近年来，炎症反应在DN发病机制中的作用备受关注［5］。核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信号通路是调控炎症反应的关键通路之一，其异常激活可导致DN患者足细胞损伤、肾小球硬化和肾间质纤维化［6］。研究表明，NF-κB通路的激活可促进多种炎症因子［如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin -6，IL-6）］的表达，进而诱导足细胞凋亡和上皮-间质转化。TNF-α可通过ROS依赖途径激活NF-κB，诱导足细胞中裂孔隔膜蛋白表达减少，加重足细胞损伤［7］。高糖或脂毒性环境下，NF-κB的激活进一步上调烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）表达，导致氧化应激加剧［8］。此外，线粒体膜电位下降和细胞色素C释放可促进足细胞凋亡［8］。高糖还可以通过Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/NF-κB通路上调B细胞淋巴瘤2相关X蛋白（B-cell lymphoma 2- associated X protein，Bax）表达，诱导足细胞凋亡［9］。因此，抑制NF-κB信号通路可能成为治疗DN的策略之一。
传统中药及其活性成分具有多靶点、低毒性的特点，已经在DN治疗中展现出广阔的应用前景［10］。金丝桃素（hypericin，HYP）是从金丝桃属植物中提取的一种天然化合物，为萘骈二蒽酮类化合物，可发出明亮的橘红色荧光，是一种良好的光敏剂［11］。HYP具有抗抑郁、抗病毒［包括人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）］及抗肿瘤等活性［12-14］。随着研究的深入，发现其还具有降糖、抑制肥胖、抗炎等多种作用［15-16］。然而，HYP能否减轻db/db小鼠足细胞损伤及其可能的机制未见报道。因此，本研究通过建立db/db小鼠DN模型和高糖诱导的足细胞损伤模型，研究HYP对DN足细胞损伤的影响及其作用机制。
1 对象与方法
1.1 实验动物、细胞及其培养
18只雄性C57 BLKS/J db/db小鼠（瘦素受体突变）和6只db/m小鼠，6周龄，体质量为30~35 g，购自赛业（苏州）生物科技有限公司，生产许可证号为SCXK（苏）2022-0016。小鼠饲养于普陀区中心医院的SPF级动物房。使用许可证号为SYXK（沪）2022-0002。
永生化的人源足细胞（human podocyte，HPC）由美国西奈山医学院何慈江教授惠赠。使用RPMI-1640完全培养基［含10%澳洲胎牛血清、1%青霉素-链霉素、1%胰岛素-转铁蛋白-硒培养基补充剂（insulin - transferrin-selenium media supplement，ITS-G）］于33 ℃、5% CO2培养箱中培养。当细胞融合度达70%时，转入37 ℃、5% CO2培养箱，培养分化7d用于后续实验，分化时使用不含ITS-G的RPMI-1640完全培养基。
1.2 主要试剂和仪器
HYP［TargetMol，美国；纯度为99%，由二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO；MCE，美国）溶解后-20 ℃避光保存］，澳洲胎牛血清（Sigma，美国），RPMI-1640培养基、青霉素-链霉素混合液、ITS-G（Gibco，美国），无水葡萄糖、RPMI-1640无糖培养基（北京兰杰柯科技有限公司），增强型RIPA裂解液（武汉博士德生物工程有限公司），BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），SDS PAGE胶配制试剂盒（上海雅酶生物医药科技有限公司），彩色预染蛋白Marker（Thermo Fisher，美国），PVDF膜（Millipore，美国），磷酸化细胞核因子NF - κB p65（phosphorylated nuclear factor - κB p65，p - NF - κB p65）、细胞核因子NF - κB p65（nuclear factor - κB p65，NF- κB p65）抗体（CST，美国），兔源一抗Wilms瘤1（Wilms tumor 1，WT-1）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔IgG（Abcam，美国），TNF-α、IL-1β、IL-6、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）的ELISA检测试剂盒（欣博盛生物科技有限公司），PCR引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］，苏木精-伊红（hematoxylin - eosin，HE）染液、过碘酸-希夫（periodic acid - Schiff，PAS）染液（武汉塞维尔生物科技有限公司），甘油三酯（triglyceride，TAG）测定试剂盒、总胆固醇（total cholesterol，TC）测定试剂盒、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）测定试剂盒、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）测定试剂盒、小鼠血肌酐（serum creatinine，Scr）的ELISA检测试剂盒、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）测试盒（南京建成生物工程研究所），小鼠尿白蛋白抗体（Bethyl，美国），小鼠尿肌酐（urine creatinine，Ucr）检测试剂盒（Cayman Chemical，美国）。化学发光成像仪、全波长多功能酶标仪、电泳仪、转膜仪、PCR仪（Bio-Rad，美国），荧光显微镜（Olympus，日本），活体成像仪（Caliper，美国）。
1.3 动物和细胞分组
db/db小鼠适应性喂养2周后随机分为3组，每组6只，分别为模型组（db/db）、db/db+HYP低剂量组（db/db+HYP-L，1.5 mg/kg）、db/db+HYP高剂量组（db/db+HYP-H，3.0 mg/kg），将6只同龄db/m小鼠作为正常对照组db/m。HYP给药方式及剂量参考相关文献［17］，正常对照组和模型组小鼠给予等体积的生理盐水腹腔注射，隔天给药，连续8周。
将HPCs分为正常糖组（5.5 mmol/L glucose，NG）、甘露醇组（5.5 mmol/L glucose+24.5 mmol/L mannitol，MA）、高糖组（30.0 mmol/L glucose，HG）、高糖+HYP低剂量组（HG+0.05 μg/mL HYP）、高糖+HYP高剂量组（HG+0.20 μg/mL HYP）。细胞培养48 h后用于后续实验。
1.4 样本采集
分别在给药0、2、4、6、8周记录各组小鼠的空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、体质量、摄食量及饮水量。在最后一次给药结束后将动物禁食过夜，次日早晨给予异氟烷麻醉处理，安乐死后取血离心保存血清，取双侧肾脏皮质，左肾皮质用于肾脏病理检测，右肾皮质用于蛋白表达检测。
1.5 细胞毒性和增殖实验
使用CCK-8实验试剂盒评估HYP对HPCs的细胞毒性，将对数期的HPCs以1×104/mL的密度接种于96孔板中，分别用不同浓度的HYP（0、0.05、0.10、0.20、0.30 μg/mL）处理，通过计算细胞活力评估药物细胞毒性。在高糖情况下孵育12、24、48、72 h，确定高糖诱导足细胞损伤模型的最佳孵育时间。在高糖诱导足细胞损伤模型设不同浓度HYP（0、0.05、0.10、0.20 μg/mL）处理HPCs，观察HYP对该模型下HPCs增殖能力的影响。在37 ℃、5% CO2条件下培养细胞48 h后，每孔加入100 μL的CCK-8工作液，在37 ℃培养箱中继续培养2 h，用酶标仪测定各孔在波长为450 nm处的吸光度。
1.6 HYP在 db/db 小鼠肾脏中的分布
单剂量尾静脉注射HYP（5 mg/kg），给药4 h后观察HYP在小鼠体内的分布（激发波长590 nm，发射波长660 nm）。
1.7 生化指标及炎症因子含量检测
使用相关的ELISA试剂盒检测尿白蛋白，比色测定试剂盒定量Ucr，通过尿白蛋白/肌酐比值（urinary albumin -to-creatinine ratio，UACR）评估尿蛋白水平。利用ELISA试剂盒检测各组小鼠血清INS、TC、TAG、LDL、HDL，以及炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1。
1.8 肾脏病理检测
用4%多聚甲醛固定小鼠肾脏，经乙醇溶液梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片（厚度2 μm）；依次经二甲苯脱蜡、乙醇溶液梯度水化后，进行HE、PAS染色；封片后使用显微镜观察肾小球结构及糖原聚集情况。将肾脏皮质切成约2 mm×2 mm×2 mm大小的组织块，用预冷的2.5%戊二醛固定，透射电子显微镜观察肾组织超微结构。
1.9 肾组织免疫组化
