根据世界糖尿病协会第10版图集显示，全球10%的成年人患有糖尿病，而其中超半数会并发神经病变，导致神经病理性疼痛，即糖尿病神经病理性疼痛（diabetic neuropathic pain，DNP）^［1］。DNP以自发痛和痛觉过敏为最主要的病理特征，是神经病理性疼痛疾病范畴中特殊的一种；其中超过50% 的患者为重度疼痛，夜间痛尤甚，严重影响患者的生活质量。另外，DNP是导致患者下肢皮肤溃疡、功能紊乱和截肢的主要原因，给患者和社会都带来了重大负担^［2］。但现有的治疗手段仍无法有效地缓解DNP，因此探讨其机制和开发新的治疗靶点显得尤为重要。

细胞自噬（autophagy）是一种高度保守的细胞内选择性降解机制，主要通过溶酶体途径降解和回收受损的细胞器或有害病原体，旨在维持细胞稳态^［3］。该过程由多种蛋白调控。其中Bcl-2 相互作用蛋白（Bcl-2 interacting coiled-coil protein 1，Beclin-1）、微管相关蛋白轻链3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）和p62是自噬的关键介质，被广泛用作监测和量化自噬活动的指标^［4］。Beclin-1在自噬起始阶段发挥核心作用，诱导自噬发生。LC3则与吞噬受损物质的自噬体膜相关，在此阶段，LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ，与衔接蛋白p62结合，后者被自噬选择性降解^［5］。自噬与多种生理、病理过程息息相关，早期的相关研究主要聚焦于肿瘤。后来，有研究^［6］发现自噬在神经系统疾病中也扮演着重要角色。近年来，DNP患者中自噬流受损得到证实^［7］，因此，推测激活自噬对DNP有一定的治疗作用。

Kelch样ECH关联蛋白（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）/核因子E2相关因子（nuclear factor erythroid-derived-2-like 2，Nrf2）/血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）通路是一条经典的抗氧化应激通路，通过诱导细胞保护性基因的表达维持机体氧化还原平衡，并消除有毒有害物质的损伤作用。Keap1是Nrf2的负调控因子，静息状态下，Keap1基于Cullin3的E3泛素连接酶的衔接子亚基调节Nrf2活性，允许Nrf2在胞浆中积聚^［8］。氧化应激发生时，Keap1构象改变，释放Nrf2入核与抗氧化原件（antioxidant responsive element，ARE）结合，诱导一系列细胞保护基因转录，抵抗氧化应激^［9］。目前，关于Nrf2和神经病理性疼痛的研究并不多。LI等人^［10］发现，使用Nrf2激动剂能够显著改善部分坐骨神经结扎导致的大鼠痛觉超敏。FRIAS等^［11］的研究显示，Nrf2能够正向调节支气管上皮细胞中的自噬。此外，Nrf2激活的HO-1是一种微粒体酶，相较于Nrf2其他下游靶标具有更显著的细胞保护作用，能够缓解神经病理性疼痛，并被报道可以调控多种细胞的自噬^［12］。因此，推测Keap1/Nrf2/HO-1通路对自噬的调控有至关重要的作用。

18 kDa转位分子蛋白（translocator protein，TSPO）是一种定位于线粒体外膜的、高度保守的疏水性蛋白，在甾体合成相关的组织中高度表达，其中就包括神经系统。TSPO作为一种应激蛋白，被视作神经炎症的标志物，与多种神经系统疾病密切相关^［13］。既往研究^［14］发现TSPO激动剂Ro5-4864能够缓解由脊神经结扎导致的神经病理性疼痛，其机制与它对脊髓背角中星形胶质细胞自噬的正向调节有关。因此，推测TSPO激动剂也能够通过调节自噬缓解DNP。另有研究^［15］证明TSPO能够激活视网膜中的Keap1/Nrf2/HO-1通路。因而在假设Keap1/Nrf2/HO-1通路能够调节自噬的前提下，推测TSPO受体激动剂是经由Keap1/Nrf2/HO-1通路激活自噬来缓解DNP。本研究旨在观察DNP大鼠坐骨神经中Keap1/Nrf2/HO-1通路和自噬相关指标的变化规律，以及鞘内注射TSPO激动剂或Nrf2抑制剂后对其的影响。

