骨质疏松症、关节炎、佩吉特病、肿瘤性骨溶解，以及骨科植入物的无菌性松动都与骨溶解有关，骨溶解导致骨量减少、骨折风险增加^［1］。在口腔颌面部，颞下颌关节炎导致的骨溶解会引发髁突吸收，使患者张口受限，严重影响患者的生活质量。这些疾病有一个共同特点，即破骨细胞过度活化、骨吸收功能增强^［2］。骨代谢为一个动态均衡体系，其间成骨细胞的骨生成与破骨细胞的骨溶解相辅相成^［3］。作为已知唯一的专职执行骨吸收功能的细胞类型，破骨细胞在骨骼的发育、生长和代谢稳态中发挥关键作用^［4］。目前，治疗骨溶解性疾病的常用药物包括非甾体类抗炎药、双膦酸盐以及各类单克隆抗体药物；然而，这些药物的应用受限于显著的不良反应和高昂的成本^［5］。鉴于此，近年来降低破骨细胞活性和相应炎症反应的新药研发，已成为一个新的研究热点。

骨溶解通常伴随炎症过程，其明显特征是免疫细胞和破骨细胞的显著浸润^［6］。作为免疫系统的关键组成部分，巨噬细胞是分泌炎症因子的主要来源。巨噬细胞在核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）作用下，会发生分化并形成破骨细胞^［7］；即使在缺乏RANKL的条件下，多种炎症因子也能促使破骨细胞的形成^［8］。此外，炎症因子，如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等，与RANKL之间存在明显的协同效应，不仅能够激发RANKL及其受体（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）的表达，从而促进破骨细胞的形成，还能够加剧骨质吸收，进而加速炎症性骨溶解^［9］。因此，在骨溶解的微观环境中，协同调控骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophage，BMM）诱发的炎症过程与破骨细胞驱动的骨侵蚀尤为重要。

亚精胺（spermidine，SPD）是一种普遍存在于各类生物体的天然多胺物质，包括自细菌至人类体内。大量食物中都含有丰富的多胺，其中大豆、茶叶和蘑菇富含SPD^［10］。然而，瑞典青少年膳食调查^［11］显示，其多胺摄入量仅为（316±170）μmol/d，低于瑞典营养建议书中所推荐的541 μmol/d。作为一种多胺，SPD已被证明具有保护心脏和神经的作用^［12］。近年来，随着研究的深入，SPD在治疗类风湿性关节炎方面的作用也逐渐被发现^［13］。已有研究^［14］报道，同属多胺的精胺在胶原诱导的大鼠关节炎模型中对软骨和骨破坏具有一定的改善作用；然而另一方面，有研究^［15］发现，精胺对细胞的增殖和迁移具有促进作用，可能引起细胞的过度增殖，从而增加肿瘤发生的风险。本研究通过探究不同剂量SPD对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞功能及BMM分化为破骨细胞的影响，评估SPD在抑制巨噬细胞炎症反应和破骨细胞活性方面的作用，并探讨SPD对LPS诱导的小鼠颅骨骨溶解的治疗效果，旨在为骨溶解治疗提供潜在的思路和策略。

C57BL/6雄性小鼠，SPF级，6周龄，购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2022-0009。小鼠饲养于上海交通大学医学院附属第九人民医院实验动物中心SPF级屏障系统中，实验动物使用许可证号为SYXK（沪）2020-0025。饲养环境温度20~26 ℃，湿度40%~70%，光照周期为12 h/12 h明暗交替。

小鼠巨噬细胞系RAW264.7购自中国科学院细胞库。

SPD、二氯二氢荧光素乙酰酯（dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）染色液、苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，H-E）染色液（上海碧云天生物技术有限公司），胎牛血清（Avantor，美国），细胞培养基α-MEM、DMEM（HyClone，美国），大肠埃希菌来源的LPS（InvivoGen，美国），重组小鼠RANKL（RD，美国），重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）、Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒（MCE，美国），二氢乙锭（dihydroethidium，DHE）染色液（Proteintech，中国），RNA提取试剂盒（Axygen，美国），实时荧光定量PCR试剂（TaKaRa，日本），抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）。

倒置显微镜（ECLIPSE Ti-E，日本Nikon），实时荧光定量PCR仪（QuantStudio 5，美国Applied Biosystems），高分辨率Micro-CT扫描机（μCT100，瑞士SCANCO Medical AG）。

