感染性疾病是导致死亡的主要原因之一，如何对其精准治疗并提高患者预后是亟待解决的问题。机体免疫应答在感染的发生、发展和转归中起到重要作用，其中固有免疫是抵抗病原体入侵的第一道防线。作为最重要的固有免疫细胞之一，巨噬细胞可吞噬、杀伤病原体，并通过产生大量细胞因子及趋化因子诱导强烈的免疫炎症反应^［1-2］。当遭受病原体刺激后，巨噬细胞会进行代谢重编程，将主要产能途径转变为糖酵解。该过程可产生包括乳酸在内的大量中间代谢产物，并且乳酸已被证明可通过多种方式在免疫调节中发挥作用^［3-6］。

组蛋白翻译后修饰是表观遗传调控最重要的方式之一，其可通过影响染色质构象调控下游基因转录，进而在生理病理过程中发挥作用^［7］。近年来，已有多种组蛋白修饰被证明与固有免疫相关，可调节巨噬细胞功能并参与感染进程^［8］。2019年，有研究^［9］首次发现乳酸可作为反应底物在巨噬细胞中修饰组蛋白H3第18位赖氨酸（H3K18）位点，并在感染晚期调节巨噬细胞向M2型极化。但组蛋白乳酸化修饰是否可以调控感染早期的巨噬细胞功能，其在巨噬细胞内又是如何被调控的尚不清楚。因此本研究通过建立巨噬细胞感染早期模型，明确感染早期巨噬细胞不同位点组蛋白乳酸化修饰的变化及其机制，揭示组蛋白乳酸化对感染早期巨噬细胞的功能调控作用，旨在为感染性疾病宿主控制炎症和改善预后提供新的靶点。

人单核细胞白血病THP-1细胞及人胚胎肾上皮细胞系HEK 293T均购自中国科学院上海细胞库。SIRT2过表达（SIRT2 overexpression，SIRT2 OE）质粒由上海儿童医学中心感染研究室李畅技术员提供。

佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA；上海碧云天生物技术有限公司），重组人单核细胞趋化蛋白-1（recombinant human monocyte chemotactic protein-1，rhMCP-1；Peprotech，美国），脂多糖（lipopolysaccharide，LPS；上海碧云天生物技术有限公司），TRIzol试剂（Life Technologies，美国），Hifair^® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR和SYBR Green Realtime PCR Master Mix（上海翌圣生物科技有限公司），RPMI-1640培养基（Hyclon，美国），10%胎牛血清（Gemini，美国），0.25%胰酶（Gibco，美国），LIPOFECTAMINE 3000和puromycin（Life Technologies，美国），乙酰化及乳酸化抗体（杭州景杰生物科技股份有限公司），Anti-Rabbit/Mouse IgG抗体（CST，美国），抗SIRT2抗体（CST，美国），辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）-conjugated GAPDH抗体和HRP-conjugated β-actin抗体（上海翌圣生物科技有限公司），Anti-Rabbit-488抗体（Invirtrogen，美国），染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）试剂盒、结晶紫和4%多聚甲醛（上海碧云天生物技术有限公司），16%甲醛（CST，美国），ECL发光试剂盒（Millipore，美国）。

生物安全柜［力新仪器（上海）有限公司］，二氧化碳培养箱（Thermo Scientific，美国），电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司），荧光倒置显微镜（Olympus，日本），水平脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），涡旋振荡器（Scientific Industries，美国），冷冻离心机（Eppendorf，德国），生物分子成像仪（GE，美国），自动聚焦超声波破碎仪（Covaris，美国）。

THP-1细胞采用添加10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于5%CO₂、37 ℃恒温湿润培养箱培养。将THP-1细胞加入含100 ng/mL PMA的RPMI-1640培养基，孵育48 h后更换普通RPMI-1640培养基继续培养24 h，使其刺激分化为具有巨噬细胞特性的人血单核细胞株（PMA-primed THP-1，pTHP-1）。使用含1 μg/mL LPS处理pTHP-1细胞12 h，获得巨噬细胞早期感染的细胞模型。将未经LPS处理的巨噬细胞（pTHP-1）设为对照组（CTRL组），经LPS处理的巨噬细胞设为感染组（LPS组）。

