先天免疫系统是人类机体免疫防御的重要组成部分。微生物核酸被一系列宿主编码的模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）识别后，触发细胞内信号级联反应，激活Ⅰ型干扰素（interferon，IFN）以及促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-6等，这一系列过程是引发即时抗病毒反应和适应性免疫的先决条件^［1-2］。蛋白质泛素化修饰在调节先天免疫的过程中起关键作用，如抗原呈递、细胞分化、免疫防御和炎症反应等^［3］。E3泛素连接酶能够特异性识别靶蛋白，在泛素化途径中具有重要作用，并且参与细胞内的多种免疫调控，如：通过诱导髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）降解和TANK结合激酶1（TANK binding kinase 1，TBK1）活化，抑制Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）/核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信号转导^［4］；与NF-κB P65亚基结合，促进P65发生泛素化并降解，抑制NF-κB活化^［5］；促进干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）在K150处的泛素化及其降解，抑制干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）依赖性抗病毒信号转导等^［6］。

RBX1（ring-box protein 1）是一种RING结构蛋白，与S期激酶相关蛋白1（S-phase kinase-associated protein 1，SKP1）、CUL1（cullin 1）和F-box蛋白一起组成SCF（SKP1-CUL1-F-box）复合体。SCF复合体是一种重要的E3泛素化连接酶^［7］。研究^［8-12］表明，RBX1在多种肿瘤中表达异常，包括肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌和结肠癌，且与临床不良预后相关。如RBX1的高表达可促进三阴性乳腺癌的转移^［13］，也是小细胞肺癌患者不良预后的相关因素^［14］；RBX1低表达促进高级别浆液性卵巢癌前体细胞转变为卵巢癌细胞^［15］；RBX1可调控细胞周期，在神经胶质瘤细胞中，沉默RBX1可使细胞停滞在G₂/M期，并导致细胞衰老和凋亡，从而抑制肿瘤细胞生长^［9］。E3泛素化连接酶在免疫调控中发挥着重要作用，但RBX1作为E3泛素化连接酶的重要组成部分，对于肿瘤免疫相关基因的调控作用鲜有报道。

葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma，UVM）是成人最常见的眼内恶性肿瘤，极易发生复发、转移，患者预后差，且目前UVM的靶向治疗效果不佳，需要寻找新的治疗靶点^［16］。本研究旨在探索RBX1在UVM中对免疫相关基因的调控作用及可能的机制，为改善UVM肿瘤免疫治疗提供新的研究方向。

本研究使用的人UVM细胞系，包括92.1细胞系（上海雅吉生物科技有限公司）、MEL290细胞系和OMM2.3细胞系（2种细胞系均来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）。所有细胞系均用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养。

RPMI 1640培养液、Opti-MEM培养液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素-链霉素（美国Gibco），Lipofectamine^TM 2000（美国Thermo Fisher），荧光定量PCR预混液ChamQ SYBR qPCR Master Mix（中国诺唯赞），RBX1抗体（11922S，美国CST），β-肌动蛋白（β-actin）抗体（66009，美国Proteintech），信号转导与转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）抗体（14994S，美国CST），p-STAT1抗体（9167S，美国CST），荧光二抗（A21206，美国Invitrogen），RNA抽提试剂盒（美国EZBioscience），STAT1活化抑制剂fludarabine（美国Selleck）。

CO₂培养箱（美国Thermo Fisher），电泳装置、ChemiDoc凝胶成像仪（美国Bio-Rad），离心机（德国Eppendorf），Light Cycler 480Ⅱ定量PCR仪（美国Roche）。

使用GEPIA数据库（http：//gepia2.cancer-pku.cn/）和UALCAN网站（http：//ualcan.path.uab.edu/）完成癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中肿瘤患者的预后分析及各类肿瘤中RBX1基因表达情况分析。

转染前24 h提前将状态良好的细胞均匀接种到6孔板中，使转染时细胞密度为50%，转染时使用无抗生素培养液。在50 μL Opti-MEM培养液中加入200 μmol 小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），轻轻吹打混匀；在50 μL Opti-MEM 培液中加入5.0 μL Lipofectamine^TM 2000试剂，轻轻吹打混匀，并且室温静置5 min。将含有转染试剂和siRNA的培养液混合，轻轻吹打混匀，并室温静置15~20 min。将静置后的转染培养液加入6孔细胞板中，轻摇混匀。将细胞板置于37 ℃、5%CO₂培养箱中培养6~8 h后更换新鲜培养液，继续培养48 h后进行验证。所用siRNA序列见表1，序列设计及合成由吉满生物科技（上海）有限公司完成。