石蜡切片烤片3 h后，脱蜡处理；使用1×EDTA缓冲液，对切片进行抗原修复；每张切片滴加3 % H2O2溶液，室温孵育10 min；PBS冲洗后，用山羊免疫血清封闭，室温孵育10 min后甩去多余液体；滴加WT-1抗体（1∶200），4 ℃冰箱过夜，次日从冰箱取出切片恢复至室温后，每张切片滴加生物素标记的山羊抗兔IgG，于37 ℃孵育1 h，PBS洗涤后，用二氨基联苯胺显色，最后使用苏木精染核15 s，中性树胶封片。结果判定标准及方法：阳性表达的部位显色呈棕黄色，且其显色强度明显高于其背景无特异性染色的部位，细胞核显色呈浅蓝色。
1.10 肾脏组织及细胞蛋白表达检测
取小鼠肾脏皮质，加入含有1%磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，进行匀浆裂解；裂解后，于4 ℃，12 000×g条件下离心15 min，随后提取总蛋白。提取HPCs总蛋白时，其余操作与提取小鼠肾脏皮质总蛋白相同。使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白质定量。提取的总蛋白经变性后进行上样，电泳，经过转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育，最后进行显影。检测肾皮质和HPCs中WT-1、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达情况。使用ImageJ软件分析，取β-actin蛋白为内参，以“目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值”计算目的蛋白相对表达量。
1.11 实时荧光定量PCR
收集经48 h孵育的HPCs，使用RNA提取试剂盒提取总RNA，再使用反转录试剂盒合成cDNA。qPCR反应体系20 μL：SYBR Green Master Mix 10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.4 μL，下游引物（10 μmol/L）0.4 μL，模板cDNA 4 μL，ddH2O 5.2 μL。反应条件：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 10 s，退火/延伸60 ℃ 30 s，循环次数40次。采用
表1 引物序列
Tab 1
| Gene | Forward primer (5′→3′) | Reverse primer (5′→3′) |
|---|---|---|
| TNF-α | GGCAGGTTCTGTCCCTTTCA | CTGTGCTCATGGTGTCTTTTCTG |
| IL-1β | CTACAGGCTCCGAGATGAACAAC | TCCATTGAGGTGGAGAGCTTTC |
| IL-6 | ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG | CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG |
| MCP-1 | CAGCCAGATGCAATCAATGCC | TGGAATCCTGAACCCACTTCT |
| β-actin | CATGTACGTTGCTATCCAGGC | CTCCTTAATGTCACGCACGAT |
1.12 统计学方法
采用GraphPad Prism 9.5软件进行数据统计分析。符合正态分布的定量资料以x±s表示，多组间的差异比较使用单因素方差分析；不符合正态分布或方差不
齐的定量资料以M（Q1，Q3）表示，用秩和检验（Kruskal-Wallis）进行组间比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 HYP在 db/db 小鼠肾脏和HPCs中的分布
图1
图1
金丝桃素在 db/db 小鼠肾脏和HPCs中的分布
Note： Fluorescence intensity in the organs of db/db mice at 4 h after intravenous injection of HYP (5 mg/kg). A. In vivo imaging showed fluorescence intensity. B. Line graph of background-subtracted fluorescence intensity in various organs. ①P=0.021, compared with the heart. C. Fluorescence intensity of HYP in HPCs at different time points (×200). Scale bar=20 μm.