首先，将RAW264.7细胞接种至含10%胎牛血清的DMEM培养基中，并在37 °C、5% CO₂环境下培养。当RAW264.7细胞的汇合度达到80%~90%时，使用一次性无菌刮刀轻轻刮取并吹散细胞，进行传代培养。

小鼠原代BMM的制备方法参考文献［16］。从2只4~6周龄的C57BL/6雄性小鼠股骨和胫骨的骨髓腔中收集骨髓细胞，并将收集的细胞重悬于含30 ng/mL M-CSF的完全α-MEM培养基中，于37 ℃、5%CO₂的环境条件下培养。每隔2 d换1次培养基。待细胞汇合度达到80%~90%时，消化、传代。使用第1代BMM用于后续实验。

将对数生长期的RAW264.7细胞按2×10⁵个/孔接种至96孔板中，采用不同浓度的SPD（0、31.25、62.5、125、250、500、1 000 μmol/L）处理细胞，分别在96孔板中孵育24 h和48 h。处理完成后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育4 h，随后使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。

小鼠原代BMM以1×10⁴个/孔的密度接种于96孔板中，待细胞贴壁后，分别添加50 ng/mL的RANKL和不同浓度（250、500、1 000 μmol/L）的SPD，每2 d更换1次培养基，持续诱导5 d。之后，弃去培养液，用PBS清洗3次，加入4%的多聚甲醛溶液，在室温下固定15~20 min后，使用PBS清洗3次。加入TRAP染色液，在室温下染色10 min。弃去染色液后，再次用PBS清洗3次。采用倒置显微镜观察标本后，随机挑选5个视场进行摄影，继而利用ImageJ工具分析阳性多核细胞的数量。

将RAW264.7细胞接种于共聚焦培养皿中，接种密度为5×10⁴个/孔。待细胞贴壁后，分别加入100 ng/mL的LPS和不同浓度（250、500、1 000 μmol/L）的SPD，培养24 h。然后使用DCFH-DA和DHE染色液分别测定细胞内的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。

将小鼠BMM以5×10⁵个/孔的密度接种于6孔板。待细胞贴壁后，分别加入50 ng/mL的RANKL及不同浓度（500、1 000 μmol/L）SPD作用24 h。用试剂盒从各组细胞中提取总RNA，反转录合成cDNA。随后，配置实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）反应体系。扩增条件为：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Gapdh）基因作为内参基因，检测与骨吸收过程密切关联基因的表达，包括Trap、组织蛋白酶K（cathepsin K，Ctsk）、降钙素受体（calcitonin receptor，Ctr）以及树突状细胞特异性跨膜蛋白（dendritic cell-specific transmembrane protein，Dcstamp）。

将RAW264.7细胞接种于6孔板中，接种密度为4×10⁵个/孔。待细胞贴壁后，分别加入100 ng/mL的LPS和不同浓度（500、1 000 μmol/L）的SPD，培养24 h。用同样的方式检测RAW264.7细胞炎症相关因子Il6、Tnf、一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2，Nos2）的表达。

qPCR引物序列见表1。

LPS诱导的小鼠颅骨骨溶解模型是根据先前的研究方法^［17］建立的。选取24只6周龄的C57BL/6雄性小鼠，体质量为（20±2）g，并将其随机分为4组：假手术对照组、LPS组、SPD低剂量组和SPD高剂量组。首先，通过腹腔注射2%戊巴比妥溶液40 μL，深度麻醉小鼠；随后用去毛膏清除小鼠头部的毛发；沿颅骨长轴方向进行切割，运用剥离器细致地挑开骨膜。对LPS组、SPD低剂量组、SPD高剂量组的小鼠，在人字缝中央植入一块尺寸为4 mm×4 mm×2 mm、已浸润100 ng/mL LPS的明胶海绵；对照组则植入同体积的浸透PBS的明胶海绵。随后将创口严密缝合。3 d后，创口基本愈合，在LPS组和2个SPD干预组小鼠颅顶明胶海绵处皮下注射100 ng/mL LPS 10 μL；假手术组注射等体积的PBS。2个SPD干预组小鼠注射LPS同时，腹腔注射500 μmol/L（低剂量组）或1 000 μmol/L（高剂量组）SPD 200 μL；LPS和SPD注射频率均为1次/2 d，共注射7次。建模期间，各组小鼠均未出现不良反应或死亡。末次注射后次日，使用颈椎脱位法处死小鼠，断头后取颅骨。颅骨样本置于4%多聚甲醛中固定48 h，随后以流水冲洗过夜，最终保存于75%乙醇中。