用RNA抽提试剂盒提取细胞RNA，取1 μg RNA进行反转录，得到cDNA。10 μL PCR反应体系：ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5 μL，cDNA模板5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL。每个样本设置3个复孔。上样结束后贴上透明膜并刮除气泡，离心60 s后放入定量PCR仪中按照设定程序扩增。以β-actin作为内参计算mRNA相对表达量。实时荧光定量PCR（qPCR）的引物序列见表2。

用胰酶消化细胞，在4 ℃离心机中离心收集细胞沉淀，经PBS缓冲液清洗后用Urea蛋白裂解液在冰上裂解30 min，在4 ℃下离心获得蛋白上清液，用酶标仪进行蛋白定量后与十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）一起煮沸，获得蛋白样品。取30 μg的蛋白样品上样后行蛋白凝胶电泳100 min，然后将蛋白质转膜到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%牛血清白蛋白溶液室温封闭1 h，洗膜后滴加一抗，4 ℃孵育过夜。次日洗膜后滴加二抗，在室温下孵育30 min，洗膜后在凝胶成像仪中成像并记录。

转录组测序（RNA sequencing，RNA-seq）由上海派森诺生物科技股份有限公司完成，每组设置2个生物学重复。使用TRIzol法提取siRBX1干预组（转染siRBX1-1或siRBX1-2）和对照组（转染siNC）92.1细胞的RNA，每个样品约需要1 μg的总RNA。在转录组文库构建完成并质检合格后上机测序，对各组样本进行基因表达水平定量。计算每个基因的每千个碱基的转录每百万映射读取的片段数（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，FPKM）值，对差异表达的基因进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）。

用fludarabine抑制细胞STAT1活性。以DMSO为溶剂，分别按fludarabine终浓度5 nmol/L和10 nmol/L加入细胞培养液，培养48 h后进行检测。对照组加入等体积DMSO。

应用GraphPad Prism 8软件进行数据的分析和处理。符合正态分布、方差齐性的定量资料的多组间比较采用方差分析，两两比较采用双尾非配对t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

为探索RBX1在肿瘤免疫中的作用，我们首先在GEPIA数据库中检索了RBX1基因在各种肿瘤中的表达情况。图1A显示RBX1基因在多种肿瘤中高表达。分析RBX1基因的表达与各肿瘤患者总生存率（overall survival）和无病生存率（disease free survival）的关系，结果（图1B）显示RBX1的高表达是UVM和肾上腺皮质癌（adrenocortical carcinoma，ACC）患者生存的显著不利因素。为探索RBX1与肿瘤的关系，我们通过UALCAN网站检索了TCGA数据库并进行分析，结果（图2）显示UVM和ACC临床分期较晚的患者，RBX1表达水平相对更高，且RBX1高表达的患者总生存期更短。

为探索RBX1在肿瘤免疫中的调控作用，我们选用了人UVM 92.1细胞、OMM2.3细胞和MEL290细胞为研究体系，转染siRNA，瞬时敲低RBX1。qPCR和Western blotting验证结果显示，siRBX1-1和siRBX1-2转染后92.1细胞、OMM2.3细胞和MEL290细胞中RBX1的mRNA及蛋白质表达水平均下降（图3）。

为进一步探索RBX1在UVM细胞中的功能，我们选取siRBX1干预组和对照组92.1细胞进行RNA-seq。GSEA分析发现：siRBX1-1干预组和对照组相比存在608个差异基因集，其中301个基因集在siRBX1-1干预组细胞中上调；siRBX1-2干预组和对照组相比也有608个差异基因集，其中252个基因集在siRBX1-2干预组细胞中上调。分析结果显示，除了之前报道过的细胞周期调控、DNA损伤修复相关通路外，我们还观察到部分差异基因富集到一些免疫相关通路（图4A）；差异基因在干扰素介导的信号通路上富集，且STAT1表达上调（图4B）。