取CTRL组及LPS组巨噬细胞，使用1.25×Loading Buffer进行裂解，99 ℃煮10 min，Nanodrop检测蛋白浓度。采用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离总蛋白，并转移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜；5%脱脂奶粉室温封闭1 h；添加一抗包括乙酰化、乳酸化抗体（1∶1 000）、抗SIRT2抗体（1∶1 000）、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（1∶40 000）、抗β-actin抗体（1∶50 000），4 ℃孵育过夜；聚对苯二甲酸-共-丁二酸丁二醇酯［poly（butylene succinate-co-terephthalate），PBST］洗涤后加入HRP偶联的二抗（1∶3 000）孵育1 h；PBST洗涤后使用ECL发光检测试剂盒显色后成像分析。

取LPS组巨噬细胞，按TRIzol试剂盒说明书提取总RNA；取总RNA 1 μg，使用反转录试剂盒合成cDNA；取cDNA 1 μL进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR）反应，引物序列见表1。反应条件：95 ℃，30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共39个循环；再95 ℃ 15 s。

Transwell小室提前1 h置于含RPMI-1640培养基的24孔板中孵育。取CTRL组及LPS组巨噬细胞，洗涤后取同等密度细胞悬液200 μL加入Transwell小室上室，下室加入趋化因子rhMCP-1，于37 ℃培养箱培养16 h；取出小室，4%多聚甲醛固定30 min，洗涤后结晶紫染色10 min，显微镜下观察计数。

在HEK 293T细胞中使用Lipo3000试剂盒进行SIRT2 OE质粒转染，48 h后收集病毒液并过滤；将THP-1细胞与病毒液1∶1混合，培养6 h后使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基换液，继续培养48 h，使用杀稻瘟菌素（blasticidin）筛选细胞并检测细胞过表达效率。

RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）文库构建和Illumina测序由明码生物科技（上海）有限公司完成；使用基因本体（gene ontology，GO）数据库、京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库进行基因功能注释；使用DESeq2软件分析各细胞之间的差异基因表达。

ChIP测序技术（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）是ChIP后结合高通量测序的方法。取LPS组巨噬细胞，使用1%甲醛交联10 min后加入1×甘氨酸终止交联；SDS裂解液重悬细胞后超声法破碎DNA，取10%DNA产物作为Input，其余DNA产物用于后续免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）实验，分别加入抗组蛋白H4第8位赖氨酸乳酸化（lactylation of histone H4 lysine 8，H4K8la）抗体及抗IgG抗体，4 ℃低速混合孵育过夜；每个样本中加入30 μL protein A/G beads，4 ℃低速混合孵育2 h；按说明书洗涤DNA产物，并使用Elute buffer洗脱；加入无水乙醇沉淀产物后，使用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetra-acetic acid，EDTA）、三羟甲基氨基甲烷（trihydroxymethyl aminomethane，Tris）及Proteinase K解交联；使用DNA纯化试剂盒纯化DNA。后续文库构建和测序由安诺优达基因科技有限公司完成。

使用GraphPad Prism 9进行统计分析。每组实验进行3次独立生物学重复，组间比较采用配对t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

与CTRL组相比，LPS组巨噬细胞可观察到糖酵解限速酶肝脏磷酸果糖激酶（phosphofructokinase liver type，PFKL）和乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）显著升高，糖酵解调剂因子低氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）也显著升高（均P<0.05，图1），提示感染早期的巨噬细胞存在糖酵解通路激活。

与CTRL组相比，LPS组巨噬细胞组蛋白H4K8位点乳酸化修饰水平显著升高（P<0.05），而其余位点乳酸化水平均无显著升高；与此同时，12 h LPS处理也不能改变组蛋白相应位点的乙酰化水平（图2）。结果提示LPS处理可以特异性上调巨噬细胞H4K8la修饰水平。