Fig 1
Distribution of HYP in the kidneys of db/db mice and HPCs
2.2 HYP减少 db/db 小鼠饮水量、尿量、摄食量，减轻体质量
图2
图2
db/db 小鼠糖尿病代谢表型的多参数动态分析
Note： HYP reduced water intake, urine output, food consumption, and body weight in db/db mice. A. Water intake. B. Urine volume. C. Food intake. D. Body weight. ①P=0.007,②P=0.034,③P=0.023,④P=0.042, compared with the model group (n=6).
Fig 2
Dynamic multi-parameter analysis of diabetic metabolic phenotypes in db/db mice
2.3 HYP降低了 db/db 小鼠INS水平，改善其糖脂代谢紊乱
图3
图3
HYP干预对 db/db 小鼠糖脂代谢的影响
Note： HYP reduced insulin levels and ameliorated glucose and lipid metabolic disorders in db/db mice. A. Insulin levels. B. Fasting blood glucose levels. C. Total cholesterol (TC). D. Triglycerides (TAG). E. Low-density lipoprotein (LDL). F. High-density lipoprotein (HDL). ①P<0.001, compared with the db/m group; ②P=0.003,③P=0.027, ④P=0.032,⑤P=0.006,⑥P=0.017,⑦P=0.002, compared with the model group (n=6).
Fig 3
Effect of HYP intervention on glucose and lipid metabolism in db/db mice
2.4 HYP改善 db/db 小鼠肾脏功能
图4
图4
HYP对 db/db 小鼠肾功能的改善
Note： HYP ameliorated renal function in db/db mice. A. Scr. B. BUN. C. UACR. ①P<0.001, compared with the db/m group; ②P=0.003,③P=0.006,④P=0.026, compared with the model group (n=6).
Fig 4
Hypericin ameliorates renal dysfunction in db/db mice
2.5 HYP改善 db/db 小鼠足细胞损伤
对各组小鼠肾脏组织进行HE、PAS染色、免疫组化检测及透射电镜观察，结果（图5）显示：与正常对照组相比，模型组的肾小球体积显著增大，系膜基质出现增生；肾小球内WT-1表达明显减少，足细胞足突发生融合、消失。经HYP干预后，上述病理改变得到明显改善：肾小球体积缩小，系膜基质增生减少；肾小球内WT-1表达显著增加；足细胞足突融合现象显著减轻。以上结果提示，HYP能够减轻db/db小鼠的足细胞损伤，具有足细胞保护作用。
图5
图5
HE、PAS染色、免疫组化、透射电镜评估肾组织病理学变化
Note： HYP ameliorated podocyte injury in db/db mice. A. HE staining showed histopathological changes in glomeruli across groups (×400). B. PAS staining revealed glomerular basement membrane thickness and mesangial matrix expansion in each group (×400). C. WT-1 expression in mouse glomeruli from different groups (×400). D. Transmission electron microscopy showed podocyte foot process effacement (×20 000). Scale bars=20 μm (A, B, C); 500 nm (D).
Fig 5
Renal histopathological changes were evaluated by HE staining, PAS staining, immunohistochemistry, and transmission electron microscopy
2.6 HYP提高高糖下调的HPCs活力
首先，我们检测HYP对HPCs的细胞毒性，结果显示：分别用0.05、0.10、0.20、0.30 μg/mL的HYP处理后，0.30 μg/mL HYP对细胞活力有明显抑制作用，0.20 μg/mL及以下各浓度间细胞活力无显著差异。这表明0.20 μg/mL及以下浓度的HYP对HPCs活性无抑制作用（图6A，P=0.037）。随后，我们分别使用30.0 mmol/L高糖处理HPCs 12、24、48、72 h，结果显示：48 h后，HPCs出现明显损伤，因此选择48 h来构建HPC高糖诱导的足细胞损伤模型（图6B，P=0.008）。为评估HYP对HPCs增殖的影响，分别用不同浓度的HYP在高糖条件下处理HPCs 48 h，结果显示：0.30 μg/mL HYP对细胞增殖有一定抑制作用，0.20 μg/mL及以下各浓度组对细胞增殖无抑制作用且提高了高糖下调的HPCs活力（图6C，P=0.016，P=0.009）。基于上述结果，0.05 μg/mL和0.20 μg/mL均属于HYP对HPCs的无细胞毒性浓度范围，二者可形成一定的浓度梯度，便于后续探究HYP干预高糖诱导HPCs损伤的剂量依赖性效应，故选取这两个浓度用于后续实验。
图6
图6
HYP对高糖诱导的HPCs细胞活力的影响
Note： HYP restored the viability of HPCs downregulated by high-glucose-induced. A. Cell viability of HPCs cultured under normal glucose conditions with different concentrations of HYP. B. Cell viability of the high-glucose-induced HPCs at different time points. C. Cell viability of the high-glucose-induced HPC model after intervention with different concentrations of HYP. ①P=0.037, compared with the 0 group. ②P=0.008, ③P=0.016, ④P=0.009, compared with the NG group.
