细胞的全能性是指单个细胞产生完整胚胎及其胚胎外成分的能力。而在小鼠中，这种能力仅限于受精卵和2细胞的发育阶段^［1］，伴随着发育的进行，分裂的细胞发育潜能逐渐受限，并在囊胚阶段分化成不同的细胞系而丧失全能性。在小鼠胚胎早期发育过程中，全能卵裂球分化为内细胞团（inner cell mass，ICM）和滋养外胚层（trophectoderm，TE），内细胞团形成囊胚的原始内胚层（primitive endoderm，PrE）和上胚层（epiblast，EPI）^［2］。

来源于囊胚内细胞团体外培养的小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cell，mESC），具有分化成几乎所有细胞类型的能力，常称为多能干细胞^［3-4］；与全能干细胞相比，其不能分化形成胚外组织。有研究从mESC转化或直接从八细胞期胚泡中体外培养获得发育潜能扩展或扩大的多能干细胞（extended or expanded pluripotent stem cell，EPSC）^［5-7］。这2种细胞类型都显示出多能性得到了扩展的分子和功能特征，如全能性相关标记基因的表达，以及通过嵌合对EPI、PE和TE细胞谱系的贡献。然而EPSC倾向于PrE谱系细胞分化，这导致使用EPSC构建的“扩展多潜能干细胞类囊胚（EPS-blastoids）”存在严重的植入后缺陷^［8-9］。

体外培养的mESC保留了极少量的细胞亚群（0.1%~1%），这些亚群表达鼠内源性反转录病毒（murine endogenous retrovirus-L，MERVL）和金属硫蛋白-2（metallothionein-2，MT-2）转座子以及其他全能性基因［如锌指和SCAN结构域的蛋白质4（zinc finger and SCAN domain containing 4，Zscan4）家族］，表现出2细胞期胚胎的多个特征，如2细胞胚胎特异性转录物的表达^［10］、组蛋白流动性的增加^［11］以及内细胞团和滋养外胚层发育潜能的促进^［10］，因而这一少量的细胞亚群也被称为2细胞样细胞（2-cell-like cell，2CLC）。由于2细胞胚胎难以大量获取，而体外培养的mESC中可相对容易地分离富集得到2CLC，使其成为了解全能性和合子基因组激活的良好模型^［12］。但是许多研究表明一些体外建立的2CLC表达谱更接近于囊胚期细胞^［13-14］，这说明可以使用这些细胞系去构建类囊胚，模拟TE、EPI与PrE的发育过程。值得注意的是，缺失2CLC的mESC表现出向中胚层和外胚层分化的倾向^［10］。然而，仍不清楚的是这些2CLC是否存在与EPSC类似的分化倾向性，即倾向于胚外内胚层分化。

双同源盒（double homeobox，DUX）家族蛋白是mESC进入2C样状态的关键驱动因素。DUX（小鼠）或DUX4（人类）可能是胚胎基因组激活（zygotic genome activation，ZGA）的关键因子，诱导人类和小鼠中最早的ZGA基因波^［15-17］。在mESC中，诱导DUX表达可在24 h内将MERVL阳性细胞的效率提高到10%~74%^［16］。此外，DUX诱导的2C-like状态是短暂的、可逆的，类似于自发形成的2CLC^［18］。围绕DUX上下游调控机制已发现很多早期胚胎发育过程中的关键转录分子或表观遗传学修饰因子^［19-23］，而关于DUX如何通过诱导2CLC比例增加导致mESC在分化过程中命运转变的分子机制，迄今未见报道。本文重点聚焦于此，探索DUX对mESC分化潜能的影响，并分析潜在的作用机制。

本研究使用mESC细胞株CGR8.8由斯坦福大学的Dr. Chen教授赠予；HEK293T细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

用于2CLC示踪的载体由北京协和医学院黄粤教授赠予；用于DUX过表达的载体为pCW57-MCS1-P2A-MCS2-mDux；用于慢病毒包装的辅助载体为psPAX2、pMD2.G。

