脑和其他中枢神经系统肿瘤是致死率最高的肿瘤类型之一，其中恶性肿瘤占比不到30%，却是导致死亡的主要原因。这些恶性肿瘤中胶质瘤占比最多，约80%^［1］。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）将胶质瘤按侵袭性分为4个组织学程度（WHO Ⅰ~Ⅳ级），其中WHO Ⅲ和WHO Ⅳ级胶质瘤被称为高级别胶质瘤（high-grade gliomas，HGGs）^［2］。WHO Ⅳ级的HGGs主要包括胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）和弥漫性内生性脑桥胶质瘤（diffuse intrinsic pontine glioma，DIPG）2个类型^［3］。

GBM分为成人GBM（adult GBM，aGBM）和儿童GBM（pediatric GBM，pGBM）。目前对于GBM的治疗手段主要是最大限度地外科手术结合放射治疗（放疗）或者替莫唑胺（temozolomide，TMZ）治疗，但是几乎都会复发^［4］。aGBM占恶性脑肿瘤的50.1%，是较常见的成人恶性原发性脑肿瘤，发病率随年龄增长而增加；75~84岁的老年人发病率最高，aGBM患者的5年生存率约为5%^［3］。癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库分析结果表明aGBM中有3个核心通路的基因改变^［5］：磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）通路、p53通路和Rb通路。靶向3个核心通路是治疗aGBM的合理策略。此外，基因转录调控异常在癌症发生发展中起到重要作用，靶向转录辅因子是治疗癌症的有效手段，如周期蛋白依赖性激酶7（cyclin dependent kinase 7，CDK7）抑制剂THZ1是治疗aGBM的有效分子^［6］。再者，也可以通过靶向肿瘤血管生成和免疫检查点途径治疗aGBM^［7］。pGBM与aGBM相比较为罕见，占儿童脑肿瘤的15%^［8］。2类肿瘤在组织学上相似，但是在生物学和分子特征上有着很大的不同^［9］。约1/3的pGBM患者中编码组蛋白H3.3的基因H3F3A具有多种突变^［10］：第27位赖氨酸突变为甲硫氨酸（K27M），第34位甘氨酸突变为精氨酸（G34R）或缬氨酸（G34V）。H3F3A突变可以诱导pGBM过度增殖，但要结合其他驱动因素才能发展为恶性肿瘤^［11］。另一类儿童HGGs是DIPG，好发于脑干的脑桥区域，中位生存期约为9个月，5年生存率不到1%^［12-13］。因DIPG发病位置特殊，且弥漫性生长，所以无法进行外科手术，只能采取放疗或者化学治疗（化疗）^［14］。80%的DIPG患者存在H3K27M突变，该突变在DIPG中同样发挥了重要的致癌作用^［15］。

