上海交通大学学报（医学版）

上海交通大学学报(医学版), 2025, 45(4): 415-425 doi: 10.3969/j.issn.1674-8115.2025.04.003

论著 · 基础研究

利拉鲁肽改善非酒精性脂肪性肝病小鼠肝纤维化的作用及其机制

王仁杰1, 祝超瑜2, 方云云2, 肖元元2, 王倩倩2, 宋雯婧2, 魏丽,2

1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306

2.上海交通大学医学院附属第六人民医院内分泌代谢科，上海 200233

Effects and mechanisms of liraglutide in ameliorating liver fibrosis in NAFLD mice

WANG Renjie1, ZHU Chaoyu2, FANG Yunyun2, XIAO Yuanyuan2, WANG Qianqian2, SONG Wenjing2, WEI Li,2

1.College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China

2.Department of Endocrinology and Metabolism, Shanghai Sixth People´s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200233, China

通讯作者: 魏 丽，主任医师，博士；电子信箱：18930173636@189.cn。

编委: 包玲

收稿日期: 2024-10-30   接受日期: 2024-12-20   网络出版日期: 2025-04-28

基金资助: 上海市自然科学基金.  20ZR1442500

Corresponding authors: WEI Li, E-mail:18930173636@189.cn.

Received: 2024-10-30   Accepted: 2024-12-20   Online: 2025-04-28

作者简介 About authors

王仁杰（1995—），男，硕士；电子信箱：18166332355@189.cn。 。

摘要

目的·探讨利拉鲁肽对非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）小鼠肝纤维化的作用及其机制。方法·将20只8周龄C57BL/6J小鼠随机分为正常饮食组（Chow组）及甲硫氨酸-胆碱缺乏（methionine-choline deficient，MCD）饮食喂养组（MCD组），每组10只。采用MCD饮食诱导构建NAFLD小鼠。将2组小鼠随机分为4个亚组，分别为Chow＋生理盐水组、Chow＋利拉鲁肽组、MCD＋生理盐水组、MCD＋利拉鲁肽组。每日分别腹腔注射利拉鲁肽（400 μg/kg）或同体积生理盐水4周后，行腹腔注射葡萄糖耐量实验（intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT）。测定小鼠血清天冬氨酸转氨酶（aspartate transaminase，AST）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TAG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平。小鼠处死后取其肝组织测定TAG含量，对肝组织行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色、油红O染色及马松（Masson）染色观察肝脏病理结构、脂质沉积和纤维化程度。采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qPCR）与Western blotting检测肝组织α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、纤连蛋白（fibronectin，FN）、Ⅰ型胶原蛋白α（collagen type Ⅰ α，COL1A）、基质金属蛋白酶9（matrix metallo protein 9，MMP9）、金属蛋白酶组织抑制因子1（tissue inhibitor of metal protease 1，TIMP1）和转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）表达水平，检测Sma和Mad相关蛋白3（Sma- and Mad-related protein 3，SMAD3）及磷酸化SMAD3（SMAD3 phosphorylation，pSMAD3）蛋白表达水平。结果·利拉鲁肽干预后，IPGTT显示小鼠血糖在第15、30、60 min时均有所下降，受试者操作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC曲线）的曲线下面积（area under the curve，AUC）降低（均P<0.05）。血清生化检测结果显示，利拉鲁肽干预后，MCD组小鼠AST与ALT水平降低（均P<0.001），TC、HDL-C水平升高（均P<0.05），TAG、LDL-C无明显变化。HE染色与油红O染色显示，利拉鲁肽干预后，肝细胞脂滴数量明显减少，气球样变性和炎症浸润程度减轻。Masson染色显示，利拉鲁肽干预后，MCD组小鼠肝脏蓝色胶原纤维数量明显减少。qPCR与Western blotting检测显示，MCD组小鼠肝脏α-SMA、FN、COL1A、TIMP1、TGF-β、pSMAD3/SMAD3表达明显上调，MMP9蛋白表达下降；经利拉鲁肽干预后，MCD组小鼠肝脏α-SMA、FN、COL1A、TIMP1、TGF-β、pSMAD3/SMAD3表达明显降低，MMP9表达上升。结论·利拉鲁肽能缓解NAFLD小鼠肝损伤、肝脏脂质沉积及纤维化程度，并通过调控TGF-β/SMAD3通路和纤维化相关蛋白表达改善小鼠肝功能和肝纤维化。

