上海交通大学学报（医学版）

上海交通大学学报(医学版), 2024, 44(2): 169-182 doi: 10.3969/j.issn.1674-8115.2024.02.003

论著 · 基础研究

基于单细胞测序技术解析冠状动脉粥样硬化患者平滑肌细胞的细胞间通信及关键基因

司春婴,1,2, 王建茹2, 李晓辉,2, 王永霞1,2, 关怀敏2

1.河南中医药大学第一临床医学院（中西医结合学院），郑州 450003

2.河南中医药大学第一附属医院心脏中心/国家区域（中医）心血管诊疗中心，郑州 450003

Study on intercellular communication and key genes of smooth muscle cells in human coronary atherosclerosis based on single cell sequencing technology

SI Chunying,1,2, WANG Jianru2, LI Xiaohui,2, WANG Yongxia1,2, GUAN Huaimin2

1.The First Clinical Medical College (College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine), Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450003, China

2.Heart Center/National Regional (Traditional Chinese Medicine) Cardiovascular Diagnosis and Treatment Center, The First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450003, China

通讯作者: 李晓辉，电子信箱：478103511@qq.com。

编委: 吴洋

收稿日期: 2023-05-19   接受日期: 2023-12-11  

基金资助: 河南省自然科学基金青年基金项目.  232300420273
河南省医学科技攻关计划联合共建项目.  LHGJ20230690
国家自然科学基金青年基金项目.  82205021
河南省科技攻关项目.  212102311083
河南中医药大学科研苗圃工程项目.  MP2020-16

Corresponding authors: LI Xiaohui，E-mail：478103511@qq.com.

Received: 2023-05-19   Accepted: 2023-12-11  

作者简介 About authors

司春婴（1987—），男，讲师，主治医师，硕士；电子信箱：chunyingsi1987@163.com。 E-mail：chunyingsi1987@163.com。

摘要

目的·利用单细胞RNA测序技术（single-cell RNA sequencing，scRNA-Seq）阐释冠状动脉粥样硬化（coronary atherosclerosis，CA）的细胞通信景观，挖掘主导细胞亚群及其关键基因。方法·下载GSE131778数据集并进行预处理、质控、降维聚类及注释；利用CellChat包进行细胞通信分析，识别主导细胞亚群。利用FindAllMarker函数，筛选主导细胞亚群与其他细胞亚群间的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），并构建其蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，将Degree算法排序前五位的DEGs作为关键基因。将关键基因与CellChat分析出的细胞通信网络进行匹配和挖掘，获取关键基因参与的配体-受体对（ligand-receptor pair，L-R）及其介导的信号通路，并对结果进行可视化。构建动脉粥样硬化小鼠模型，并利用反转录聚合酶链式反应检测关键基因在颈动脉粥样硬化病变处的表达情况。结果·在CA病变处共鉴定出11个细胞亚群，包括平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞、单核细胞等。细胞通信分析结果显示，CellChat在11个细胞亚群中检测到70对显著的L-R和26条相关的信号通路；平滑肌细胞处于通信活跃状态，与其他细胞亚群间相互作用的次数和强度最显著，是主导细胞亚群。DEGs筛选结果显示，平滑肌细胞亚群和其他细胞亚群之间共有206个DEGs，其中ITGB2、PTPRC、CCL2、DCN、IGF1被识别为关键基因。关键基因介导的细胞通信分析结果显示：CCL2与ACKR1形成L-R，通过介导CCL信号通路参与平滑肌细胞与内皮细胞间的通信网络；ITGB2分别与ITGAM、ITGAX组成受体复合物，再与C3形成L-R介导补体信号通路，参与平滑肌细胞与巨噬细胞、单核细胞间的通信网络。动物实验对关键基因的验证结果同生物信息学分析的结果一致。结论·平滑肌细胞在CA病理过程中是主导细胞，与其他细胞间有广泛的通信网络，可通过CCL2-ACKR1、C3-（ITGAM+ITGB2）和C3-（ITGAX+ITGB2）介导的CCL和补体信号通路，与内皮细胞、巨噬细胞和单核细胞构建细胞通信网络。