与CTRL组相比，LPS组可观察到仅SIRT2的mRNA水平显著降低（P=0.010），而具有组蛋白去乳酸化修饰酶活性的其他Sirtuin家族成员（SIRT1、SIRT3和SIRT5）以及HDAC家族成员（HDAC1、HDAC2和HDAC3）的mRNA水平均未见明显变化（图3A、B）。蛋白质印迹法（Western blotting）也进一步证实了SIRT2的蛋白水平显著降低（图3C）。

为验证SIRT2对H4K8la的去修饰作用，我们构建了SIRT2过表达THP-1细胞系，Western blotting结果（图4A）显示，SIRT2过表达THP-1细胞系构建成功。并进一步将其在PMA诱导后以1 μg/mL LPS处理12 h。与未进行过表达处理的野生型（wild type，WT）THP-1诱导而来的巨噬细胞相比，SIRT2过表达可使巨噬细胞中H4K8la水平显著降低（P=0.001，图4B）。更重要的是，WT巨噬细胞中LPS上调H4K8la水平的作用在SIRT2过表达细胞系中消失（P>0.05，图4B），表明巨噬细胞中SIRT2对H4K8la修饰具有去修饰作用。

为探索受H4K8la调控的靶基因，我们对LPS组巨噬细胞进行RNA-seq和ChIP-seq检测（图5A、B）。ChIP-seq与RNA-seq交互分析结果（图6A、B）表明，受H4K8la调控的基因富集在巨噬细胞趋化相关通路。为验证H4K8la修饰是否调控巨噬细胞趋化功能，我们对SIRT2过表达前后的巨噬细胞趋化能力进行检测。与CTRL组相比，LPS组可观察到巨噬细胞趋化水平显著升高（P<0.05），但SIRT2过表达可使LPS对巨噬细胞趋化能力的增强作用消失（P>0.05），表明SIRT2可通过去修饰H4K8la降低巨噬细胞趋化能力（图7）。

巨噬细胞是高度可塑的免疫细胞，能够通过极化过程快速改变其功能特征以提供从防御病原体到组织修复等多种生理功能^［10］。巨噬细胞极化状态的改变涉及代谢重编程过程，当被病原或炎症信号激活时，巨噬细胞可以从基于氧化磷酸化的有氧模式转变为基于糖酵解的厌氧模式^［2，11］。这种动态代谢变化提供了炎症期间巨噬细胞功能所需的关键生物合成前体，而过程中所生成的代谢物，如乳酸，也可反过来作为关键的调节信号发挥作用^［12］。

作为糖酵解的代谢产物，乳酸多年来被认为是细胞代谢的废物。循环中乳酸水平升高被称为“乳酸性酸中毒”，是脓毒症患者的常见特征，已被用作指示脓毒症患者严重程度和结局的指标。同时，乳酸被证明是通过HIF-1α依赖性重编程抑制巨噬细胞极化的主要介质，可以通过剂量依赖性方式增加M2型巨噬细胞标志物的表达，并通过抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）活化来抑制M1型巨噬细胞^{［3，13-14］}。某些情况下，乳酸也具有促炎作用。例如，在脓毒症情况下，乳酸也被证明会诱导中性粒细胞迁移及中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular trap，NET）形成^［15-16］，也可增加LPS刺激后巨噬细胞中白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、基质金属蛋白酶1（matrix metalloproteinase 1，MMP1）及IL-1的产生^［5-6］，但直到最近乳酸才被发现可以直接修饰组蛋白并通过表观遗传调控的方式调节巨噬细胞功能^［9］。