表观转录调控分子已被揭示为癌症的关键调控因子和有效的治疗靶点。单独应用表观转录靶向治疗或联合其他治疗在多种癌症模型中的效果越来越被认可^［16-18］。在GBM和DIPG中也有很多表观转录靶向治疗策略的提出，如HDACi^［19-20］、CDK7i^［6，18］、CDK9i和BETi^［21-22］等。2种HGGs在发病机制和分子特性上存在许多差异，但也有很多共同的表观转录靶点。CDK12和CDK13（CDK12/13）是CDK家族中主要发挥转录调控功能的2个成员，具有很高的蛋白相似性以及功能的冗余性^［23］。它们分别与细胞周期蛋白cyclin K结合后皆可催化RNA聚合酶Ⅱ催化亚基（RNA polymerase Ⅱ subunit B1，RPB1）的C端结构域（carboxy-terminal domain，CTD）七肽重复单位中第二位丝氨酸（Ser2，S2）的磷酸化，进而通过调控转录延伸影响基因表达^［24］。此外，它们对RNA剪接、mRNA 3′末端加工、内含子多聚腺苷酸化和翻译等过程也具有调控作用^{［23，25］}。靶向抑制CDK12/13在三阴性乳腺癌^［26］、肝癌^［27］、结直肠癌^［28］、胃癌^［29］、尤文肉瘤^［30］等肿瘤类型的预临床肿瘤模型汇总中均已被报道具有显著的抗肿瘤效应，但在高级别胶质瘤中尚未被报道。在CDK12/13抑制剂的抗肿瘤作用机制方面，DNA复制、基因转录、RNA剪切这些CDK12/13参与调控的主要生物学功能均受到拮抗，并且在不同肿瘤类型中表现出了较高的一致性^［26］。研究^［31］表明，cyclin K/CDK12复合物通过调控DNA损伤反应（DNA damage response，DDR）相关基因的表达来维持基因组的稳定性。CDK12/13抑制剂对DNA损伤修复的拮抗作用得到了较多关注并具有较大的临床潜在应用价值。已有研究发现，CDK12/13抑制剂处理能够在多类肿瘤中引起大量参与DNA损伤修复的关键基因的转录下调，从而诱导DNA损伤的累积^［26］；其主要作用机制是抑制CDK12/13可减少RNA聚合酶Ⅱ CTD S2位点的磷酸化水平，阻滞RNA聚合酶Ⅱ向基因3'端的行进，使多外显子基因在内含子多聚腺苷酸位点处提前终止转录，产生功能受损的转录本及蛋白截短体，从而影响细胞相关功能，其中多个DDR通路基因被发现对该抑制反应尤其敏感^［32］。进一步将CDK12/13抑制剂与能够显著诱导DNA损伤效应的放射治疗和化学治疗（放化疗）或多聚ADP核糖聚合酶抑制剂（poly ADP-ribose polymerase inhibitor，PARPi）等其他多类治疗手段进行组合治疗测试之后，发现它们之间能够产生显著的协同抗肿瘤效应或合成致死作用^［26］，说明CDK12/13抑制药物具有非常大的临床应用前景和商业开发价值。值得注意的是，目前已经报道过的多个CDK12/13靶向小分子，例如THZ531^［33］和SR-4835^［26］，均无法有效区分CDK12和CDK13高度相似的蛋白结构域。此外，目前还尚未有该类小分子药物进入人体临床试验。

鉴于DIPG和GBM中已发现的多类相同的表观转录治疗靶标，我们猜想可能还有其他尚未被报道过的HGGs共有的表观转录靶向治疗策略。因此，本研究计划通过对多个DIPG和GBM细胞系进行针对表观转录调控因子的功能基因组与靶向小分子药物库的筛选分析，系统鉴定二者共同的表观转录治疗新靶点和新策略，并进一步进行体外功能验证与机制挖掘，期冀为后续体内验证和未来临床治疗奠定基础。

DIPG17、DIPG_13F（美国斯坦福大学Dr. Monje惠赠）和DIPG_BJ02（北京天坛医院张力伟教授惠赠）原代细胞系，均来自H3.3K27M突变的DIPG患者，可在体外稳定连续传代培养。aGBM细胞系U251（购自中国科学院细胞库）和pGBM细胞系SF188（美国斯坦福大学Dr. Monje惠赠）中H3.3皆为野生型（WT）；pGBM细胞系KNS42（复旦大学蓝斐教授惠赠）组蛋白含H3.3 G34V突变。慢病毒包装质粒pSPAX2和pMD2.G均为本实验室库存，lentiCas9-Blast质粒（52962）、lentiCRISPR-v2质粒（52961）购自美国Addgene，敲除质粒sgGFP、sgCDK12-2、sgCDK12-3由本实验室自行构建。