MEM培养基、胎牛血清、β-巯基乙醇、胰蛋白酶（Gibco，美国），青-链霉素双抗、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸（上海源培生物科技股份有限公司），LIF（Millipore，美国），PD0325901、CHIR99021（上海陶术生物科技有限公司），明胶（Sigma，德国），Lipofectamine 3000、Trizol（Invitrogen，美国），潮霉素、嘌呤霉素、阿霉素、氨苄霉素、酵母粉、胰蛋白胨（上海碧云天生物有限公司），聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）高保真酶、SYBR Green Fast qPCR Mix、cDNA反转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），感受态、质粒提取试剂盒（天根生化科技有限公司），焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）、无水乙醇、异丙醇、三氯甲烷（上海大合化学品有限公司）。PCR仪（Roche，瑞士），实时荧光定量PCR仪、Nanodrop 2000、细胞培养箱（ThermoFisher，美国），显微镜（Olympus，日本）。

HEK293T培养基体系为高糖DMEM培养基添加10%的胎牛血清及1%青-链霉素双抗。mESC培养基体系为Knockout DMEM培养基添加15%的胚胎干细胞专用血清、1%青-链霉素双抗、1% L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、0.55 mmol/L β-巯基乙醇和LIF（10⁴ U/mL）。撤去LIF，将mESC悬浮培养在细菌培养皿中，形成拟胚体。继续培养48 h，每日换液并进行后续实验。细胞均置于5% CO₂的37 ℃培养箱中进行培养。

使用Lipofectamine 3000将含有MERVL：：tdTomato的载体转染至mESC中，转染48 h后将细胞传代至10 cm直径培养皿中，并更换含有150 mg/mL潮霉素的培养液筛选7 d，待单个细胞长大时挑选单克隆。

首先借助于HEK293T细胞进行慢病毒载体的包装，将HEK293T细胞传代至6孔板中，传代比例为第2日细胞密度达到70%~80%。慢病毒包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G和目的基因质粒按3∶1∶4比例混合加入至opti-MEM培养基中，并加入P3000试剂混匀；Lipofectamine 3000与另一份opti-MEM培养基混匀，将两者溶液混匀后室温静置15 min。将混合溶液缓慢滴加到培养液中，轻轻摇匀，细胞正常培养24 h后换新鲜培养液。收集转染48 h的培养上清液，3000×g、4 ℃离心5 min，去除细胞沉淀，使用0.45 μm的滤器过滤液体。含有慢病毒的滤液可直接用于感染或者冻存于-80 ℃。mESC在感染前1 d铺板，感染当日密度为20%~30%。感染时去除旧培养液，换成一半培养液和一半慢病毒滤液混合并加入终浓度8 μg/mL的凝聚胺，于37 ℃、5% CO₂的培养箱中继续培养，24 h后换成正常新鲜培养液。感染48 h后，将细胞传代至10 cm直径培养皿中，并更换含有1 μg/mL嘌呤霉素的培养液筛选7 d，待单个细胞长大时挑选单克隆。将挑出的单克隆一分为二，一份加入含有2 μg/mL四环素（doxycycline）（记为plusDox），另一份加正常mESC培养液（记为noDox），培养24 h后荧光显微镜观察，保存有红色荧光的克隆进行后续的实验。

将细胞从培养箱中取出，弃上清液，PBS洗涤1遍，0.25%胰酶消化3 min，使用含血清培养液终止消化，800×g离心3 min，弃上清液。PBS重悬清洗1遍，800×g离心3 min，弃上清液，然后向EP管中加入1 mL的Trizol充分吹打混匀，放在室温静置10 min。向每份EP管中加入200 µL三氯甲烷，涡旋剧烈震荡15 s，室温静置3 min。10 000×g，4 ℃离心15 min。将上层澄清液转移至新的EP管中。向澄清液中加入等体积的异丙醇（一般为500 µL），上下颠倒混匀，室温静置10 min。10 000×g，4 ℃离心10 min。吸上清液，加入1 mL的75%乙醇混匀重悬。5 000×g，4 ℃离心5 min。重复上一步。弃上清液，将EP管打开放在超净台里，室温鼓风吹干，一般5~10 min，注意风干时间不要过长。加入适量的DEPC水溶解RNA沉淀，可以冰上或4 ℃溶解1 h左右，短暂低速离心，Nanodrop 2000测浓度后进行接下来的反转录实验，剩下的RNA冻在-80 ℃。

取1 µg RNA加4 µL 4×gDNA wiper Mix并用RNase-free ddH₂O调整体积至16 µL，42 ℃孵育2 min。再加入4 µL 5×HiScript Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ，50 ℃，15 min；然后85 ℃，5 s。