关键词： 冠状动脉粥样硬化 ; 单细胞RNA测序 ; 平滑肌细胞 ; 细胞通信

Abstract

Objective ·To use single-cell RNA sequencing (scRNA-Seq) technology to interpret the cellular communication landscape of coronary atherosclerosis (CA), and to explore the dominant cell subsets and their key genes. Methods ·The GSE131778 data set was downloaded and preprocessed, and quality controlling, dimension reduction clustering and annotation were carried out. Then cell communication analysis was conducted by using CellChat package to identify dominant cell subsets. The FindAllMarker function was used to screen differentially expressed genes (DEGs) between the dominant cell subpopulation and other cell subpopulations, and its protein-protein interaction (PPI) network was constructed. The DEGs ranked in the top five of the Degree algorithm were taken as key genes. Then, the key genes were matched and mined with the cell communication network analyzed by CellChat to obtain the ligand-receptor pairs (L-R) and the signal pathways mediated by the key genes, and the results were visualized. At the same time, the atherosclerosis mouse model was constructed and RT-PCR was used to detect the expression of key genes in carotid atherosclerosis lesions. Results ·A total of 11 cell subsets were identified in CA lesions, including smooth muscle cells, endothelial cells, macrophages, monocytes, etc. Cell communication results showed that CellChat detected 70 significant L-R and 26 related signal pathways in 11 cell subsets. Smooth muscle cell was the dominant cell subgroup with the most significant interaction frequency and intensity with other cell subgroups in the active state of communication. The results of DEGs screening showed that there were 206 DEGs between smooth muscle cell subsets and other cell subsets, among which ITGB2, PTPRC, CCL2, DCN and IGF1 were identified as key genes. The results of cell communication mediated by key genes showed that CCL2 and ACKR1 formed L-R and participated in the communication network between smooth muscle cells and endothelial cells through mediating CCL signaling pathway. ITGB2 formed receptor complexes withITGAM and ITGAX respectively, and then formed L-R with C3 to mediate the complement signal pathway, participating in the communication network among smooth muscle cells, macrophages and monocytes. The validation results of hub genes in animal experiments were consistent with the results of bioinformatics analysis. Conclusion ·Smooth muscle cells are the dominant cells in the pathological process of CA, and have extensive communication networks with other cells. They can construct cellular communication networks with endothelial cells, macrophages and monocytes through CCL and complement signaling pathways mediated by CCL2-ACKR1, C3-(ITGAM+ITGB2) and C3-(ITGAX+ITGB2).

Keywords： coronary atherosclerosis ; single-cell RNA sequencing (scRNA-Seq) ; smooth muscle cell ; cellular communication

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本文引用格式

司春婴, 王建茹, 李晓辉, 王永霞, 关怀敏. 基于单细胞测序技术解析冠状动脉粥样硬化患者平滑肌细胞的细胞间通信及关键基因. 上海交通大学学报(医学版)[J], 2024, 44(2): 169-182 doi:10.3969/j.issn.1674-8115.2024.02.003

SI Chunying, WANG Jianru, LI Xiaohui, WANG Yongxia, GUAN Huaimin. Study on intercellular communication and key genes of smooth muscle cells in human coronary atherosclerosis based on single cell sequencing technology. Journal of Shanghai Jiao Tong University (Medical Science)[J], 2024, 44(2): 169-182 doi:10.3969/j.issn.1674-8115.2024.02.003

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种涉及多个血管床的进行性炎症性疾病，其特征是脂质、纤维成分和钙化在动脉内膜中积累。然而，不同血管区域的病理特征和临床表现各不相同。冠状动脉因其特殊的解剖位置及其血流动力学特征，是最早和最容易产生斑块的血管部位［1］。多项证据表明，AS及其并发的冠状动脉疾病是导致大多数心血管疾病患者死亡的原因［2］。一项关于冠状动脉粥样硬化（coronary atherosclerosis，CA）斑块变化与不良心血管事件的meta分析结果显示，无论急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）患者，还是非ACS患者，其冠状动脉斑块的消退与减少心肌梗死和重复血管重建的发生率具有显著的相关性［3］。因此，研究CA发生机制一直是防治心血管疾病的重点。众所周知，细胞间通信作为一个关键过程，可确保不同类型细胞之间的合作并维持体内平衡［4］。研究发现细胞通信介导了与CA发病相关的免疫反应、炎症、增殖及血管重塑等相关机制［5-6］。因此，深入探索CA中细胞间通信作用及相关病理机制，挖掘关键基因，对于更好地理解CA的发病机制以及寻求防治靶点具有积极的作用。