表观药物库中326个药物来源于TargetMol化合物库（美国）。Neurobasal-A、DMEM/F-12、HEPES、丙酮酸钠、非必需氨基酸、谷氨酰胺、青霉素/链霉素、B-27添加剂、TrypLE消化酶和Opti-MEM培养基（Gibco，美国），人表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、人碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、人血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）-AA和PDGF-BB（Shenandoah Biotech，美国），肝素（StemCell Technologies，加拿大），高糖DMEM培养基（上海源培生物科技股份有限公司），胎牛血清和PEG6000（Sigma-Aldrich，美国），PEI MAX（Polysciences，美国），无血清细胞冻存液（苏州新赛美生物公司），PBS（武汉赛维尔生物科技有限公司），TRIzol、EdU细胞增殖检测试剂盒（Invitrogen，美国），脱氧核糖核酸酶Ⅰ（Worthington，美国），CellTiter-Glo细胞活力检测试剂（Promega，美国），BCA蛋白定量试剂盒（Life Technologies，美国），反转录试剂盒（Thermo，美国），基因组DNA（genomic DNA，gDNA）提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒小抽试剂盒和SYBR qPCR Master Mix、高敏型ECL化学发光检测试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司），KAPA HiFi热启动酶（Roche，瑞士），Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司），SDS-PAGE凝胶（上海熠晨生物科技有限公司），CDK12抗体（Proteintech，美国），磷酸化的组蛋白H2AX（γH2AX）抗体、Phospho-RPB1 CTD（Ser2）抗体（Cell Signaling Technology，美国），微管蛋白抗体（Abcam，英国），辣根过氧化物酶结合山羊抗兔／小鼠IgG（Piercego，美国），脱脂奶粉（上海翌圣生物公司）。PCR仪、RT-qPCR仪和电泳仪（Bio-Rad，美国），超灵敏化学发光成像仪（Azure Biosystems，美国），流式细胞仪（BD LSRFortessa，美国），酶标仪、生物安全柜和细胞培养箱（Thermo Fisher，美国）。

DIPG细胞DIPG17、DIPG_BJ02和DIPG_13F为悬浮细胞，培养于以1∶1混合Neurobasal-A和DMEM/F-12的TSM培养基中（含2% B-27添加剂、10 mmol/L HEPES、1 mmol/L丙酮酸钠、0.1 mmol/L非必需氨基酸、1%谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、2 µg/mL肝素、10 ng/mL PDGF-AA和10 ng/mL PDGF-BB）。GBM细胞U251、SF188和KNS42为贴壁细胞，传代周期均为7 d，培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中。所有细胞均培养于37 ℃、含5% CO₂培养箱中。

在384孔板中进行表观转录调控相关小分子药物库筛选，药物浓度为1 µmol/L，设置2个重复孔，药物处理DIPG_BJ02、DIPG_13F、U251和SF188细胞72 h后，利用CellTiter-Glo检测细胞活性。计算2个孔的平均值，将各药物处理孔平均值与对照二甲基亚砜（DMSO）处理孔平均值相比，得到每个药物处理后的细胞活率（%），以“1－细胞活率（%）”计算药物抑制率（%），并以抑制率大于50%作为筛选标准。

首先用lentiCas9-Blast病毒以感染复数（MOI）<0.7感染DIPG_BJ02细胞系，构建DIPG_BJ02-Cas9稳转细胞株；用针对表观遗传与转录有关因子的混合慢病毒sgRNA文库，以MOI<0.3感染DIPG_BJ02-Cas9稳转细胞株，进行为期4周的生长筛选。筛选结束后，以gDNA提取试剂盒提取筛选细胞的gDNA进行PCR扩增，通过DNA电泳进行产物纯化及Qubit定量；送北京诺禾致源公司进行二代测序，测序结果采用MAGeCK算法分析。

sgRNA oligo引物由上海生工生物公司合成，序列见表1。引物稀释至100 µmol/L，首先进行oligo退火，退火体系如下：oligo上游引物（100 μmol/L）1 μL，oligo下游引物（100 μmol/L）1 μL，10×T4 ligation buffer 1 μL，T4多核苷酸激酶 0.5 μL，ddH₂O 6.5 μL。然后酶切lentiCRISPR-v2质粒并进行胶回收的纯化，酶切反应体系如下：lentiCRISPR-v2 2 μg，Esp3Ⅰ内切酶1 μL，碱性磷酸酶（FastAP，1 U/µL）1 μL，二硫苏糖醇（100 mmol/L）0.2 μL，10×FastDigest Green Buffer 2 μL，ddH₂O补足至20 μL。将退火后的双链Oligo与酶切载体用T4 DNA连接酶进行连接，之后进行转化，将连接产物加入到50 μL感受态细胞中，冰上30 min后42 ℃热激90 s，然后再放冰上2 min，加400 μL LB培养基，于37 ℃孵箱摇床上，225 r/min摇1 h，然后涂板。在孵箱中培养16 h后，挑取单克隆送二代测序，测序结果比对正确后进行质粒抽提。