用ddH₂O将上述反转录后的cDNA溶液体积调整至100 µL。反应体系为2 µL cDNA、0.5 µL qPCR-F（10 µmol/L）、0.5 µL qPCR-R（10 µmol/L）、5 µL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix和7 µL ddH₂O。反应条件如下：95 ℃初始变性3 min，然后95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，40个循环。以3-磷酸-甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Gapdh）作为参考基因（表1）；采用2-ΔΔCT方法计算相对表达量。

从EMBL-EBI数据库分别下载视黄酸处理（PRJNA677836^［24］）和DUX过表达（PRJNA338980^［16］）mESC的RNA-seq数据，样本信息如表2。

为了分析基因表达，本文使用trim-galore（v0.5.0）对原始数据进行过滤，得到高质量的clean data。利用hisat2（v2.1.0）软件将质量控制后的序列比对到参考基因组（mm10），并采用stringtie2（v2.1.7）软件分析对已知的基因和转录本进行表达定量。通过DESeq2分析差异表达基因，筛选标准为P<0.05且差异倍数（fold change，FC）对数的绝对值（|log₂FC|）>1。使用R（v4.3.1）包clusterProfile（v4.8.2）对筛选出的差异基因进行基因本体论（Gene Ontology，GO）富集分析、京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析和基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）。

从EMBL-EBI数据库下载HA-tagged-Dux ChIP-seq数据（PRJNA377313^［16］），样本信息如表3。

使用bowtie2（v2.2.5）将ChIP-seq reads比对到参考基因组（mm10）上，丢弃线粒体DNA或未分配对应序列的读取。对于单一的比对，使用SAMtools （v1.9）过滤重复读取和低映射质量读取。使用MACS2（v2.1.2）调取ChIP-seq富集峰，用IDR （v2.0.3）合并共同峰，用于后续分析。使用R包ChIPseeker（v1.39.0）对富集的峰进行注释。使用MEME套件v5.0.5中的analysis of motif enrichment （AME）软件进行转录因子结合位点富集分析，从JASPAR下载用于扫描的结合基序矩阵。使用deeptools（v3.5.5）和RPKM（reads per kilo base per million mapped reads）归一化方法生成bigwig文件。在IGV（Integrative Genomics Viewer）中创建并展示图表。

本研究中的实验数据均来自3次独立重复操作，使用GraphPad Prism 9软件进行统计分析和图表绘制。定量数据以x±s表示，并采用Student′s t-test检验进行两两比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。

首先在mESC中转染MERVL：：tdTomato质粒，构建2CLC指示性细胞系。在此细胞系基础上，使用慢病毒感染过表达DUX。在加入四环素培养24 h后，流式细胞计数检测结果显示红色荧光细胞比例显著提高，2CLC占比从0.40%升至20.63%（图1A）。RT-qPCR检测2细胞期特异性基因MERVL-pol、Zscan4c、Zfp352和内源Dux的mRNA表达，结果均显著升高（图1B）。这些数据表明已成功构建DUX诱导过表达细胞系。

值得注意的是，2CLC对嵌合体的胚胎（着床后的外胚层衍生）和胚胎外（原始内胚层和滋养外胚层衍生）组织都有贡献^［10］。相对于对照组，过表达DUX形成2CLC后，RT-qPCR检测多能性因子的表达情况，结果显示多能性因子表达没有明显变化（图2A）。对DUX过表达RNA-seq数据分析发现，除了2C特异性基因明显高表达外（图2B），内胚层标志基因也高表达（图2C）。在ES细胞培养阶段短暂诱导DUX表达12 h，随后进行拟胚体培养，第4日RT-qPCR检测三胚层标志因子的表达；相对于对照组，DUX的激活导致胚外内胚层基因表达明显上调，外胚层、中胚层基因没有显著变化（图2D）。这些结果表明DUX除了促进2CLC形成外，还具有促进mESC向胚外内胚层分化的作用。

为了探究DUX促进mESC向胚外胚层分化的作用机制，通过重新分析文献RNA-seq数据，GO分析结果显示DUX促进的上调基因主要富集在模式规范过程、区域化等（图3A），GSEA结果显示DUX会激活视黄醇代谢通路（图3B），激活视黄酸