近年来，单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-Seq）技术已成为研究动脉性疾病细胞机制的重要工具［7］。该技术以较高的分辨率揭示了细胞异质性，能够在复杂的群体组合中对所有细胞类型进行分子区分，同时将空间信息纳入细胞间通信分析，这对于系统、全面地探索组织中的细胞间通信至关重要［8-9］。既往研究主要集中在AS中巨噬细胞、平滑肌细胞等细胞的异质性［10-11］。借助scRNA-Seq技术分析AS血管中的细胞功能和通信作用，有助于探索新的AS治疗途径［12］。因此，本研究结合scRNA-Seq技术和生物信息学分析，探索人CA平滑肌细胞的细胞间通信及关键基因，以期更好地理解CA的病理过程及平滑肌细胞介导CA的潜在作用机制，为AS诊断和治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 数据来源

CA的scRNA-Seq数据集GSE131778源自GEO数据库（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/geo/）。该数据集利用10×Chromium平台对人右冠状动脉近中端的8个样本进行高通量单细胞转录组分析。在排除支架区域后，病变部位包括从轻度、非钙化斑块到晚期钙化病变区域［11］。使用stringr包将样本的GSM号与细胞的barcodes号进行关联，并保存为“CA.txt”文件。

1.2 数据的质控、降维和聚类

使用R语言读取“CA.txt”文件中的数据，若基因名重复，则使用avereps函数对其取均值。使用CreateSeuratObject函数将“CA.txt”文件的数据矩阵转换为Seurat对象，使用PercentageFeatureSet函数计算线粒体基因的百分比，过滤掉测到的基因数目（nFeature）<50、线粒体基因百分比（percent.mt）>5%的细胞［13］。然后，使用NormalizeData函数对数据进行标准化，利用FindVariableFeatures函数提取在细胞间变异系数较大的基因（可代表细胞间的异质性）。使用ScaleData函数对数据进行标准化预处理后，再依次进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和t分布随机邻接嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）降维聚类。

1.3 细胞类型注释

基于FindAllMarker函数筛选出的细胞亚群（Cluster）间的高变异差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），利用SingleR包对不同的Cluster进行细胞名注释。

1.4 细胞间通信分析

利用CellChat包进行细胞间通信分析［14］。分别读取Seurat对象中经过质控标准化的矩阵数据和细胞亚群注释信息，创建CellChat对象；使用CellChatDB.human配体和受体数据库进行比对，计算细胞通信的概率，推断细胞通信网络，识别主导细胞亚群，从细胞层面对细胞通信结果进行可视化。

1.5 主导细胞亚群DEGs的筛选及功能富集分析

利用FindAllMarker函数，以|log（fold change，FC）|>1和矫正后的P<0.05为标准，筛选主导细胞亚群与其他细胞亚群间的DEGs［13］。利用clusterProfiler包对DEGs进行基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，并进行可视化。

1.6 主导细胞亚群关键基因的筛选

将获得的DEGs载入STRING数据库（https：//string-db.org）中，选择“Multiple proteins”，将相互作用得分设置为最高置信度≥0.400，进行蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析。同时，利用Cytoscape 3.7.2软件构建PPI网络，将CytoHubba插件中Degree算法排序前五位的DEGs作为关键基因［15］。

1.7 关键基因参与的细胞通信

基于“1.4”部分的细胞通信网络，载入关键基因，寻找关键基因参与的细胞通信网络，获取关键基因介导的信号通路，并对通路和关键基因，即参与的配体-受体对（ligand-receptor pair，L-R）介导的细胞通信结果进行可视化。