关键词： 利拉鲁肽 ; 转化生长因子β ; Sma和Mad相关蛋白3 ; 非酒精性脂肪性肝病 ; 肝纤维化

Abstract

Objective ·To investigate the effects of liraglutide on liver fibrosis in mice with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and the underlying mechanisms. Methods ·Twenty 8-week-old C57BL/6J mice were randomly divided into a normal chow diet group (Chow group) and a methionine-choline-deficient (MCD) diet group (MCD group), with 10 mice per group. The MCD diet was used to induce NAFLD. Each group was further divided into two subgroups, resulting in four subgroups: Chow+saline, Chow+liraglutide, MCD+saline, and MCD+liraglutide group. After daily intraperitoneal injection of liraglutide (400 μg/kg) or an equivalent volume of saline for 4 weeks, an intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) was performed. Serum levels of aspartate transaminase (AST), alanine aminotransferase (ALT), total cholesterol (TC), triglyceride (TAG), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) were measured. Liver tissues were collected post-euthanasia to assess TAG content. Histopathological changes, lipid deposition, and fibrosis were evaluated via hematoxylin-eosin (HE) staining, Oil Red O staining, and Masson staining. Real-time quantitative PCR (qPCR) and Western blotting were used to analyze the expression of α-smooth muscle actin (α-SMA), fibronectin (FN), collagen type Ⅰ α (COL1A), matrix metalloproteinase 9 (MMP9), tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP1), transforming growth factor β (TGF-β), SMAD3, and phosphorylated SMAD3 (pSMAD3). Results ·The IPGTT revealed that liraglutide intervention reduced blood glucose levels at 15, 30, and 60 min, with a decreased area under the curve (AUC) (both P<0.05). Biochemical analysis showed that liraglutide lowered AST and ALT levels (both P<0.001), increased TC and HDL-C levels (both P<0.05), but had no significant effect on TAG or LDL-C in MCD mice. HE staining and Oil Red O staining revealed reduced lipid droplets, ballooning degeneration, and inflammatory infiltration in hepatocytes after liraglutide treatment. Masson staining indicated decreased collagen fiber deposition in the liver. qPCR and Western blotting analysis demonstrated upregulated expression of α-SMA, FN, COL1A, TIMP1, TGF-β, and pSMAD3/SMAD3, alongside downregulated MMP9 in MCD mice. Liraglutide reversed these changes, lowering α-SMA, FN, COL1A, TIMP1, TGF-β, and pSMAD3/SMAD3 expression while increasing MMP9 expression. Conclusion ·Liraglutide ameliorates liver injury, lipid deposition, and fibrosis in NAFLD mice, through modulation of the TGF-β/SMAD3 pathway and regulating fibrosis-associated protein expression.

Keywords： liraglutide ; transforming growth factor-β (TGF-β) ; Sma- and Mad-related protein 3 (SMAD3) ; non-alcoholic fatty liver disease ; liver fibrosis

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王仁杰, 祝超瑜, 方云云, 肖元元, 王倩倩, 宋雯婧, 魏丽. 利拉鲁肽改善非酒精性脂肪性肝病小鼠肝纤维化的作用及其机制. 上海交通大学学报(医学版)[J], 2025, 45(4): 415-425 doi:10.3969/j.issn.1674-8115.2025.04.003

WANG Renjie, ZHU Chaoyu, FANG Yunyun, XIAO Yuanyuan, WANG Qianqian, SONG Wenjing, WEI Li. Effects and mechanisms of liraglutide in ameliorating liver fibrosis in NAFLD mice. Journal of Shanghai Jiao Tong University (Medical Science)[J], 2025, 45(4): 415-425 doi:10.3969/j.issn.1674-8115.2025.04.003

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的发病率逐渐升高，已成为我国第一大慢性肝病［1］。多重打击学说［2-3］认为NAFLD是环境、遗传和表观遗传、胰岛素抵抗、肠道菌群及肥胖等多种因素共同作用的结果，并且随着疾病的进展，NAFLD会逐渐发展为非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝纤维化、肝硬化、肝癌，最终导致肝功能衰竭。