Fig 6
Effects of HYP on the viability of high-glucose-induced HPCs
2.7 HYP下调炎症因子表达
为探究HYP对多种炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1）表达的影响，我们检测了不同组小鼠血清中炎症因子的表达水平，结果显示：正常对照组小鼠血清中各炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1）的表达量均较低。与之相比，模型组小鼠血清中各炎症因子水平均显著上调（图7A，均P<0.001）。经HYP干预后，HYP干预组小鼠血清中各炎症因子的水平均明显下调（图7A，均P<0.001）。进一步的体外实验表明，NG组及MA组各炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1）mRNA水平均较低，HG组各炎症因子mRNA水平明显上调（图7B，均P<0.001）。与HG组相比，HG+HYP组各炎症因子mRNA水平明显下调（图7B，均P<0.001）。体内和体外研究结果均表明，HYP能够抑制炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1）的释放，提示HYP在调控足细胞炎症损伤中发挥重要作用。
图7
图7
HYP下调炎症因子表达
Note：Inflammatory cytokine levels across groups. A.
Fig 7
HYP downregulates the expression of inflammatory cytokines
2.8 HYP对WT-1蛋白及NF-κB信号通路蛋白表达的影响
为了明确HYP改善DN足细胞损伤的可能机制，我们检测了WT-1蛋白及p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表达水平。结果表明：与正常对照组比较，模型组小鼠肾组织中WT-1蛋白表达显著减少，而p-NF-κB p65/NF-κB p65表达水平的比值显著升高（图8A，均P<0.001）；与模型组相比，HYP干预后小鼠肾组织中的WT-1蛋白表达明显增加，而p-NF-κB p65/NF-κB p65的比值显著降低（图8A，P=0.003，P=0.002）。进一步体外实验发现，与NG组及MA组相比较，HG组WT-1蛋白水平明显下调，而p-NF-κB p65/NF-κB p65比值显著上调（图8B，均P<0.001）；和HG组相比，HG+HYP组WT-1蛋白水平明显上调，而p-NF-κB p65/NF-κB p65比值显著下调（图8B，均P<0.001）。以上结果提示，HYP减轻db/db小鼠足细胞损伤，其作用机制可能与上调WT-1蛋白及抑制NF-κB通路蛋白表达有关。
图8
图8
蛋白质印迹法检测HYP对WT-1蛋白及NF-κB信号通路蛋白表达的影响
Note： The effect of HYP on the expression of WT-1 protein and NF-κB signaling pathway-related proteins. A. Western blotting analysis of WT-1, p-NF-κB p65, NF-κB p65, and β-actin protein expression. (①P<0.001, compared with the db/m group; ②P=0.003, ③P=0.002, compared with the model group; n=3). B. Western blotting analysis of the protein expression levels of WT-1, p-NF-κB p65, NF-κB p65, and β-actin in HPCs. Quantitative analysis of WT-1, p-NF-κB p65, and NF-κB p65. (④P<0.001, compared with the NG group; ⑤P<0.001, compared with the HG group).