1.8 实验验证

1.8.1 构建动物模型及分组

健康雄性C57BL/6Cnc小鼠，SPF级，7~8周龄［湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（湘）2019-0004］；以C57BL/6Cnc小鼠为背景的雄性ApoE-/-小鼠，SPF级，7~8周龄［常州卡文斯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（苏）2021-0013］。实验动物使用许可证号为SYXK（鄂）2023-0104。动物体质量为20~24 g，饲养在SPF条件下。

以C57BL/6Cnc小鼠为空白组（n=3），给予普通饲料；以ApoE-/-小鼠为AS模型组（n=3），给予高脂饲料。喂养8周后，摘取小鼠主动脉组织，部分存放于4%多聚甲醛中，用于苏木精-伊红（H-E）染色；部分置于冻存管中，于-80 ℃冰箱中保存备用。通过H-E染色，镜下观察到小鼠主动脉组织内中膜厚薄不均，斑块内可见胆固醇脂的沉积、泡沫细胞和炎症细胞浸润、纤维组织增生等改变，则判定为AS造膜成功［16］。

1.8.2 主要试剂及仪器

苏木精（Servicebio，货号G1004），伊红（Servicebio，货号E8090），中性树脂（Solarbio，货号G8590），DAB浓缩型试剂盒（Solarbio，货号DA1010-2），10 mmol/L dNTP Mix（Solarbio，货号PC2200），DNase/RNase-Free Water（Solarbio，货号R1600），二甲苯（国药集团，货号10023418），氯仿（国药集团，货号10006818），异丙醇（国药集团，货号80109218），无水乙醇（国药集团，货号10009218），SYBR FAST qPCR Master Mix（KAPA Biosystems，货号KM4101）。组织包埋机（湖北泰维，TB-718D），显微镜（德国徕卡，DM1000），恒温烘箱（上海一恒，DHG-9023A），石蜡切片机（德国徕卡，RM2235），PCR仪（杭州柏恒，GE48527），荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad，CFX-Connect 96）。

1.8.3 H-E染色观察AS小鼠主动脉斑块

切取小鼠主动脉组织块厚度约为3 μm；常规水浴展片、捞片，并及时烤片；将组织切片常规脱蜡至水，水洗1~2 min；苏木精液染色5 min，伊红液染色3 min，梯度乙醇及二甲苯处理后，用中性树脂封片，显微镜下观察。

1.8.4 RT-PCR检测关键基因的mRNA表达

取小鼠主动脉组织样本100 mg，提取总RNA，用PrimeScript Ⅱ RTase预混液进行反转录提取cDNA，再用SYBR FAST qPCR Master Mix预混液制备cDNA，然后进行PCR扩增。数据分析运用2-ΔΔCT法，计算ITGB2、PTPRC、CCL2、DCN和IGF1的相对表达量。引物序列由武汉天一华煜基因科技有限公司合成（表1）。

表1   RT-PCR引物序列

Tab 1  Primer sequence for RT-PCR

PrimerSequence (5'→3')Length/bp
ITGB2-FACCTCATGGATCTCTCCTACTC274
ITGB2-RCCGACCTCTGTCTGAAACTG
PTPRC-FAGTCTCTACGCAAAGCACGG254
PTPRC-RAGCACTATTGGTAGGCTCCG
CCL2-FGCTGACCCCAAGAAGGAATG183
CCL2-RTGAGGTGGTTGTGGAAAAGG
DCN-FAATCCCTTATGACCCTGACA275
DCN-RTTTCCAACTTCACGAGAGGT
IGF1-FGATGCTCTTCAGTTCGTGTG259
IGF1-RGCTTCGTTTTCTTGTTTGTC
GAPDH-FCCTTCCGTGTTCCTAC152
GAPDH-RGACAACCTGGTCCTCA

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2 结果

2.1 数据质控的结果

对GSE131778数据集中的样本进行预处理后，共获得11 756个细胞。如图1所示，创建Seurat对象后，过滤掉nFeature<50且percent.mt>5%的细胞，筛选出细胞间标准化方差较大的1 500个基因用于后续分析。

图1

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图1   GSE131778数据集样本的质控结果

Note：A. Number of cell genes in the sample. B. Number of transcript sequencing counts in the sample. C. The proportion of mitochondria in all the cells in the sample. D. The top 1 500 mutated genes with high intercellular standard deviation.