将6×10⁶个293T细胞接种到10 cm细胞培养皿中，24 h后，细胞密度达80%~90%。按比例配置试剂（慢病毒载体质粒10 µg，psPAX2 6 μg，pMD2.G 4 µg，Opti-MEM 1 000 µL，PEI MAX 60 µL），静置15 min后进行转染；转染后24 h和48 h收集半量上清液，72 h收集剩余上清液，600×g离心5 min后，将上清液转移至新的50 mL离心管中，用PEG6000进行病毒上清液浓缩，混匀后静置过夜；2 000×g离心30 min，弃上清液，PBS重悬浓缩病毒沉淀，分装后放-80 ℃保存。

将细胞沉淀收集在1.5 mL离心管中，用含有1%苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）的RIPA裂解液（50 mmol/L HEPES，500 mmol/L LiCl，1 mmol/L EDTA，1% NP-40，0.7%脱氧胆酸钠）重悬细胞沉淀，并置于冰上裂解30 min，离心，取上清液转移至新离心管中，用BCA试剂盒进行蛋白浓度定量检测。加5×SDS上样缓冲液制样，100 ℃加热10 min，使蛋白变性。配制SDS-PAGE凝胶，上样10~30 µg，80 V电压电泳，待溴酚蓝迁移至上层胶的下边缘，改为100 V电泳，至溴酚蓝迁移至下层胶的底部。用甲醇活化后的聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜进行蛋白转膜，条件为250 mA电流90 min，转膜结束后用5%脱脂奶粉摇床封闭膜1 h，一抗4 ℃孵育过夜，第二日用TBST洗膜5 min，共3次，二抗室温孵育1 h，TBST洗膜5 min，共3次。用高敏型ECL化学发光检测试剂盒孵育后，采用超灵敏化学发光成像仪对蛋白质进行化学发光成像。

在96孔板中每个处理组按50或100个/孔接种DIPG17细胞，均设置10个重复孔。加入50 µL培养基，每5 d补充50 µL培养基并观察细胞生长情况，第14日显微镜下观察成球细胞孔数并记录，用极限稀释分析网站（https：//bioinf.wehi.edu.au/software/elda/）进行绘图。

在六孔板中按2 000个/孔分别接种U251和SF188细胞，每4 d进行半量换液。第14日从细胞培养箱中取出细胞，弃培养基，PBS洗1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30 min；PBS洗1次，每孔加入1 mL结晶紫染色1 h；PBS洗涤数次后晾干，对整个板和每个孔都进行拍照。拍照后每孔加入800 µL 33%冰乙酸溶解结晶紫，在摇床上摇1 h，酶标仪定量分析克隆数量。

在96孔板中将U251、SF188和KNS42细胞按1 000个/孔铺板，DIPG17细胞按10 000个/孔铺板，每个药物浓度设置3个重复孔。加药处理72 h后，每孔加入50 µL CellTiter-Glo化学发光试剂，充分振荡裂解细胞后，用酶标仪进行细胞活力检测。

在12孔板中将DIPG17按5×10⁵个/孔铺板，U251、SF188按2×10⁵个/孔铺板，12 h后进行加药处理；加药16~18 h后，加入EdU试剂至终浓度为10 µmol/L，继续孵育6~8 h；加药24 h后，将细胞消化成单细胞，然后600×g离心5 min，弃上清液，加入100 µL Click-iT fixative重悬细胞，室温避光孵育15 min；加入900 µL PBS混匀，1 500×g离心5 min，弃上清液，加入100 µL Click-iT渗透性洗涤剂重悬细胞，4 ℃孵育过夜；第二日3 000×g离心5 min，吸去60 µL上清液，加入200 µL Click-iT反应液，重悬细胞，室温避光孵育30 min；加入900 µL PBS终止反应，过滤至流式管中，进行流式细胞仪检测。

在12孔板中将DIPG17按5×10⁵个/孔铺板，U251、SF188按2×10⁵个/孔铺板，12 h后进行加药处理；加药48 h后，将细胞消化为单细胞，800×g离心5 min，弃上清液；加入100 µL 1×binding buffer重悬细胞，加入2.5 µL Annexin V-FITC和10 µL PI，充分混匀，室温避光孵育5 min；过滤至流式管中，进行流式细胞仪检测。