肝纤维化是NAFLD进展过程中的重要病理特征，主要表现为肝脏内弥漫性细胞外基质（extracellular matrix，ECM）（特别是胶原）过度沉积与异常分布［4］。NAFLD和NASH患者全因病死率随肝纤维化进展而增高［5］。目前全球范围内只有一款药物rezdiffra（一种甲状腺激素受体激动剂）被批准用于治疗伴有中期至晚期肝纤维化的代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis，MASH）的成人患者，但最高缓解率仅为29.9%［6］。最新研究［7］发现，胰高血糖素受体（glucagon receptor，GCGR）/胰高糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）受体双重激动剂survodutide可显著减少MASH患者肝脏脂肪沉积并改善肝纤维化。然而，关于GLP-1改善肝纤维化的具体机制目前还不完全清楚，需要进一步探讨。

GLP-1是一种多肽类激素，主要由远端回肠、直肠和结肠的内分泌L细胞以及脑神经产生［8］。当前有多种GLP-1受体激动剂进入临床，如利拉鲁肽、度拉糖肽、司美格鲁肽、艾塞那肽等。目前利拉鲁肽主要被用于治疗2型糖尿病［9］。动物实验发现，利拉鲁肽具有降低肝脏脂毒性、炎症反应以及改善NAFLD的功能［10-11］；此外，GLP-1受体激动剂还具有降低肝细胞内质网应激和脂肪变性的作用［12-13］。然而利拉鲁肽对NAFLD小鼠肝纤维化的作用及相关机制未见报道。LI等［14］研究发现，利拉鲁肽通过转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Sma和Mad相关蛋白3（Sma- and Mad-related protein 3，Smad3）途径减轻大鼠肾纤维化。因此，本研究拟通过甲硫氨酸-胆碱缺乏（methionine-choline deficient，MCD）饮食喂养构建NAFLD小鼠模型，并使用利拉鲁肽干预，探讨利拉鲁肽是否通过TGF-β/SMAD3途径改善小鼠肝纤维化。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄C57BL/6J小鼠20只，体质量23~28 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可证号为SCXK（沪）2013-0016。小鼠饲养于上海交通大学医学院附属第六人民医院动物实验室，使用许可证号为SYXK（沪）2016-0020。小鼠5只/笼喂养，12 h光照和黑夜循环，室温25 ℃，自由饮水和进食。

1.2 主要试剂和仪器

利拉鲁肽注射液（诺和诺德公司，丹麦），MCD饲料（Research Diets公司，美国）。组织总RNA提取试剂盒（Trizol法）、RNA反转录酶、实时荧光定量PCR（qPCR）扩增试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司），组织细胞甘油三酯酶法测定试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司），组织细胞蛋白裂解液、二辛可宁酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），苏木素染液、伊红染液、苯胺蓝染液、油红O染液、异丙醇（湖北百奥斯生物科技有限公司）。抗纤连蛋白（fibronectin，FN）抗体、抗α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体、抗SMAD3抗体（Cell Signaling Technology公司，美国），抗基质金属蛋白酶9（matrix metallop roteinase 9，MMP9）抗体、抗金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloprotease 1，TIMP1）抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司），抗转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）抗体、Ⅰ型胶原蛋白α（collagen type Ⅰα，COL1A）抗体（武汉三鹰生物技术有限公司），抗热休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的抗兔二抗、抗鼠二抗（武汉赛维尔生物科技有限公司），抗磷酸化SMAD3（pSMAD3）抗体（Santa Cruz公司，美国）。

高速离心机（Sartorius Basic公司，德国），SpectraMaxRi3X酶标仪［美谷分子仪器（上海）有限公司］，全自动生化分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司），实时荧光定量PCR仪（Roche公司，瑞士），超敏化学发光凝胶成像仪（GE公司，美国）。

1.3 实验方法

1.3.1 NAFLD模型构建、分组及给药方案

小鼠适应性喂养2周后予编号，随机分为正常饮食组（Chow组）及MCD饮食喂养组（MCD组），每组10只。每周记录小鼠体质量和日摄食量。2周后，将每组再随机分为2个亚组，每个亚组5只小鼠，每日分别腹腔注射利拉鲁肽400 μg/kg或等体积生理盐水干预4周。

1.3.2 腹腔注射葡萄糖耐量实验

干预4周后的小鼠予腹腔注射葡萄糖耐量实验（intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT）。小鼠禁食后腹腔注射葡萄糖（2 g/kg），注射后第0、15、30、60、90、120 min时使用血糖仪检测血糖。

1.3.3 生化检测

采集小鼠血液，室温静置30 min，在4 ℃下分别以5 000×g和10 000×g各离心5 min后，转移血清至干净的1.5 mL微量离心管中，-20 ℃储存备用。使用全自动生化仪检测血清门冬氨酸转氨酶（aspartate transaminase，AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TAG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平。

