有效恢复心外膜冠状动脉血流，但约57%的患者仍会发生微血管功能障碍，导致微循环灌注不足，进而出现无复流现象（no-reflow phenomenon），显著限制了再灌注治疗的临床效果^［5-6］。微血管功能障碍主要包括微血管阻塞（microvascular obstruction，MVO）和心肌内出血（intramyocardial hemorrhage，IMH）；其中，IMH已被证实是预测心血管不良事件的重要独立危险因素^［7-8］。研究^［9］表明，与未发生IMH的STEMI患者相比，发生IMH的患者往往具有更大的梗死面积和更广泛的MVO，并与不良心室重构及心功能障碍密切相关。因此，IMH在STEMI患者心肌缺血再灌注后心肌损伤和心室重构中的作用机制仍有待深入研究。

Basigin（BSG），又称CD147或细胞外基质金属蛋白酶诱导物（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN），是免疫球蛋白超家族成员，属于细胞表面跨膜糖蛋白^［10］。作为一种广泛表达于多种细胞类型的跨膜蛋白，BSG不仅在生理条件下参与细胞间相互作用、信号转导等过程，还在多种病理过程中发挥重要作用。BSG在心血管疾病中的作用已被广泛研究；研究^［11-14］证实，BSG参与动脉粥样硬化和心肌炎等疾病的发病机制。在心肌缺血再灌注损伤中，BSG的表达水平和功能也受到关注。有研究^［15］表明，BSG在心肌缺血再灌注过程中表达上调，并可能通过促炎症反应、细胞凋亡等途径加重组织损伤。然而，目前关于BSG在IMH发生后，血红蛋白（hemoglobin，Hb）介导的心肌细胞损伤中的潜在作用及调控机制尚未明确阐述。基于此，本研究旨在探讨BSG在Hb诱导的心肌细胞损伤中的调控机制。

碘化丙啶（propidium iodide，PI）、Hb（美国Sigma-Aldrich），WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、转染试剂Lipofectamine 8000、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂（上海碧云天），TRIzol试剂（日本TaKaRa），BSG抗体（英国Abcam，货号ab188190），β-肌动蛋白（β-actin）抗体（美国Cell Signaling Technology，货号#4970），培养细胞总蛋白抽提试剂（武汉博士德生物），BCA试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、青霉素-链霉素（penicillin-streptomycin，P/S）、DMEM高糖培养基（上海欲立生物），坏死性凋亡抑制剂（necrostatin-1，Nec-1）、自噬抑制剂（3-methyladenine，3-MA）、铁死亡抑制剂（ferrostatin-1，Fer-1）、焦亡抑制剂（VX-765）（中国Selleck），Opti-MEM培养基（美国Gibco），反转录试剂盒、SYBR Green Ⅰ qPCR Master Mix（南京诺唯赞），辣根过氧化物酶标记二抗（美国Jackson ImmunoResearch Laboratories），ECL化学发光液（上海圣尔生物）。

三气孵育箱、多功能酶标仪、NanoDrop2000微量分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific），LSRFortessa X-20流式细胞分析仪（美国BD），T100 PCR仪（美国Bio-Rad），LightCycler^® 480 Ⅱ实时荧光定量PCR仪（瑞士Roche）。

将实验室保存的大鼠心肌细胞系H9c2，接种于含10% FBS和1×P/S溶液的DMEM高糖培养基中，置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中进行常规培养。随后，将H9c2心肌细胞接种于6孔板或96孔板，待细胞稳定贴壁后，分别加入Hb（浓度分别为0、7.5、15.0、30.0 μmol/L），处理24 h。为进一步模拟体内心肌缺血再灌注的微环境，将细胞转移至三气培养箱（1% O₂、5% CO₂、94% N₂）进行缺氧处理6 h后复氧，之后给予Hb（浓度分别为0、2.5、5.0、7.5 μmol/L），处理24 h。此外，为探究Hb促进心肌细胞损伤的具体机制，本研究采用多种细胞死亡特异性抑制剂进行干预，包括Nec-1（20 μmol/L）、3-MA（1 mmol/L）、Fer-1（2 μmol/L）和VX-765（20 μmol/L）。细胞经不同抑制剂预处理24 h后，加入Hb（15.0 μmol/L）继续培养24 h，处理结束后收集细胞，用于后续实验分析。