本研究所用实验动物为雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量为180 g±20 g，由上海交通大学医学院附属新华医院动物房提供。通过数字表将24只大鼠随机分配为4组，每组6只：假手术组［Sham组，正常饮食并腹腔注射柠檬酸钠缓冲液，鞘内注射20%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）］、DNP模型组（DNP组，高脂饮食并腹腔注射链脲佐菌素，鞘内注射20% DMSO）、TSPO激动剂Ro5-4864组（Ro组，高脂饮食并腹腔注射链脲佐菌素，鞘内注射Ro5-4864）、TSPO激动剂Ro5-4864合用Nrf2抑制剂ML385组（Ro+ML385组，高脂饮食并腹腔注射链脲佐菌素，鞘内注射Ro5-4864合用ML385）。

TSPO激动剂Ro5-4864［7-chloro-5-(4-chlorophenyl)-1-methyl-3H-1,4-benzodiazepin-2-one］，Nrf2抑制剂ML385［N-(4-(2,3-dihydro-1-(2-methylbenzoyl)-1H-indol-5-yl)-5-methyl-2-thiazolyl）-1,3-benzodioxol-5-yl-acetamide］，链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）和DMSO均购买自美国Sigma-Aldrich公司。柠檬酸钠缓冲液购买自北京索莱宝科技有限公司。

此外，实验中所用抗体LC3 A/B（兔源）、p62（兔源）、Beclin-1（兔源）、Nrf2（兔源）、HO-1（兔源）均购买自美国Cell Signaling Technology公司，actin（兔源）和Lamin A/C则购买自武汉爱博泰克生物科技有限公司。

为建立2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）模型，对大鼠进行连续2周的高脂饮食喂养诱导胰岛素抵抗。而后，将STZ溶于0.1 mol/L pH=4.5的柠檬酸钠缓冲液中，浓度为1%，经腹腔以30 mg/kg的剂量注射给大鼠，连续给药2 d^［16］。在此后的第3天，经心脏穿刺采血，使用大鼠胰岛素ELISA试剂盒（碧云天生物技术有限公司，PI606）检测空腹胰岛素水平，同时测量其空腹血糖水平，计算大鼠的胰岛素抵抗指数［homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR；计算公式为HOMA-IR=(胰岛素浓度×血糖浓度)/22.5］和胰岛素敏感指数［insulin sensitivity index，ISI；计算公式为ISI=胰岛素浓度×血糖浓度^-1］。空腹血糖大于11.1 mmol/L的大鼠被认为是T2DM模型鼠。

50%机械缩足反射阈值（paw 50% mechanical withdrawal threshold，50% PMWT）测量：采用up-down法，测量时间点选取高脂饮食处理前（baseline），STZ后第3天（D3）、第7天（D7）、第14天（D14）、第21天（D21）和第28天（D28）。将大鼠放置于专用笼盒中，等待15 min左右，待大鼠适应陌生环境后，分别用不同的Von Fery hair作用于大鼠后足掌跖处，用力使Von Fery hair呈“S”或“C”型，持续6~8 s，出现快速抬足或舔足视为阳性，反之为阴性。根据预实验，Von Frey hair选用范围为0.40~26 g，根据CHAPLAN等^［17］所描述的方法进行计算。50% PMWT较基值下降超20%的T2DM大鼠被认为DNP造模成功。

2%戊巴比妥钠40 mg/kg经腹腔注射麻醉大鼠，取俯卧位，在大鼠腹下垫支撑物使椎间隙尽量舒展以便给药。平大鼠髂棘连线L5~L6间隙以10 μL微量进样器进行椎管穿刺，见大鼠甩尾为穿刺成功，注射后短暂停留保证药液充分进入后拔出。Ro组给予溶于20% DMSO的Ro5-4864 4 μg（剂量为10 μL/只），连续3 d；Ro+ML385组在给予Ro5-4864的同时合用20 μg ML385，同样溶于20% DMSO，剂量为10 μL/只，连续3 d。Sham组和DNP组仅给予同体积同浓度的DMSO。