1.3.4 组织病理染色

每组选取5只小鼠，每只小鼠取肝脏大叶约1/3固定。制成2张石蜡切片，行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）和马松（Masson）染色［15］；制成2张冰冻切片，行油红O染色［16］。所有病理染色结果均镜下观察及拍照，每张切片随机选取5组视野。

1.3.5 qPCR检测

称量适量肝组织，用Trizol法提取小鼠肝组织RNA。使用酶标仪进行RNA浓度［D （260 nm）］和纯度［D （260 nm/280 nm）］测定，获得样本RNA。将样本RNA添加反转录酶，设置参数：50 ℃、15 min，85 ℃、5 s进行反转录，获得cDNA。在Primer Bank中检索同源引物，在Primer-Blast网站进行验证，并由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列见表1。以cDNA为模板，采用SYBR Green试剂盒及目标基因引物进行qPCR检测。采用β-actin作为内参，对样品的CT值进行校正。后对扩增曲线及融解曲线进行分析，并用2-ΔΔCT的方法统计各基因mRNA相对表达量。

表1   引物序列

Tab 1  Primer sequences

GeneForward primer (5′→3′)Reverse primer (5′→3′)
TGF-βTGATACGCCTGAGTGGCTGTCTCACAAGAGCAGTGAGCGCTGAA
Col1aCCTCAGGGTATTGCTGGACAACCAGAAGGACCTTGTTTGCCAGG
α-SMATGCTGACAGAGGCACCACTGAACAGTTGTACGTCCAGAGGCATAG
FnACAACACCGAGGTGACTGAGACGGACACAACGATGCTTCCTGAG
Timp1TCTTGGTTCCCTGGCGTACTCTGTGAGTGTCACTCTCCAGTTTGC
β-actinGTGCTATGTTGCTCTAGACTTCGATGCCACAGGATTCCATACC

Note:TGF-β—transforming growth factor-β; Col1a—collagen type Ⅰ α; α-SMA—α-smooth muscle actin; Fn—fibronectin; Timp1—tissue inhibitor of metalloprotease 1.

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1.3.6 Western blotting

称量适量小鼠肝组织，加入蛋白裂解液，研磨、离心后获得蛋白质溶液。采用BCA试剂盒检测蛋白溶液浓度。固定蛋白上样量为30 μg，蛋白质加热变性后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，随后以湿转法将蛋白转印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。5%脱脂牛奶封闭1 h后加入稀释后的抗α-SMA抗体（1︰1 000）、抗p-Smad3抗体（1︰1 000）、抗Smad3抗体（1︰1 000）、抗FN抗体（1︰1 000）、抗COL1A抗体（1︰2 000）、抗TGF-β抗体（1︰2 000）、抗MMP9抗体（1︰1 000）或抗HSP90抗体（1︰2 000），4 ℃振荡孵育过夜。TBST洗膜，加入HRP标记的抗兔或抗鼠二抗室温孵育1 h，再次用TBST洗膜。最后以增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）法将膜上蛋白显色，经显影处理后，采用凝胶成像分析系统对胶片进行拍照，蛋白条带采用ImageJ软件进行灰度值计算。

1.4 统计学分析

采用Graphpad Prism 9.5软件进行统计学分析及作图。定量资料以x±s表示，组间数据应用Student′s t检验比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 利拉鲁肽对小鼠体质量与肝功能的影响

与Chow组相比，MCD组小鼠体质量明显下降；利拉鲁肽干预4周后，与对应的未干预组相比，Chow组小鼠体质量降低，MCD组小鼠体质量无明显影响（图1A、B）。与Chow组比较，MCD组小鼠ALT与AST水平均升高；MCD组小鼠注射利拉鲁肽后ALT与AST水平均明显下降，差异具有统计学意义（均P<0.001，图1C、D）。以上结果表明，利拉鲁肽可以显著改善NAFLD小鼠肝功能，而对NAFLD小鼠体质量无明显影响。

图1

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图1   利拉鲁肽对小鼠体质量与肝功能的影响

Note： A. Representative pictures of mice in each group. B. Body weight changes after 6 weeks. C/D. ALT (C) and AST (D) levels treated with liraglutide after 4 weeks. ①P=0.043, compared with the Chow＋LG group; ②P<0.001, compared with the MCD＋Saline group. LG—liraglutide.