Fig 8
Effect of HYP on WT-1 and NF-κB signaling pathway protein expression analyzed by Western blotting
3 讨论
DN是导致终末期肾衰竭和血液透析的主要原因之一，足细胞损伤是促使DN病情发展的重要因素，然而目前对DN的治疗尚不能逆转足细胞损伤。应用传统中药及其提取物治疗DN，一直是我们重点的研究方向之一。HYP是传统中药贯叶连翘（Hypericum perforatum）的主要活性成分。近年来研究发现，其具有显著的降糖、调脂及肾脏保护作用［18-19］。例如，HYP可通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）通路，促进外周组织对葡萄糖的摄取，并抑制肝脏糖异生，从而显著降低链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠FBG水平［20］；还可以通过激活蛋白激酶A催化亚基α（protein kinase A catalytic subunit α，PKACα）通路加速脂肪酸分解，并抑制固醇调节元件结合蛋白1c（sterol regulatory element-binding protein 1c，SREBP-1c）活性、减少脂质生成［20］。该研究提示HYP在DN治疗中具有潜在的应用前景。
本研究借助db/db小鼠构建DN模型，并利用HYP自发光的特性，发现HYP优先在db/db小鼠肾脏聚集，提示HYP具有肾脏特异性。此外，HYP还能够被人足细胞摄取，提示其可能在足细胞中发挥重要的药理作用。进一步研究表明，与模型组相比，HYP干预后能显著降低db/db小鼠的血糖及血脂水平，改善其胰岛素抵抗状况，提升db/db小鼠肾功能并减少尿蛋白水平，显著上调WT-1表达，修复足细胞足突融合，减轻足细胞损伤，提示HYP具有足细胞保护作用。
炎症反应在DN发生发展中起着关键作用，糖尿病小鼠体内存在多种炎症因子的表达上调，包括TNF-α、IL-1β和IL-6等［21］。本研究通过ELISA和qPCR分别检测db/db小鼠血清及高糖诱导足细胞损伤模型中上述炎症因子的表达，与对照组相比，HYP干预能够显著降低上述炎症因子表达，证实了其具有抗炎作用。众所周知，NF-κB的过度激活会导致促炎细胞因子（如TNF-α、IL-1β和IL-6）的过度表达，加剧足细胞损伤［22］。药理学研究已经证明，HYP具有调节NF-κB信号通路的作用。例如，HYP作为NF-κB的非抗氧化抑制剂，可减少IL-6的表达［23］；通过黑色素瘤分化相关基因5（melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5）信号途径上调Ⅰ型干扰素的mRNA表达，并通过NF-κB信号途径下调Il-6、Tnf-α mRNA表达，发挥抗传染性支气管炎病毒的作用［24］；HYP光动力疗法治疗人类风湿性关节炎的作用，至少部分是通过诱导细胞内活性氧生成、调控细胞凋亡通路及抑制NF-κB信号通路来实现的［25］；HYP还能抑制细胞因子诱导的胰岛β细胞NF-κB通路活化，减轻胰岛β细胞损伤［26］。因此，我们推测HYP可能通过调节NF-κB信号通路抑制炎症反应，发挥保护足细胞的作用。研究结果证实，HYP能够抑制db/db小鼠肾组织和人足细胞系p-p65的磷酸化，降低TNF-α、IL-1β等炎症因子水平，与其在肝纤维化及神经炎症模型中的抗炎机制一致［20，27］。
综上所述，本研究证明HYP可通过上调WT-1的表达以及抑制NF-κB信号通路介导的相关炎症因子释放，减轻足细胞损伤，这为HYP的临床应用提供了更多的参考数据。尽管本研究初步阐明了HYP减轻db/db小鼠足细胞损伤的作用机制，但仍存在一些局限性。后续研究将聚焦HYP调节NF-κB通路的具体靶点，以及开发肾脏特异性纳米载体以降低全身暴露带来的潜在毒性，为将来的临床转化提供更多的实验依据。
参考文献