用500 µL TRIzol重悬细胞沉淀，加入100 µL三氯甲烷快速混匀15 s，静置2 min后12 000×g、4 ℃离心15 min；将上清液转移到新的离心管中，每管加2 µL 5 mg/mL的糖原和250 µL异丙醇，快速混匀15 s后12 000×g、4 ℃离心10 min；弃上清液，保留RNA沉淀；每管加入1 mL预冷的75%乙醇，7 500×g、4 ℃离心5 min；弃上清液，7 500×g、4 ℃离心2 min，用移液枪吸去残留液体，室温晾干至沉淀透明；然后加入20 µL RNase-free水，55 ℃孵育5 min，混匀后NanoDrop定量。将RNA反转录成cDNA，稀释20倍后作为模板进行RT-qPCR体系配置，点样于384孔板中，RT-qPCR仪检测。RT-qPCR引物序列见表2。

在12孔板中将DIPG17按5×10⁵个/孔铺板，U251、SF188按2×10⁵个/孔铺板，12 h后进行加药处理；加药24 h后，将细胞消化为单细胞，800×g离心5 min，弃上清液；加入1 mL DNA染色液（含RNase A和PI）和10 µL破膜剂，重悬细胞，室温避光孵育30 min；过滤至流式管中，进行流式细胞仪检测。

通过DepMap数据库进行GBM细胞系对CDK12、CDK13和CDK9的依赖性分析，其中CDK9为阳性对照。在DepMap（https：//depmap.org/portal/）网站中下载最新版本的CDK12、CDK13和CDK9在肿瘤细胞系中的依赖性文件［CRISPR（DepMap Public 22Q4+Score，Chronos）：630/1 078］，筛选其中所有GBM细胞系及其基因效应（gene effect）值，用GraphPad Prism 8.0软件绘制散点图。

将SR-4835处理的DIPG17或SF188的细胞样本溶于TRIzol，送上海美吉生物医药科技有限公司进行RNA-seq转录组测序，对返还的原始测序结果Rawdata进行分析。首先利用trim galore工具进行原始数据的接头（adapter）类型检测和去接头，然后利用STAR工具将序列比对至参考基因组GRCh38，再利用htseq-count工具获得每个转录本的读数（counts）；利用Gfold进行差异表达分析^［34］，获得每个基因的Gfold值，设置相应的阈值以筛选表达显著上调或下调的基因。本研究设置Gfold<-1为基因表达下调，Gfold>1为基因表达上调。

准备转录组测序分析得到的每个转录本的TPM值文件和目标基因集的gmt文件，在Rstudio软件中，用GSVA和limma R包进行Gene Set Variation Analysis（GSVA）分析，得到目标基因集在样本中的富集程度，并用pheatmap R包进行热图绘制。

使用David网站（https：//david.ncifcrf.gov）对RNA-seq转录组测序数据分析中表达显著下调的基因进行基因本体（gene ontology，GO）分析。首先输入需要分析的gene list，然后选择特征为官方基因名（official_gene_symbol），选择list类型为gene list，最后提交list进行GO分析，在结果中选择GO_BP查看结果并下载文件。

采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析和绘图。2组间比较采用非配对t检验，2组以上比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

为了系统寻找DIPG和GBM中共同的表观转录相关的靶向治疗新策略，在aGBM细胞系U251、pGBM细胞系SF188和2个DIPG细胞系（DIPG_13F、DIPG_BJ02）中进行表观转录相关的靶向小分子药物库筛选（图1A）。以1 µmol/L药物处理时抑制率大于50%作为筛选标准，分别有32、64、44和37个靶向小分子能够有效抑制U251、SF188、DIPG_13F和DIPG_BJ02细胞系生长，其中17个靶向小分子对4个细胞系均有显著抑制效果（图1B）。它们主要是HDAC抑制剂、CDK抑制剂和微管相关蛋白抑制剂（图1C）。关注到小分子抑制剂THZ531对应的CDK12/13靶向治疗虽然在三阴性乳腺癌、尤文肉瘤、胃癌、结直肠癌等多种肿瘤中被发现有效^［26-30］，但在DIPG和GBM中尚未有过报道，因此接下来选择该类表观转录靶向治疗策略继续研究。