Fig 1   Effect of liraglutide on body weight and liver function in mice


2.2 利拉鲁肽对小鼠糖代谢与脂代谢的影响

与MCD+生理盐水组相比，利拉鲁肽干预后，MCD组小鼠在15、30、60 min时血糖均下降（均P<0.05，图2A），曲线下面积（area under the curve，AUC）（图2B）显著降低，提示利拉鲁肽干预改善了MCD组小鼠高血糖。以上结果表明，腹腔注射利拉鲁肽具有降低小鼠血糖的作用，并确认本研究中小鼠腹腔注射利拉鲁肽实验是有效的。

图2

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图2   利拉鲁肽对小鼠糖代谢与脂代谢的影响

Note： A. Resluts of IPGTT. B. AUC for IPGTT. C. Serum TAG levels. D. Serum TC levels. E. Serum HDL-C levels. F. Serum LDL-C levels. ①P=0.026, ②P=0.015, ③P=0.001, MCD＋Saline vs MCD＋LG.

Fig 2   Effects of liraglutide on glucose metabolism and lipid metabolism in mice


饮食中缺乏甲硫氨酸和胆碱，会导致肝脏极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）合成障碍，脂肪转运受阻，造成TAG、TC等入血减少，大量堆积于肝脏中，最终发展为脂肪肝［17］。本研究结果显示，与Chow组小鼠相比，MCD组小鼠血清TAG、TC、HDL-C水平明显降低（均P<0.05，图2C~E）；而利拉鲁肽干预对血清TAG水平无明显影响（图2C），但增加了血清TC、HDL-C水平（均P<0.05，图2D、E）。各组小鼠血清LDL-C水平无明显差异（图2F）。

2.3 利拉鲁肽对小鼠肝脏脂肪变性与纤维化的病理改变

肝脏大体形态显示：Chow组小鼠肝脏形态正常、边缘锐利、色泽红润、质地柔软；MCD组小鼠肝脏体积明显缩小、颜色发黄；而腹腔利拉鲁肽给药后，小鼠肝脏外观和质地有明显改善（图3A）。与Chow组小鼠相比，MCD组小鼠肝组织TAG含量明显增加，利拉鲁肽治疗后，MCD组小鼠TAG含量明显降低，肝脏质量与体质量比值降低（均P<0.05，图3B、C）。油红O染色与HE染色显示，Chow组小鼠肝细胞结构完整，肝细胞呈放射状条索样排布，肝小叶清晰可见；MCD组小鼠肝细胞出现大量脂滴与脂肪空泡，肝小叶结构被破坏，肝索结构紊乱，伴有炎症细胞浸润；利拉鲁肽治疗后，MCD组小鼠肝细胞脂滴数量明显减少，气球样变性和炎症浸润程度减轻（图3D、E）。以上结果表明利拉鲁肽可降低NAFLD小鼠肝脏TAG含量，并有效改善小鼠肝脏脂肪变性。

图3

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图3   利拉鲁肽对小鼠肝脏脂肪变性与纤维化的影响

Note： A. Representative pictures of mouse livers. B. TAG levels in liver tissue of mice in each group. C. The ratio of liver to body weight in mice in each group. D. Liver tissue stained with Oil Red O. Double arrows indicate massive lipid droplets in the liver of MCD mice. A single arrow indicates that lipid droplets significantly reduced. E. Liver tissue stained with HE. Double arrows indicate massive hepatocyte ballooning and fat vacuoles in the liver of MCD mice. A single arrow indicates a significant reduction in hepatocyte ballooning degeneration and fat vacuoles. F. Liver tissue stained with Masson. Double arrows indicate massive blue collagen fibers in the liver of MCD mice. A single arrow indicates blue collagen fibers significantly reduced.

Fig 3   Effect of liraglutide on hepatic steatosis and fibrosis in mice


采用Masson染色检测各组小鼠肝组织胶原纤维沉积情况，结果显示，Chow组小鼠肝脏组织结构正常，肝细胞呈放射状条索样排布，肝小叶清晰可见，仅在中央静脉处观察到少量的胶原纤维染色，余未见有胶原纤维；而MCD组小鼠肝小叶结构尚存，但排列紊乱，窦间隙和中央静脉区出现大量蓝染的胶原纤维；经利拉鲁肽干预后，MCD组小鼠肝脏胶原纤维数量明显减少（图3F）。

2.4 利拉鲁肽对小鼠肝纤维化基因表达的影响

qPCR检测结果显示，与Chow组小鼠相比，MCD组小鼠肝脏纤维化相关基因α-SMA、Fn、Col1a、Timp1的mRNA表达明显上调；经利拉鲁肽干预后，MCD组小鼠肝脏α-SMA、Fn、Col1a、Timp1的mRNA表达明显降低（均P<0.05，图4）。

图4

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图4   利拉鲁肽对小鼠肝纤维化基因表达的影响

Note： The relative expression of α-SMA (A), Fn (B), Col1a (C), and Timp1 (D) mRNA in the liver of mice.