在第28天收集坐骨神经。大鼠麻醉后开胸经左心室先后灌注300 mL生理盐水和300 mL 4%多聚甲醛，取出坐骨神经后继续浸泡于多聚甲醛中进行后固定，而后在20%及30%蔗糖中梯度脱水，包埋于最佳切割温度复合物（optimal cutting temperature compound，OCT）包埋剂中。使用冰冻切片机将样本横向切成15 μm的薄片。经透膜、封闭后使用一抗LC3 A/B（φ=1∶200）和Nrf2（φ=1∶100）4 ℃孵育过夜。二抗避光室温孵育1 h后封片，使用荧光显微镜扫描拍片。

在第28天，麻醉及经左心室灌注300 mL生理盐水后收集坐骨神经。使用碧云天生物技术有限公司蛋白提取试剂盒（P0028）分别提取胞浆蛋白和胞核蛋白，定量后用于Western blotting。按20 μg/孔上样，根据分子量选用12.5%或7.5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-poly-acrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离目标蛋白后转膜，封闭后使用相应一抗4 ℃孵育过夜。p62、Beclin-1、LC3 A/B、Nrf2和HO-1按φ=1∶1 000进行稀释。经TBST冲洗后，辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育1 h，actin和Lamin A/C按φ=1∶10 000进行稀释。再次TBST清洗后经ECL法显色曝光，Image J对结果进行分析。

采用SPSS 26.0软件进行分析。定量资料以x±s表示。对50% PMWT首先使用重复测量的方差分析进行分析，后进行多变量方差分析和Tukey检验，比较不同组别同一时间点的机械痛阈；对免疫荧光和Western blotting结果则进行单因素方差分析和Tukey检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

如图1所示，本研究中使用高脂饮食和低剂量STZ诱导T2DM模型鼠，在注射STZ后第3天，DNP组的HOMA-IR水平较Sham组显著提升（P=0.000，图1A），而ISI明显降低（P=0.000，图1B）。同时，第3天DNP组大鼠的50% PMWT显著低于Sham组（P=0.000，图1C），这表明T2DM大鼠出现机械性痛觉超敏。

如图2所示，DNP组在整个实验观察周期中（DNP造模后第3~28天），其50% PMWT较Sham组明显降低（均P=0.000），且无改善趋势。Ro组在STZ后第4天经鞘内注射4 μg/只Ro5-4864，连续3 d，自第7天开始50% PMWT明显改善，随时间作用愈发明显，与DNP组相比差异具有统计学意义（第14天，P=0.039；第21、28天，均P=0.000）。

为观察坐骨神经中LC3荧光强度的变化，采用了免疫荧光检测方法。结果如图3所示，DNP组中LC3荧光信号较Sham组明显减弱（P=0.000），约为Sham组的19.9%。Ro组给予Ro5-4864后，坐骨神经中LC3信号增强（P=0.000），提升至Sham组的108.7%。

如图4所示，坐骨神经样本Western blotting检测显示，与Sham组相比，DNP组中Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白含量显著降低（均P=0.000），p62蛋白则显著增加（P=0.000）。鞘内注射Ro5-4864后，Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白含量增加（均P=0.000），p62蛋白含量降低（P=0.001）。

为观察Nrf2荧光信号的变化，再次对坐骨神经进行免疫荧光检测，结果如图5所示。DNP大鼠坐骨神经中Nrf2荧光强度明显减弱（P=0.000），约为Sham组的53.2%。而给予Ro5-4864后被改善（P=0.000），增加至Sham组的101.6%。

Western blotting结果如图6所示，DNP组的坐骨神经中HO-1和核Nrf2蛋白表达水平显著低于Sham组（均P=0.000）。这一变化在Ro组被逆转（均P=0.000）。

为了探讨Keap1/Nrf2/HO-1通路在Ro5-4864激活自噬中的作用，对Ro组和Ro+ML385组的大鼠进行行为评估。结果显示，合用ML385后，该组大鼠的50% PMWT始终维持在低水平，各时间点上与Ro组的差异都具有统计学意义（第7天，P=0.006；第14天，P=0.003；第21、28天，均P=0.000；图7A）。

Western blotting结果显示，与Ro组相比，Ro+ML385组中核Nrf2和浆HO-1、Beclin-1、LC3-Ⅱ的蛋白含量均降低，p62蛋白含量再次大幅增加（均P=0.000，图7B~H）。