为进一步探究CDK12/13在DIPG和GBM中的依赖性，一方面通过分析DepMap数据库中GBM细胞系的基因依赖性相关数据，发现GBM细胞系对CDK12/13均显示出一定的依赖性（基因效应值<0），并且细胞对CDK12的依赖性相较于CDK13更高（图1D）。另一方面，在DIPG_BJ02细胞系中进行表观转录靶向的CRISPR-Cas9功能基因组体外筛选，二代测序结果表明CDK12/13均是排名靠前的肿瘤依赖基因（图1E、F）。以上分析结果表明GBM和DIPG细胞对CDK12/13均表现出依赖性，支持进一步深入探究靶向抑制CDK12/13对这2类HGGs的体外治疗效应及作用分子机制。

已有研究^［23］表明CDK12/13之间既有功能上的相互配合，也存在一定的冗余。基于以上的肿瘤依赖性分析结果（图1D~F）和已有的CDK12/13肿瘤依赖性相关报道^［26］，推测CDK12可能相较于CDK13来说发挥更重要的生长调控作用，因此挑选CDK12进行肿瘤依赖性的独立验证。发现当利用CRISPR-Cas9方法在DIPG17、aGBM细胞系U251和pGBM细胞系（SF188、KNS42）中敲除CDK12，可以显著抑制上述HGGs细胞系的体外细胞活性（图2A、B）。在DIPG17细胞系中，成球实验结果显示敲除CDK12可以显著抑制DIPG17细胞的自我更新能力（图2C）。而在另外3个GBM细胞系（U251、SF188、KNS42）中，敲除CDK12也可显著抑制其克隆形成能力（图2D）。上述结果均表明CDK12缺失能够显著抑制DIPG和GBM细胞的体外生长，验证了该基因的肿瘤依赖性。

接下来，进一步分析CDK12/13抑制剂对GBM和DIPG的体外治疗作用。如图3A所示，THZ531^［33］和SR-4835^［26］这2个高选择性的CDK12/13抑制剂对DIPG细胞系DIPG17以及GBM细胞系U251、SF188和KNS42均表现出剂量依赖性的细胞活性抑制作用，IC₅₀均小于1 µmol/L，与已报道的其他类型肿瘤细胞的结果相似^{［26-27，35］}。流式细胞术检测靶向抑制CDK12/13对DIPG和GBM细胞增殖和凋亡的影响，结果显示0.1 µmol/L或1 µmol/L的SR-4835均可以显著抑制DIPG17、SF188和U251细胞增殖和促进其细胞凋亡（图3B~D）。

根据药物剂量杀伤曲线结果（图3A），选择0.1 µmol/L和1 µmol/L的SR-4835分别处理DIPG17细胞或SF188细胞20 h后的样本进行RNA-seq转录组测序，并重点对4个样本中相较于DMSO处理组表达水平显著下调的基因进行比较分析。如图4A所示，与其他3个样本相比，0.1 µmol/L SR-4835处理的SF188细胞中表达水平显著下调的基因数量偏低，这与其细胞活性杀伤水平偏低相符合。因此，后续分析主要选择其他3个样本中表达水平显著下调基因的交集部分共994个基因作为研究对象。GO分析结果表明，这些基因显著富集的生物学过程与已知的CDK12/13参与调控的基因转录和DDR相关（图4B）。GSVA分析结果也显示，SR-4835能够显著下调DIPG17和SF188细胞中这2类生物学过程相关基因集合的转录水平，说明CDK12/13抑制剂作用于DIPG和GBM细胞时具有在靶（on-target）效应。已有研究^{［26-27，35］}表明，在多个肿瘤类型中CDK12/13抑制剂能够通过显著拮抗DDR与放化疗以及其他靶向治疗手段之间产生显著的协同治疗效果。因此，对DIPG和GBM中靶向抑制CDK12/13是否能引起DDR相关基因的转录下调以及DNA损伤的积累进行进一步验证。如图4D和5A所示，通过RT-qPCR验证了SR-4835和THZ531能够在多个DIPG和GBM细胞系中引起系列关键DDR相关基因（TP53、CCNK、ATM、ATR、E2F1、BRCA1、FANCD2、SMARCC2、RAD51、FANCI）的转录下调。此外，通过蛋白质印迹法（Western blotting）验证了SR-4835和THZ531处理能够显著下调DIPG和GBM细胞中RNA Pol Ⅱ CTD S2位点的磷酸化（RNA Pol Ⅱ S2P）水平，并且显著上调DNA双链断裂（double-strand break，DSB）标志物γH2AX（组蛋白H2AX第139位丝氨酸的磷酸化^［36］）的水平，表明在这2类HGGs中靶向抑制CDK12/13确实能够引起DNA损伤的积累（图5B）。