将H9c2细胞以约5×10⁴个/孔的密度接种于6孔板中，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中常规培养。待细胞汇合度达到60%~70%时，用Lipofectamine 8000进行si-Bsg或si-NC的转染并孵育6 h后换液。转染后培养48 h，收集细胞进行后续相应的实验。siRNA序列见表1。

将H9c2心肌细胞以约5×10³个/孔的密度接种于96孔板，待细胞贴壁后，根据实验分组进行相应处理。之后，每孔加入10 μL WST-1试剂，避免产生气泡，轻轻混匀。将96孔板置于37 ℃、5% CO₂培养箱中孵育2 h。使用酶标仪测定波长450 nm处的吸光度值。

收集各处理组细胞，经预冷PBS洗涤后，以110×g离心5 min，弃去上清液。用500 μL PBS重悬细胞并加入5 μL PI染色液，轻柔混匀，室温避光孵育30 min。PBS清洗细胞2次后弃去上清液，最后用100 μL PBS重悬细胞。采用流式细胞仪上机检测，使用FlowJo软件10.8.1分析PI阳性细胞比例，评估细胞死亡率。

采用TRIzol法，提取H9c2心肌细胞RNA；通过反转录获得cDNA。以cDNA为模板，行实时荧光定量PCR。反应体系（10 μL）：双蒸水3.6 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.2 μL，SYBR Green Ⅰ qPCR Master Mix 5 μL。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，72 ℃ 30 s，共40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列详见表2。以β-actin为内参，采用2^-ΔΔCT法计算目标基因的相对水平。

收集各实验组细胞样品后，加入预先添加磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的培养细胞总蛋白提取剂，冰上裂解30 min后12 000×g离心15 min收集上清液。采用BCA蛋白质测定试剂盒进行蛋白质浓度定量。采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离总蛋白，并转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜。转膜后，PVDF膜于室温下用含5%脱脂奶粉的TBST封闭液封闭1 h；随后置于4 ℃摇床上进行一抗孵育过夜［BSG抗体（1∶1 000）、β-actin抗体（1∶1 000）］。次日回收一抗，使用TBST清洗膜5 min，3次。加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶10 000），室温孵育1 h。TBST洗涤3次后，使用ECL进行显影，并用Image Lab 1.54软件对条带灰度值进行半定量分析，以β-actin作为内参校正，计算目标蛋白的相对表达量。

采用GraphPad Prism 8.3.0软件进行统计学分析。定量资料以x±s_x 表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

为了探究Hb对心肌细胞的影响，我们分别给予H9c2心肌细胞不同浓度的Hb（0、7.5、15.0、30.0 μmol/L），培养24 h。与对照组（0 μmol/L）相比，随着Hb浓度增加，H9c2心肌细胞死亡率呈剂量依赖性升高（图1A、B）。此外，WST-1细胞活性检测结果（图1C）显示，Hb浓度越高，心肌细胞活性越低，该结果与流式细胞术检测的细胞死亡率结果一致。

为进一步模拟缺血再灌注后心肌局部微环境，我们对H9c2心肌细胞进行缺氧/复氧处理，并同时加入不同低浓度水平的Hb（0、2.5、5.0、7.5 μmol/L）处理（图2）。PI染色后流式细胞术检测结果显示，在常氧及缺氧/复氧条件下，Hb处理均可剂量依赖性地诱导H9c2细胞死亡。WST-1细胞活性检测得到了同样的结果，Hb处理可剂量依赖性地降低H9c2心肌细胞活性。