表观遗传修饰包括组蛋白修饰、DNA甲基化、RNA修饰、染色质重塑等方式。其中，组蛋白修饰是一种受环境因素（如代谢物、组蛋白修饰转移酶和去修饰酶等）调控的可遗传的表观修饰。由于其对免疫细胞的长久影响，感染过程中的组蛋白修饰相关调控机制受到越来越多的关注^［17］。研究^［9，18］发现乳酸作为一种表观遗传调控分子，可以通过组蛋白乳酸化来调控M2极化相关基因的表达。随后，陆续有研究^［19-21］提示，巨噬细胞中的乳酸化修饰可通过增加下游基因表达参与损伤修复及组织纤维化过程，但现有研究^［22-23］多集中在H3K18位点修饰水平及总体乳酸化修饰水平，或集中在巨噬细胞向M2方向极化，而组蛋白乳酸化是否可以调控感染早期巨噬细胞的炎症反应尚不清楚。本研究发现，当使用LPS处理巨噬细胞12 h模拟其感染早期状态时，可观察到巨噬细胞中糖酵解显著激活，且H4K8位点乳酸化修饰水平特异性显著升高，而相应位点的乙酰化水平则无明显改变，提示H4K8la可能在巨噬细胞感染早期发挥作用。

LPS诱导的H4K8la修饰水平升高，一方面可能源于糖酵解增强引起的乳酸水平升高，但另一方面也可能是H4K8la修饰的调节蛋白水平变化，修饰酶水平的升高和/或去修饰酶水平的降低导致的。现有研究^［9，24］表明，组蛋白乳酸化的修饰酶是p300，去修饰酶包含HDAC1~3和SIRT1/2/3/5等多个蛋白。HDAC家族可以通过改变赖氨酸残基的乙酰化状态影响组蛋白和非组蛋白的翻译后修饰，同样被提示在体外具有去乳酸化活性^［24］。Sirtuin是一类高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）依赖的蛋白质家族，在进化过程中高度保守，以其抗炎和抗氧化特性而闻名^［25］。本研究发现，在所有的去修饰酶中，只有SIRT2的表达量在LPS处理后显著降低。SIRT2是Sirtuin家族的成员，其主要特点是可以实现乙酰赖氨酸底物的去乙酰化，并可通过该方式参与感染和炎症过程^［26］。脓毒症是一种由宿主对感染的反应失调引起的危及生命的器官功能障碍，SIRT2被发现在早期脓毒症患者体内水平低于健康志愿者，且在休克患者体内水平更低^［27］。一些报告^［28］表明，SIRT2可通过增加NF-κB去乙酰化、调节巨噬细胞极化和增加M2相关的抗炎途径来防止炎症过程的发展。2022年，有研究^［29］报道SIRT2可以作为组蛋白乳酸化的去修饰酶参与调控抑制神经母细胞瘤细胞的增殖及迁移。本研究也证实，在巨噬细胞中过表达SIRT2可显著降低组蛋白H4K8la水平，表明SIRT2确实可以在巨噬细胞中去修饰H4K8la。LPS处理巨噬细胞引起的H4K8la修饰水平增加可能是底物（乳酸）水平升高和去修饰酶（SIRT2）水平降低共同作用的结果。

为进一步探索SIRT2调控H4K8la修饰在巨噬细胞中的功能，本研究针对H4K8la抗体的ChIP-seq和LPS处理的RNA-seq进行了交互分析，并发现该修饰在调控巨噬细胞趋化功能中发挥重要作用。当SIRT2过表达时，巨噬细胞内H4K8位点乳酸化水平显著降低，同时伴有巨噬细胞趋化能力的显著降低。多项研究已证实，巨噬细胞的趋化能力在宿主的抗感染免疫中占据重要地位。例如，巨噬细胞趋化能力的增强可提高宿主的病原清除能力，并进一步激活局部的炎症反应^［30］。但固有免疫系统的过度激活会导致巨噬细胞等免疫细胞破坏性侵入组织，伴随细胞因子、趋化因子及脂质介质等的过度释放，也会引起严重的组织损伤，甚至导致死亡。

综上所述，本研究首次发现SIRT2可通过去修饰组蛋白H4K8la减弱巨噬细胞趋化能力。感染早期巨噬细胞中H4K8位点的乳酸化修饰水平特异性升高，SIRT2可作为去乳酸化修饰酶降低组蛋白H4K8la修饰水平，进而抑制巨噬细胞的趋化能力，这将为控制感染性疾病中的过度炎症反应提供新的治疗靶点。