Fig 4   Effect of liraglutide on indices of liver fibrosis genes in mice


2.5 利拉鲁肽对小鼠肝纤维化蛋白表达的影响

Western blotting检测结果显示，与Chow组小鼠相比，MCD组小鼠肝脏纤维化相关蛋白α-SMA、FN、COL1A、TIMP1表达明显增加，MMP9蛋白表达明显降低；经利拉鲁肽干预后，MCD组小鼠肝脏α-SMA、FN、COL1A、TIMP1蛋白表达显著下降，MMP9蛋白表达明显增加（图5）。

图5

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图5   利拉鲁肽对小鼠肝纤维化蛋白表达的影响

Note： A. Expression of FN, COL1A, α-SMA, MMP9, TIMP1, and HSP90 proteins detected by Western blotting. B－F. The relative expression levels of COL1A (B), α-SMA (C), FN (D), MMP9(E), and TIMP1 (F) proteins in the liver of mice.

Fig 5   Effect of liraglutide on indices of liver fibrosis protein in mice


2.6 利拉鲁肽对TGF-β/SMAD3通路的影响

qPCR检测显示，与Chow组小鼠比较，MCD组小鼠肝组织TGF-β mRNA表达升高，利拉鲁肽干预后TGF-β mRNA降低（图6B）。

图6

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图6   利拉鲁肽对小鼠肝脏TGF-β通路的影响

Note： A. Expression of TGF-β, pSMAD3, SMAD3, and HSP90 proteins detected by Western blotting. B. The relative expression level of TGF-β mRNA in the liver of mice. C/D. The relative expression levels of TGF-β (C) and pSMAD3/SMAD3 (D) proteins in the liver of mice. E. Working plot of liraglutide decreasing the TGF-β/smad3 signaling and reducing the expression of FN, α-SMA, and COL1A.

Fig 6   Effect of liraglutide on indices of liver TGF-β pathway in mice


Western blotting检测显示，与Chow组小鼠比较，MCD组小鼠TGF-β、pSMAD3蛋白表达显著增加；利拉鲁肽干预后，TGF-β、pSMAD3/SMAD3蛋白表达显著降低（图6A、C、D）。根据以上实验结果，我们认为利拉鲁肽通过部分抑制TGF-β/SMAD3信号降低肝脏COL1A、FN、α-SMA表达，进而改善NAFLD小鼠肝纤维化（图6E）。

3 讨论

NAFLD/NASH进展的关键病理特征包括肝脏脂质沉积与肝纤维化。多项研究表明，GLP1受体激动剂通过多种途径改善肝脏脂肪变性与肝损伤，例如降低炎症反应［11］、抵抗内质网应激［18］、激活5′-磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）信号通路［19］、提高胰岛素敏感性［20］等。MCD饮食是诱导建立NAFLD小鼠模型的经典方式，与单独高脂饮食诱导的模型相比，小鼠发病迅速，肝脏脂肪变性、炎症反应及纤维化等病理改变更为明显［21］。本研究观察到MCD饮食后小鼠体质量降低，与既往文献［22］报道一致。且MCD组小鼠血清ALT、AST水平均升高，而利拉鲁肽干预后显著降低ALT、AST水平，同时降低MCD组小鼠血糖AUC，表明利拉鲁肽具有降血糖、改善肝脏脂质沉积及肝功能的作用。此外，MCD组小鼠外周血TC水平降低，利拉鲁肽干预后TC水平上调，提示利拉鲁肽可能促进了肝脏TC向外周转运。既往研究［11］发现利拉鲁肽注射后NAFLD小鼠的外周循环TC有轻微上调。WU等［23］研究显示，利拉鲁肽通过激活细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）通路增加ATP结合盒转运体蛋白A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）的表达，促进肝细胞TC向外周转运，并在此基础上减轻NAFLD病理特征。因此，利拉鲁肽促进肝细胞胆固醇外排可能是利拉鲁肽缓解NAFLD小鼠肝纤维化的重要原因。