Fig1   Quality control results for samples from the GSE131778 dataset


2.2 降维聚类及注释结果

图2A展示了变异最显著的主成分PC1和PC2中每个样本所含细胞的总体分布。图2B显示了前20个P<0.05的主成分。t-SNE聚类分析结果显示，11 315个细胞被分为18个Cluster（图2C）；注释后18个Cluster又被分为11种细胞亚群，包括平滑肌细胞（3个Cluster）、B细胞（3个Cluster）、软骨细胞（1个Cluster）、树突细胞（dendritic cell，DC；1个Cluster）、内皮细胞（2个Cluster）、巨噬细胞（1个Cluster）、单核细胞（2个Cluster）、T细胞（1个Cluster）、组织干细胞（2个Cluster）、自然杀伤细胞（1个Cluster）、神经元细胞（1个Cluster），见图2D。

图2

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图2   GSE131778数据集中样本的降维聚类及注释结果

Note：A.The distribution of cells in the sample in PC1 and PC2. B. P value for each PC. C. t-SNE plot of clustering distribution of 18 cell subpopulations. D. t-SNE diagram of the distribution of cell subpopulations after annotation. NK cell—nature killer cell; DC—dendritic cell.

Fig 2   Dimension reduction clustering and annotation results for samples in the GSE131778 dataset


2.3 细胞通信分析结果

通过CellChat包在人CA病变处的11个细胞亚群中检测到70对显著的L-R，介导26条分泌型信号通路，主要包括CC族趋化因子配体（CC chemokine ligand，CCL）、趋化因子（C-X-C基序）配体（C-X-C chemokine ligand，CXCL）、补体、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等，参与了CA的病理过程。在CA病理变化过程中，不同的细胞亚群间存在着广泛的交流和通信网络关系，其中平滑肌细胞与其他细胞亚群间交互作用的次数最多，强度最大（图3A、B）。平滑肌细胞不仅可以向自身发送通信信号，还可以向其他10种细胞亚群发送通信信号，其中与巨噬细胞、单核细胞、内皮细胞的相互作用强度最明显（图3C）。以上结果提示，平滑肌细胞与其他细胞亚群间的通信状态较为活跃，是CA病变处的主导细胞亚群。

图3

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图3   CA病变处的细胞通信网络

Note：A.Communication network diagram of the number of interactions among different cell clusters. B.Communication network diagram of interaction strength among different cell clusters. C. Communication network diagram of the interaction strength between a single cell cluster and other clusters. The color of the dots represents different cell clusters. The size of the dots represents the number of cells contained in the cell cluster, and the larger the dots, the more cells there are. The line represents the interaction relationship among the clusters, and the color represents the signal sent from the cluster as the sender to the cluster as the receiver. The thickness of the line represents the number of interactions (strength) among the clusters, and the thicker the line, the more interactions (strength) there are.

Fig 3   Cellular communication network at CA lesions


2.4 平滑肌细胞DEGs的筛选及其富集分析

差异分析的结果显示，平滑肌细胞亚群和其他细胞亚群之间的有206个DEGs，其中138个上调，68个下调（图4A）。GO功能富集分析结果显示：依据q<0.05确定了1 201个GO条目；生物学过程（biological process，BP）条目为1 032条，主要涉及靶向细胞膜的共翻译蛋白、核转录mRNA分解代谢过程、靶向内质网（endoplasmic reticulum，ER）的蛋白质等；细胞组分条目（cellular component，CC）为108条，主要涉及黏着斑、核糖体、细胞质等；分子功能（molecular function，MF）条目为61条，主要涉及核糖体的结构组成、细胞黏附分子的结合、rRNA的结合等（图4B）。KEGG通路富集分析结果显示，依据q<0.05共映射出43条信号通路，与AS相关的通路包括吞噬体、抗原加工提呈、细胞黏附分子、补体及凝血级联反应等（图4C）。

图4

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图4   平滑肌细胞DEGs的筛选及其富集分析

Note：A.Volcano plot of DEGs in smooth muscle cells (dots represent genes, black represents genes with no differential expression, red represents upregulated DEGs, and blue represents downregulated DEGs). B. Bubble plots for GO enrichment analysis of DEGs. C. Circle diagram of KEGG enrichment analysis of DEGs.