使用Micro-CT扫描（分辨率9 μm，X射线源29 kV/175 μA，曝光时间300 ms）对颅骨样本进行扫描。感兴趣区域定义为骨吸收区周围的正方形区域，扫描后进行三维重建和定量形态学分析，计算骨体积分数（bone volume/trabecular volume，BV/TV）和骨矿物质密度（bone mineral density，BMD）。

将颅骨样本浸泡在10% EDTA溶液（pH=7.4）中作脱钙处理，并置于常温下。每3 d更换1次脱钙液，脱钙过程持续4周。脱钙完成后，样本依次经过脱水、浸蜡、包埋以及切片处理。组织切片分别经过H-E染色和TRAP染色后，于显微镜下观察。

利用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。正态分布的定量资料用x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

为了排除SPD对细胞的毒性作用，通过CCK-8实验评估SPD对细胞活力的影响。结果（图1）显示，1 000 μmol/L SPD在干预24 h和48 h后对RAW264.7细胞活性没有显著的影响，说明1 000 μmol/L及以下浓度的SPD对巨噬细胞无明显毒性。

DCFH-DA主要用于检测细胞内的总ROS。如图2A、C所示，经过LPS激活后，RAW264.7细胞中ROS水平显著升高；在不同浓度SPD的作用下，细胞内ROS水平显著下降。

DHE主要用于检测细胞内的超氧阴离子水平。如图2B、D所示，经LPS激活后，RAW264.7巨噬细胞内的超氧阴离子水平显著升高，而经过不同浓度SPD处理后，细胞内超氧阴离子水平呈下降趋势。

反转录qPCR（reverse transcription qPCR，RT-qPCR）分析结果（图3）表明，LPS刺激可显著提高RAW264.7细胞促炎基因Nos2、Tnf和Il6的mRNA表达水平。与LPS组相比，500 μmol/L和1 000 μmol/L SPD处理组细胞促炎基因的表达减少，并且表现出一定的浓度依赖性。这些结果表明，SPD对LPS诱导的巨噬细胞促炎基因表达具有抑制作用。

我们通过体外实验研究SPD对RANKL诱导的小鼠原代BMM向破骨细胞分化的影响。如图4所示，原代BMM经RANKL诱导后，形成大量TRAP阳性的多核破骨细胞，而SPD处理后，TRAP阳性破骨细胞的数量和面积减少，呈一定剂量依赖性；尤其是500 μmol/L和1 000μmol/L的SPD显著抑制破骨细胞的生成。可见，SPD可以抑制RANKL诱导的破骨细胞分化。

破骨细胞相关基因的表达代表了BMM向破骨细胞分化的能力，RANKL刺激引起的骨吸收和破骨细胞形成通常伴随着这些特异性标志基因的上调。为了研究SPD的抗破骨细胞分化的作用，我们通过RT-qPCR检测Ctsk、Ctr、Trap、Dcstamp基因的表达情况，结果（图5）显示：与对照组相比，破骨诱导组Ctsk、Ctr、Trap、Dcstamp基因的表达显著增加；而与破骨诱导组相比，1 000 μmol/L SPD处理组这4个基因的mRNA表达显著降低。

接下来，我们研究SPD是否在体内对破骨细胞引起的骨溶解具有潜在的治疗作用。Micro-CT影像及三维重建图像（图6A、B）显示：LPS组颅骨表面出现广泛的骨溶解，表现为大量深大的吸收陷窝；SPD处理的小鼠颅骨骨溶解明显减少，高剂量组小鼠颅骨表面未见明显的吸收陷窝。定量形态学分析（图6C、D）显示，与LPS组相比，2个SPD处理组BV/TV和BMD显著升高，高剂量组的BV/TV和BMD接近于假手术对照组。

H-E染色结果（图7A）显示：在LPS组小鼠的颅骨样本中，观察到大面积的溶骨性损伤以及炎症细胞浸润，证明模型构建成功；而2个SPD处理组炎症细胞浸润减少，组织受损程度减轻。TRAP染色结果（图7B）显示：LPS组的骨小梁边缘区域出现大量TRAP阳性破骨细胞，且分布密集；与之相比，SPD处理组中破骨细胞的数量明显减少。提示SPD对于LPS诱导的骨溶解中炎症细胞浸润及破骨细胞生成具有一定的抑制作用。