本研究发现2型糖尿病发生时，大鼠出现神经病理性疼痛，即糖尿病神经病理性疼痛，同时坐骨神经中自噬和Keap1/Nrf2/HO-1通路受损。鞘内注射TSPO激动剂Ro5-4864后，DNP大鼠的痛觉过敏得到缓解，这归功于它对自噬的激活，其中的机制可能与TSPO对Keap1/Nrf2/HO-1通路的正向调节有关。因此，为了探讨Keap1/Nrf2/HO-1通路在这其中扮演的角色，Nrf2抑制剂ML385被使用，结果显示在Keap1/Nrf2/HO-1通路被阻断后，Ro5-4864对自噬的激活作用消失，行为学上对大鼠痛觉过敏的缓解作用也被抵消。

TSPO作为最广为人知的神经炎症标记物，其作用多种多样，包括调节类固醇生成、线粒体生物发生、细胞增殖和凋亡、卟啉合成和免疫调节等^［18］。有研究指出TSPO的激活是机体面对应激状态的一种内源性补偿机制，但通常情况下活化不足，因此外源性增强TSPO活性可以强化机体自身的抗伤害补偿机制^［19］。比如，BLOMS-FUNKE等^［20］认为激活TSPO能够缓解糖尿病导致的机械性痛觉超敏，并且能够抑制疼痛的慢性化。本课题组的既往研究^［19］也证实使用TSPO激动剂能够缓解脊神经结扎导致的神经病理性疼痛。在本研究中，同样发现鞘内注射TSPO激动剂Ro5-4864能够缓解DNP，但这其中的机制仍需进一步研究。MARINELLI等^［21］的研究指出，使用自噬激动剂雷帕霉素（Rapamycin，RAPA）能够缓解坐骨神经缩窄造成的神经病理性疼痛。基于此，本研究假设Ro5-4864对DNP的缓解作用是由于它对自噬的激活。因此，本研究使用免疫荧光和Western blotting检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ和p62的表达情况，结果显示：DNP大鼠坐骨神经中Beclin-1和LC3-Ⅱ表达降低，p62表达增加，这表明DNP发生时，大鼠坐骨神经中自噬受损。鞘内注射Ro5-4864后的DNP大鼠坐骨神经中Beclin-1、LC3-Ⅱ表达增加，p62减少，这说明受损的自噬被激活，自噬过程流畅。免疫荧光结果也充分印证了这一点。以上结果与本研究的预想一致，简言之，TSPO通过激活坐骨神经中的自噬缓解了DNP。

Keap1/Nrf2/HO-1通路是一条经典的内源性保护机制。既往研究表明，在坐骨神经缩窄模型中，可以观察到坐骨神经的Nrf2信号减弱^［22］，Nrf2信号通路对神经保护至关重要^［23］。本研究发现，DNP大鼠坐骨神经中HO-1和核Nrf2蛋白表达降低，说明该通路被抑制。而鞘内注射Ro5-4864后这种损伤被逆转，可见2种蛋白表达水平的显著提升。这表明Keap1/Nrf2/HO-1通路在TSPO缓解DNP中也扮演了重要角色。为了探明Keap1/Nrf2/HO-1通路的具体作用，本研究使用了Nrf2抑制剂ML385。结果显示，合用ML385后，HO-1和核Nrf2的表达水平重新回到低水平，同时自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白水平也被抑制，p62含量重新增加，大鼠的50% PMWT也降低至DNP水平。这表明在Keap1/Nrf2/HO-1通路被抑制的情况下，Ro5-4864对DNP的缓解作用和对自噬的激动作用都无法实现。换言之，TSPO激动剂Ro5-4864是通过Keap1/Nrf2/HO-1通路调节自噬而发挥缓解DNP作用的。

本研究仍有一些不足：研究中采用了鞘内给药方式，却使用坐骨神经作为研究样本，因而无法说明TSPO激动剂Ro5-4864是通过中枢还是外周神经系统发挥作用的，这需要使用外周给药方式进行验证。

综上所述，本研究证实了给予DNP大鼠TSPO激动剂Ro5-4864能够缓解痛觉过敏，这归功于Ro5-4864通过激活Keap1/Nrf2/HO-1通路对自噬的正向调节。事实上，TSPO在临床上已然展现出了多方面的作用，比如作为示踪剂通过PET-CT检测神经系统，成为神经系统疾病诊断和治疗的依据^［13］。本研究希望为DNP的治疗提供新的思路。