已有研究报道，STAT1是由IFN-γ激活的转录调节因子^［17-18］，可调控CXCL9和CXCL10的表达^［19-20］。qPCR检测结果（图5A、B、C）显示，敲低RBX1后92.1、OMM2.3和MEL290细胞系的STAT1、CXCL9和CXCL10的mRNA表达均显著上调。Western blotting检测结果（图5D）显示，92.1细胞系中敲低RBX1后，STAT1蛋白表达和活化的p-STAT1蛋白表达水平上调。

为进一步探索RBX1是否通过STAT1来调控CXCL9和CXCL10的表达，使用STAT1抑制剂fludarabine进行研究。在6孔板中分别接种相同数量的OMM2.3细胞和MEL290细胞并转染siRNA干扰RBX1表达，干扰24 h后加入fludarabine（终浓度分别为5 nmol/L和10 nmol/L），并设置DMSO组作为对照组，处理48 h后通过qPCR检测STAT1下游基因CXCL9和CXCL10的mRNA表达。结果（图6）显示，加入STAT1抑制剂后，siNC组的CXCL9和CXCL10的表达被抑制，而siRBX1干预组的CXCL9和CXCL10被抑制程度更加显著，且在高浓度fludarabine（10 nmol/L）处理下，siRBX1干预组与siNC组的CXCL9和CXCL10表达水平基本一致。表明RBX1可能通过调控STAT1影响CXCL9和CXCL10的表达。

由于肿瘤的异质性，RBX1在不同类型的肿瘤中发挥不同的作用。RBX1作为SCF E3泛素化连接酶的重要组成部分，参与多种肿瘤发生发展。在高级别浆液性卵巢癌（high-grade serous ovarian cancers，HGSOC）中，RBX1表达的减少诱导细胞染色体不稳定，低表达的RBX1与HGSOC患者的不良预后相关^［15］；在肺癌细胞中，沉默RBX1基因能够诱导细胞衰老^［9］；在肝癌细胞中，沉默RBX1可诱导细胞G₂/M期停滞、细胞衰老和细胞自噬^［8］。而RBX1在葡萄膜黑色素瘤中的作用尚未见文献报道。

在本研究中，对TCGA数据库的分析结果显示RBX1在UVM中高表达，且显著影响患者的总生存期和无病生存期，在晚期的UVM患者中表达水平更高，因此推测RBX1在UVM中可能起重要作用。沉默92.1细胞的RBX1基因后，对RNA-seq结果进行GSEA分析，结果发现RBX1除了参与细胞周期和DNA损伤修复相关通路外，在免疫相关通路上也存在调控作用。研究^［4-6］表明，E3泛素化连接酶参与多种免疫调控，鉴于RBX1是E3泛素化连接酶的重要组成部分，我们推测RBX1在肿瘤免疫调节中也可能发挥重要功能。分析显示，92.1细胞中的RBX1被沉默后，STAT1的表达水平升高，qPCR和Western blotting的结果与RNA-seq的结果一致，提示STAT1的活性增强。在Janus激酶（Janus kinase，JAK）/STAT信号通路中，转录因子STAT1是IFN的关键效应因子，参与多种免疫反应^［17］。在经典免疫通路中IFN-γ通过JAK使STAT1活化，激活下游免疫通路^［21］。趋化因子CXCL9、CXCL10是介导T淋巴细胞迁移的最重要的趋化因子，已有研究^［19-20］表明STAT1可调控CXCL9和CXCL10的表达。但RBX1沉默后CXCL9和CXCL10的mRNA表达升高的机制仍不清楚。为进一步证实RBX1是否通过STAT1调控CXCL9和CXCL10的表达，我们利用STAT1的活化抑制剂fludarabine进行验证，结果显示在RBX1沉默的细胞中，原本升高的CXCL9和CXCL10 mRNA在fludarabine的作用下mRNA表达被抑制，表明RBX1可通过STAT1调控CXCL9和CXCL10的表达。由于本研究仅在转录水平上进行验证，因此仍不能确定RBX1是否通过其泛素化作用调控STAT1，未来仍需进一步研究。另外，本研究为体外细胞实验，RBX1在体内对免疫相关基因的调控作用仍需进一步验证。

综上所述，RBX1在UVM细胞中可能通过STAT1调控CXCL9和CXCL10的表达，在免疫调控中有重要作用，为UVM的靶向治疗提供了潜在的选择。