破骨细胞与成骨细胞共同作用以维持骨稳态。骨溶解属于骨稳态失衡的一种，即破骨细胞过度形成和激活，引发广泛的骨破坏^［18］。骨溶解通常与炎症反应密切相关。炎症反应可导致骨吸收加速，引发一系列以骨溶解为主要特征的疾病，包括骨关节炎、骨质疏松、假体周围无菌性松动等^［19］。然而，现有的临床治疗药物常伴随骨坏死、消化道不适，以及药物过敏等不良反应。因此，急需研发一种新型药物，旨在高效预防和治疗炎症性骨溶解。SPD作为一种广泛存在于人体的多胺，具有抗炎^［20］、抗氧化^［21］、抗肿瘤^［22］、延缓衰老^［23］等多重效应。已有研究^［14］表明，SPD在改善大鼠关节炎方面具有一定的作用。

小鼠RAW264.7细胞与破骨细胞的基因谱相似^［24］；作为破骨细胞的前体细胞，它是研究破骨细胞的重要工具。破骨细胞由单核巨噬细胞系或骨髓间充质干细胞在RANKL的诱导作用下融合形成^［25］。本研究采用RANKL诱导体系，在体外成功将BMM分化为破骨细胞，并观察到多核破骨细胞的形成。本研究采用CCK-8法探究SPD干预RAW264.7细胞的安全浓度范围（0~1 000 μmol/L），然后选取250、500、1 000 μmol/L浓度的SPD开展后续实验。巨噬细胞在受到炎症因子刺激时，会激活呼吸爆发机制^［26］，致使线粒体功能变异^［27］、氧气消耗显著增加，从而导致大量ROS的生成^［28］。本研究中，我们发现在1 000 μmol/L SPD作用下，DCFH-DA和DHE的荧光强度，与未经LPS刺激的对照组细胞相近，表明SPD对ROS生成具有一定的抑制作用。同时，SPD对LPS刺激后的巨噬细胞炎症相关因子（Nos2、Tnf、Il6）基因的表达水平，呈剂量依赖性抑制作用，表明SPD具有一定的抗炎作用。TRAP由破骨细胞产生，是骨溶解性疾病诊断和监测的重要指标^［29］。TRAP染色结果显示，SPD能够显著抑制BMM向破骨细胞的分化。这一发现对于临床治疗骨溶解性疾病具有重要的参考价值。通过RT-qPCR检测，我们发现，BMM在RANKL诱导下，参与破骨细胞前体细胞融合的Dcstamp基因、影响骨组织钙磷代谢的Ctr基因以及编码骨吸收所需蛋白水解酶的Trap和Ctsk基因的表达水平显著升高；而经过1 000 μmol/L SPD干预后，这些基因的表达水平显著下降。这进一步提示，SPD可能对破骨细胞的形成、扩散及骨吸收功能具有抑制作用。

骨溶解性疾病的标志性特征是破骨细胞介导的过度骨丢失^［30］。为了深入探讨SPD在体内的效应，我们建立了由LPS诱导的小鼠炎症性颅骨骨溶解模型。该模型被广泛应用于骨溶解的研究，能够有效模拟局部骨缺损和骨吸收等现象，因此在一定程度上可反映骨溶解性疾病的某些临床特征。骨溶解性疾病的主要表现为骨吸收过度和骨质疏松等，这些变化在这个模型中也可以观察到。LPS为革兰阴性菌细胞壁的关键成分，能模拟体内炎症性骨质破坏的过程^［31］。Micro-CT分析显示，SPD可显著改善由LPS诱导的颅骨骨溶解现象，BV/TV及BMD量化指标显著优于LPS组。同样地，组织形态学方法也进一步证实，SPD可抑制由LPS诱导的炎症反应、破骨细胞激活，以及骨组织丢失。

然而，本研究仍然存在一些局限性。首先，尽管SPD在体外展示了抑制巨噬细胞炎症反应与破骨细胞分化的作用，但未能深入探讨其中的具体机制。其次，SPD在更高剂量下的毒性及治疗效果有待进一步探究。最后，SPD是否能够通过口服途径抑制炎症性骨溶解尚不清楚。

综上所述，SPD在体外能够有效抑制巨噬细胞的炎症反应，以及RANKL诱导的破骨细胞分化；在实验动物模型中，SPD可改善由LPS诱导的小鼠炎症性颅骨骨溶解。这一发现揭示SPD在防治骨溶解相关疾病中具有潜在的应用价值。