MCD组小鼠肝脏病理结果显示肝组织出现大量脂肪空泡、脂滴聚集与大量蓝染胶原纤维，利拉鲁肽干预后显著减少脂肪空泡、脂滴聚集与胶原纤维，提示利拉鲁肽可改善NAFLD小鼠肝脏脂肪变性及纤维化。

肝纤维化主要表现为肝脏ECM的弥漫性过度沉积与异常分布［24］。在NASH情况下，肝纤维化形成通常与慢性炎症介导肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）激活，分化为肌成纤维细胞有关［25］。α-SMA和COL1A的过度表达是活化的肝星状细胞（activated hepatic stellate cell，aHSC）的特征标志［26］。FN由HSC产生并分泌，是ECM的重要组成部分，在肝纤维化进展中发挥重要作用［27-28］。本研究发现利拉鲁肽显著降低NAFLD小鼠肝脏α-SMA、COL1A、FN的表达。另外，TGF-β因子在肝脏中由Kupffer细胞、窦状内皮细胞和肝细胞释放，然后促进SMAD2或SMAD3蛋白磷酸化，驱动HSC激活［29-30］，导致COL1A、α-SMA、FN过度表达［31］；同时该因子也会促进肌成纤维细胞存活和增殖，是造成多种器官纤维化进展的重要因子［32］。CHILVERY等［33］研究表明，抑制TGF-β/Smad信号转导可以防止HSC的激活。LI等［14］研究发现利拉鲁肽通过TGF-β/SMAD3信号减轻大鼠肾纤维化。本研究发现利拉鲁肽降低NAFLD小鼠肝脏α-SMA、COL1A、FN、TGF-β的过度表达，减少TGF-β与pSMAD3蛋白表达。因此我们的研究部分阐明利拉鲁肽改善肝纤维化的作用及其机制。

MMP9在肝脏中是由静息HSC分泌的基底膜蛋白酶，能特异性降解ECM底物［34］。TIMP1由aHSC分泌，慢性肝损伤期间TIMP1持续产生，可以抑制MMP9的活性，使得金属蛋白酶对多余的纤维胶原去除效率降低，破坏ECM降解与合成的平衡，导致ECM沉积［35-36］。本研究发现MCD组小鼠肝脏Timp1 mRNA与蛋白表达明显上调，而MMP9蛋白表达显著下调；利拉鲁肽干预后小鼠肝脏Timp1 mRNA与蛋白表达明显降低，MMP9蛋白表达增加；提示利拉鲁肽降低TIMP1表达，促进MMP9表达，从而改善NAFLD小鼠肝纤维化。

综上所述，本研究发现利拉鲁肽通过TGF-β/SMAD3降低NAFLD小鼠肝纤维化基因与蛋白表达；此外，利拉鲁肽干预后通过降低NAFLD小鼠肝脏TIMP1蛋白表达，促进MMP9表达来改善肝纤维化。然而，本研究采用的小鼠体型偏瘦，与肥胖型NAFLD代谢方式存在差异，因此无法完全模拟肥胖型NAFLD的实际情况。并且本研究未对NAFLD小鼠其他器官和组织做相关研究，因此无法确定利拉鲁肽是否会通过其他组织（例如下丘脑、胃肠、胰腺）对肝纤维化产生影响。此外，利拉鲁肽通过TGF-β/SMAD3信号改善肝纤维化的具体机制需要在大规模前瞻性临床研究以及肝脏细胞纤维化模型中加以证实。

作者贡献声明

王仁杰负责课题设计、实验验证和论文撰写，祝超瑜、方云云负责课题设计、实验验证，魏丽、肖元元、王倩倩、宋雯婧参与课题设计与论文修改。所有作者均阅读并同意提交最终稿件。

AUTHOR's CONTRIBUTIONS

WANG Renjie was responsible for the project design, experimental verification and paper writing. ZHU Chaoyu and FANG Yunyun were responsible for the project design and experimental verification. WEI Li, XIAO Yuanyuan, WANG Qianqian, and SONG Wenjing participated in the project design and paper revision. All authors have read the final version of the paper and consented to submission.

利益冲突声明

所有作者声明不存在利益冲突。

COMPETING INTERESTS

All authors declare no relevant conflict of interests.

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