如图6A、B所示，RNA-seq转录组测序数据的GO和GSVA分析还发现SR-4835分别处理DIPG17和SF188细胞之后均能够显著下调蛋白酶体-泛素化与细胞周期相关的生物学功能。已有研究^［37］表明DNA损伤的累积与泛素-蛋白酶体功能的下调均可以诱导肿瘤细胞阻滞在G2-M期并发生凋亡，因此，接下来用0.1 µmol/L和1 µmol/L的SR-4835分别处

理U251、SF188和DIPG17细胞，并利用流式细胞术检测靶向抑制CDK12/13对3个HGGs细胞的细胞周期产生的影响。结果表明，在3个HGGs细胞中SR-4835处理均能够诱导G2-M细胞周期阻滞（图6C）。值得注意的是，在抑制剂处理的DIPG17细胞中出现明显的sub-G1期细胞群（sub-G1期代表样品中凋亡细胞部分），这与前文DIPG17细胞经SR-4835处理后凋亡水平均较高的结果（图3B）相符。

GBM和DIPG这2类HGGs是恶性程度最高、患者预后最差的胶质瘤类型，目前最大限度地手术并结合放化疗是针对它们的主要治疗方案^［4，14］，但其非特异损伤较大，患者预后差，亟需寻找精准有效的靶向治疗方法。近年来，大量研究表明表观转录调控因子是癌症的关键依赖基因和有效的治疗靶点。表观转录靶向策略在多种癌症研究模型中呈现出显著的治疗效果，多类表观转录靶向小分子药物进入肿瘤治疗的人体临床试验。鉴于DIPG和GBM中被报道过很多相同的表观转录治疗靶标与靶向策略^{［6，19-22］}，本研究计划通过对多个DIPG和GBM细胞系进行针对表观转录调控因子的功能基因组与靶向小分子药物库筛选分析，系统鉴定二者共同的表观转录治疗新靶点和新策略，并进一步进行体外功能验证与机制挖掘，以期为HGGs的靶向治疗提供参考。

筛选结果显示在本研究所测试的2个DIPG和2个GBM细胞系中均有显著抑制作用的表观转录靶向小分子共17个，多为HDAC和CDK的抑制剂，并且其中大部分在DIPG或GBM中已经有过报道^{［6，19-22］}，证明了筛选的可信度高。在CDK抑制剂中，本研究重点关注到了CDK12/13靶向小分子THZ531^［33］尚未在DIPG和GBM中被报道过。而在针对DIPG和GBM对CDK12/13生长依赖性的评估中，DepMap数据库中GBM细胞系的依赖性分析数据以及利用DIPG_BJ02细胞系进行的表观转录靶向的CRISPR-Cas9功能基因组筛选结果，均表明GBM和DIPG细胞对CDK12/13有显著依赖性（图1）。在此基础上，进一步利用多个GBM和DIPG细胞系验证了无论是用基于CRISPR-Cas9的遗传学方法或是2个不同的靶向CDK12/13的小分子抑制剂（THZ531和SR-4835）均能产生显著的体外肿瘤抑制效应（图2和图3）。以上结果均表明CDK12/13是很有潜力的HGGs治疗新靶标。