信号通路相关的表达（图3C）。视黄酸是视黄醇代谢的产物，同样能促进2CLC的形成。对已发表的视黄酸处理的mESC测序数据进行比对分析，发现DUX上调的富集通路与视黄酸促进的上调差异基因非常相似（图3D）。以上数据表明DUX可能激活视黄酸信号通路，通过视黄酸途径影响细胞状态。

为了进一步探索DUX调控视黄酸通路的潜在分子机制，通过已发表的DUX ChIP-seq数据，使用AME软件，分析视黄酸γ受体（retinoic acid receptor gamma，RARG）与DUX占据位点的共定位情况。结果显示：两者交集很多是与发育相关的基因（图4A），比如2C特异性基因Zscan4家族成员基因；另外DUX与RARG共定位在Gata4基因的远端增强子上（图4B）。进一步KEGG分析发现，该交集基因会富集在丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路（图4C）。这些分析结果表明DUX与视黄酸受体存在一些相同的DNA结合位点，它们共同的靶基因构成了调节ESC分化潜能的网络。

DUX是一些2C特异性基因和内源性反转录病毒元件的驱动因素，然而尚不清楚DUX在2C样细胞退出全能性进而向下分化的倾向及潜在机制。本研究首先通过已发表文献的RNA-seq数据分析，发现在维持mESC自我更新培养条件下，DUX过表达的mESC会高表达一些PrE的标志因子，随着mESC向拟胚体自然分化，过表达DUX会促使拟胚体向胚外内胚层分化。

GSEA结果显示DUX激活了视黄醇代谢通路。视黄醇代谢产物视黄酸是核受体超家族的成员^［25］，控制着广泛的发育过程。最近有研究报道低剂量的视黄酸和视黄酸受体γ协同作用会促进mESC进入类2C状态^［26］。本研究发现视黄酸途径促进的上调差异基因GO富集分析的功能区与DUX激活的高度相似，两者有相似的转录水平表达谱。这表明DUX可能通过视黄酸信号通路调节mESC状态。进一步对ChIP-seq数据进行生物信息学分析，证明已知的视黄酸受体motif存在于DUX富集的peaks中，两者能够结合在一些靶基因的启动子或增强子区域，调控这些基因的表达。有趣的是，RARG与DUX共同占据的基因，进一步与DUX激活的基因取交集，这些交集基因会富集在MAPK信号通路上，而持续激活的细胞外信号调节激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）磷酸化会导致mESC的分化^［27］。此外，视黄酸信号通路也可直接激活MAPK/ERK通路^［28］，且视黄酸能够通过诱导GATA4等促分化因子的转录，促进内胚层来源的细胞分化^［29］。本研究发现DUX与视黄酸有相似的结合基序，进而调控相同的靶基因，过表达DUX激活了视黄酸信号通路；如果抑制视黄酸受体，可能会抑制DUX与视黄酸下游相同的靶基因的转录，这些基因既有调节重编程相关的功能，也有促进分化的能力。

此外，本研究将为DUX异常激活导致的疾病治疗提供新思路。人类同源蛋白DUX4在成体肌肉细胞中的异常上调与面肩肱骨肌营养不良症（facioscapulohumeralmuscular dystrophy，FSHD）相关^［30］。尽管DUX与DUX4的同源结构域和结合序列存在差异，但是它们都会激活2C基因的表达，其中可能存在的机制为两者通过结合并激活不同的内源性反转录转座子，导致临近基因的强烈表达^［15］。在FSHD中DUX4的不当表达会引发细胞凋亡^［31］，而在DUX诱导的2CLC中也观察到严重的DNA损伤^［32］，这种细胞毒性可能源自2C时期特异性基因的异常激活，比如PRAME（preferentially expressed antigen in melanoma）家族基因^［33］等。而在胚胎发育卵裂过程中，DUX的短暂激活并没有导致细胞死亡，这可能得益于ZSCAN4等相关因子的作用。已知ZSCAN4参与了ESC端粒和基因组稳定性的维持，以及保护2C胚胎免受DNA损伤^［34-36］。因此，DUX增强了Zscan4的转录激活，会在一定程度上弥补其对细胞造成的伤害。在视黄酸处理的2CLC形成体系中，PRAME和ZSCAN4家族基因都会被激活^［37-38］。鉴于DUX与视黄酸受体可能存在的交互影响，抑制视黄酸途径的某些关键分子可能在FSHD中抵消DUX4的作用，该领域的研究有望为此类疾病的靶向治疗奠定基础。