为了探究Hb诱导心肌细胞损伤的作用机制，我们采用多种细胞死亡特异性抑制剂进行干预。细胞活性检测结果（图3A）显示，与单纯Hb处理组相比，Fer-1和VX-765均可部分挽救Hb诱导的心肌细胞死亡，其中Fer-1的保护作用最为显著（P<0.001）。此外，PI染色结果（图3B、C）显示，与单纯Hb处理组相比，Fer-1可显著降低心肌细胞死亡率（P<0.001）。上述结果提示，Hb可能通过激活铁死亡途径诱导H9c2心肌细胞损伤。

为探讨BSG在Hb诱导心肌细胞损伤中的潜在作用，我们采用15.0 μmol/L Hb处理H9c2心肌细胞24 h后检测BSG表达水平的变化。实时荧光定量PCR和Western blotting结果（图4）均显示，与对照组相比，Hb处理组H9c2心肌细胞中Bsg的mRNA和蛋白表达水平均显著上调（均P<0.001）。

为进一步验证BSG在Hb诱导心肌细胞损伤中的调控作用，我们通过转染siRNA敲低H9c2心肌细胞中Bsg的表达。实时荧光定量PCR和Western blotting结果（图5A、B）显示，si-Bsg可显著降低H9c2心肌细胞中Bsg的mRNA和蛋白表达水平（均P<0.001）。流式细胞术及WST-1检测结果（图5C~E）显示，与对照组相比，敲低Bsg可显著减少Hb引起的心肌细胞死亡，提高细胞活力（均P<0.05）。此外，敲低Bsg可显著降低Hb处理组H9c2心肌细胞中铁死亡分子标志物Ptgs2 mRNA的表达水平（图5F，P<0.001）。因此，上述结果提示敲低Bsg基因可通过抑制铁死亡途径减轻Hb诱导的H9c2心肌细胞损伤。

IMH是STEMI患者行PCI术后常见的并发症之一。临床研究^［16］显示，在接受PCI治疗的STEMI患者中，IMH的发生率可高达39%，且与心室重构、心功能障碍及主要不良心血管事件的发生呈显著相关性。IMH的病理特征主要表现为：心肌缺血再灌注后，由于微血管结构和功能受损，红细胞外渗至心肌间质。IMH不仅反映了微血管损伤的严重程度，更被证实是一种独立的危险因素，能加剧心肌细胞损伤并促进心脏不良重构^［5，17］。基于此，本研究旨在深入探讨IMH发生后，其核心病理介质——Hb对心肌细胞的直接毒性作用及其介导的分子机制。我们通过体外实验，给予H9c2心肌细胞系不同浓度Hb处理，以模拟IMH发生后心肌细胞直接暴露于Hb的病理微环境。我们的研究表明，无论在常氧还是缺氧/复氧条件下，Hb均能促进H9c2心肌细胞损伤和死亡，且这种损伤效应呈现明显的浓度依赖性，明确证实了Hb对心肌细胞具有直接毒性作用。

IMH发生后，大量外渗的红细胞溶解释放Hb，后者进一步降解为血红素和游离铁离子，导致局部区域铁离子过载^［18-19］。IMH可通过铁离子沉积介导的细胞毒性、氧化应激增强和炎症反应加剧等多种途径，进一步加重心肌损伤^［20-21］。研究^［5，22］表明，大多数接受PCI治疗后发生IMH的STEMI患者，其心肌残余铁沉积与左室不良重构密切相关。鉴于铁离子在IMH病理过程中的重要作用，我们关注到铁死亡这一机制。铁死亡是一种以铁依赖性和脂质过氧化为特征的程序性细胞死亡方式，铁稳态失衡是其发生的重要前提^［23］。近年来的研究^［24-25］已证实铁死亡在多种心血管疾病的病理生理过程中发挥关键作用。在本研究中，我们发现通过不同细胞死亡方式抑制剂处理后，焦亡抑制剂（VX-765）和铁死亡抑制剂（Fer-1）均可减轻Hb引起的心肌细胞损伤和死亡，其中Fer-1表现出更显著的保护效果。此外，既往研究^［26］也指出，采用铁离子螯合剂治疗能够减轻IMH后心肌铁沉积，并缓解心肌梗死后慢性不良重构，这与我们的研究结果相一致。综合上述结果，我们发现Hb可能主要通过促进心肌细胞铁死亡导致其损伤。