为了探究HGGs中靶向抑制CDK12/13拮抗肿瘤的分子机制，对SR-4835处理的DIPG细胞系DIPG17和pGBM细胞系SF188的RNA-seq结果进行分析，重点关注在2个细胞系中均表达下调的基因（Gfold<-1）。GO分析表明，这些基因显著富集于细胞周期、基因转录、RNA剪切以及DNA修复等已知的CDK12/13参与调控的多个生物学过程或功能；进一步的GSVA分析也证明了以上生物学过程或功能受到CDK12/13抑制剂的拮抗；再结合在SR-4835和THZ531处理的多个GBM和DIPG细胞系中所检测到的RNA Pol Ⅱ S2P水平下降，均说明研究所使用的CDK12/13靶向小分子抑制剂发挥了on-target的抑制作用。在此基础上，本研究首先针对CDK12/13抑制剂引起的DNA损伤修复功能失调进行了验证。已有研究^［26］发现肿瘤细胞中的多个DNA损伤修复基因对CDK12/13抑制剂引起的转录下调非常敏感，这与本研究在多个HGGs细胞系中的RT-qPCR验证结果一致（图5A）。同时，检测到了双链DNA损伤标志物γH2AX蛋白磷酸化水平在CDK12/13抑制剂处理之后发生上调（图5B），说明确实发生了DNA损伤的累积。GSVA分析结果还表明CDK12/13抑制剂主要下调双链DDR和同源重组修复相关基因（图4C）。以上结果均提示在GBM和DIPG中，CDK12/13抑制剂可能也像以往在众多肿瘤模型中报道^［38-39］过的那样，能够与放化疗或者PARPi产生协同抑制效应或合成致死效应。此外，已有研究^［40］表明当DNA损伤不能得到及时修复时，细胞将启动G2-M期DNA损伤检查点，防止损伤细胞进入有丝分裂，这与检测到的CDK12/13抑制剂可引起DIPG和GBM细胞发生G2-M期细胞周期阻滞的结果相符合（图6C）。同时，RNA-seq分析还发现了CDK12/13抑制剂可引起蛋白酶体介导的泛素化蛋白降解过程相关基因的表达显著下调（图6A）。而根据以往报道^［37］，靶向抑制蛋白酶体功能同样可以使肿瘤细胞发生G2-M期阻滞。综上所述，本研究推测抑制CDK12/13导致DDR下调和蛋白酶体介导的泛素化蛋白降解减少很可能共同构成细胞G2-M期阻滞的上游分子事件。另一方面，本研究注意到GBM和DIPG细胞受CDK12抑制剂处理后各自存在很多特有的表达显著下调基因，这提示不同的HGGs细胞可能对CDK12抑制剂具有一些差异性的反应（图4A）。因此，进一步挖掘不同肿瘤类型特有的CDK12靶向效应及相关分子机制将有望为该类药物的临床应用提供更精准的指导和参考。

已有研究^{［27，29，35］}报道在多个肿瘤预临床模型的体内治疗中，CDK12/13抑制剂确实通过下调DDR和诱导细胞周期阻滞发挥抑制作用，且可以与化疗药或者PARPi之间存在协同抗肿瘤作用。目前本研究相关的功能验证和靶向治疗均是基于细胞模型的体外实验，在今后的工作中本研究将进一步通过相应的体内实验来验证靶向抑制CDK12/13针对GBM和DIPG的治疗潜力，尤其是与现有放化疗之间的组合效应。值得注意的是，血脑屏障的存在限制了很多小分子药物进入脑部区域^［41］，使得GBM和DIPG的药物治疗面临更多的挑战。现有的CDK12/13抑制剂THZ531和SR-4835均未报道能通过血脑屏障。因此，未来CDK12/13抑制剂药物的临床应用还需要克服血脑屏障的问题。要解决这个问题，可开发新的可以通过血脑屏障的靶向小分子，或者依赖药物递送系统实现颅内给药。载药纳米颗粒对于中枢神经系统疾病的治疗已经过美国FDA批准进入临床试验阶段^［41］。通过对流增强递送（convection enhanced delivery，CED）可将载药纳米颗粒注入局部肿瘤实现颅内给药^［42］；细胞穿透肽（cell penetrating peptide，CPP）的阳离子电荷通过静电相互作用与脑内皮细胞膜表面结合有助于CPP修饰的纳米材料通过血脑屏障，将药物运输到大脑^［43］。载药纳米颗粒传递系统在DIPG和GBM中均有报道^［44-45］，因此该方法有望大大促进CDK12/13靶向新策略的体内验证与临床转化。