BSG是一种广泛表达于细胞表面的跨膜糖蛋白，在细胞增殖、迁移、分化及炎症反应等多种生理和病理过程中发挥关键调控作用^［27-28］。先前研究^［29］表明，在脑出血后，脑内皮细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞及巨噬细胞中BSG的表达水平显著升高，且BSG作为基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的诱导物，能够增加MMP-9的表达及活性，从而加剧脑组织损害。在本研究中，我们观察到Hb处理后H9c2心肌细胞中的BSG表达水平同样显著升高；进一步研究发现，敲低H9c2心肌细胞中的Bsg表达后，Hb诱导的细胞死亡明显减少，且铁死亡关键标志物Ptgs2的mRNA表达水平也显著降低。因此，我们的结果表明，BSG可能作为关键调控因子参与Hb诱导的心肌细胞铁死亡过程；这为IMH的临床治疗提供了新的潜在靶点。

BSG的膜定位特性使其成为药物靶向的理想候选分子。在肿瘤、炎症等疾病的治疗中，靶向BSG的特异性抗体已经展现出良好的治疗前景。例如，抗BSG单克隆抗体美妥昔单抗（metuximab）在重症新型冠状病毒感染的临床研究中可显著降低患者死亡率，改善临床预后，且安全性良好^［30］。另一种单克隆抗体6E7F1通过特异性结合BSG的Ig2域，抑制其配体单羧酸转运蛋白1（monocarboxylate transporter 1，MCT1）和MCT4的活性，减少细胞乳酸转运，从而发挥抗肿瘤作用^［31］。此外，BSG小分子抑制剂AC-73能够抑制T细胞活化和免疫细胞浸润，在病毒性心肌炎小鼠模型中可显著减轻心脏炎症和病理损伤^［32］。值得关注的是，雷公藤甲素作为从雷公藤中提取的活性成分，不仅能够降低BSG的表达^［33］，还可通过调控STAT3/P53信号通路保护线粒体功能并抑制铁死亡^［34］；这与本研究发现的BSG介导铁死亡机制具有潜在关联。在心血管领域，尽管目前尚无公认的靶向BSG特异性药物，但该类药物在其他疾病中的研究进展，为IMH等心血管疾病治疗提供了重要的验证方向及转化思路。基于本研究的发现，未来可进一步评估现有BSG调节剂在防治IMH相关心肌损伤中的治疗潜力，以期为临床干预策略提供新的思路。

本研究为探索BSG在IMH相关心肌损伤中的作用提供了新的视角。然而，我们也认识到本研究存在一定的局限性。首先，本研究主要采用体外H9c2心肌细胞系结合Hb处理，旨在模拟IMH发生后心肌细胞所处的病理微环境。尽管此模型能够有效阐明Hb对心肌细胞的直接毒性作用及其介导的分子机制，但其无法完全模拟体内IMH的完整病理生理过程。其次，本研究虽揭示了BSG在Hb诱导的铁死亡中发挥调控作用，但BSG在体内IMH发生发展中的确切功能及具体机制，仍有待进一步深入探索。针对以上本研究的局限性，未来研究将致力于构建在体IMH动物模型，在整体水平上验证BSG在IMH发生发展中的确切作用及具体机制，并进一步评估靶向BSG在IMH防治中的潜在临床价值，从而为IMH相关心肌损伤的有效干预提供更坚实的理论和实验依据。

综上所述，本研究揭示了Hb作为IMH的核心介质，通过上调BSG表达诱导心肌细胞铁死亡，而抑制BSG表达能够有效抑制这一效应发生，减轻Hb引起的心肌细胞损伤。因此，BSG可作为潜在治疗靶点，为IMH相关心肌损伤的防治提供新的方向。