Fig 4   Screening of DEGs in smooth muscle cells and their enrichment analysis


2.5 平滑肌细胞关键基因的筛选

将平滑肌细胞的DEGs上传至STRING数据库进行PPI分析后，利用Cytoscape软件对网络进行可视化分析，该网络包括980条边和179个节点（图5A）。如图5B、C所示，CytoHubba插件中Degree算法排序前五的DEGs为关键基因，即ITGB2、CCL2、PTPRC、DCN和IGF1，其中ITGB2和PTPRC为下调关键基因，CCL2、DCN、IGF1为上调关键基因。如图5D所示，与其他Cluster相比，在平滑肌细胞中CCL2、DCN、IGF1的表达和分布相对较高，ITGB2和PTPRC的表达和分布相对偏低。

图5

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图5   平滑肌细胞关键基因的筛选结果

Note： A. PPI network diagram of smooth muscle cell DEGs, with red circles representing upregulated DEGs and green triangles representing downregulated DEGs. B. PPI diagram of 5 hub genes. C. Circle diagram of chromosomal positions of hub genes. D. Bubble plot of 5 hub genes expressed in 11 clusters.

Fig 5   Results of screening for hub genes in smooth muscle cells


2.6 关键基因介导的细胞通信结果

在CellChat包推算的70对显著的L-R及其介导的26条分泌型信号通路中，关键基因CCL2和ITGB2参与了平滑肌细胞与其他Cluster间的细胞通信。CCL2与ACKR1形成L-R介导CCL信号通路；ITGB2分别与ITGAM、ITGAX形成复合物作为受体，与C3形成L-R介导补体信号通路（表2）。CCL信号通路介导了除DC和B细胞之外的Cluster间的细胞通信，其中平滑肌细胞的主要信号角色为发送者（sender）和影响者（influencer）（图6A、B）。CCL2-ACKR1对CCL信号通路的贡献度最高，并在平滑肌细胞与内皮细胞间的通信关系中发挥重要的作用（图6C、D）。如图6E~I所示：补体信号通路介导了平滑肌细胞与巨噬细胞、单核细胞间的相互作用关系，平滑肌细胞的信号角色为发送者和影响者，C3-（ITGAM+ITGB2）和C3-（ITGAX+ITGB2）在补体信号通路中具有一定的贡献度；C3-（ITGAM+ITGB2）介导了平滑肌细胞与巨噬细胞、单核细胞间的通信，C3-（ITGAX+ITGB2）介导了平滑肌细胞与巨噬细胞间的通信。总之，平滑肌细胞可通过CCL2-ACKR1介导的CCL信号通路、C3-（ITGAM+ITGB2）和C3-（ITGAX+ITGB2）介导的补体信号通路在CA病变处与其他细胞相互作用和交流。

表2   关键基因介导的细胞间信号通路

Tab 2  Hub genes-mediated cell signaling pathway

SourceTargetLigandReceptorProbabilityP valueInteraction namePathwayAnnotationEvidence (PMID)
ChondrocyteEndothelial cellCCL2ACKR10.0530.000CCL2-ACKR1CCLSecreted signaling26740381
MacrophageEndothelial cellCCL2ACKR10.0420.000CCL2-ACKR1CCLSecreted signaling26740381
MonocyteEndothelial cellCCL2ACKR10.0470.000CCL2-ACKR1CCLSecreted signaling26740381
NeuronEndothelial cellCCL2ACKR10.0600.000CCL2-ACKR1CCLSecreted signaling26740381
Smooth muscle cellEndothelial cellCCL2ACKR10.2440.000CCL2-ACKR1CCLSecreted signaling26740381
Tissue stem cellEndothelial cellCCL2ACKR10.0210.000CCL2-ACKR1CCLSecreted signaling26740381
MacrophageMacrophageC3ITGAM_ITGB20.0040.000C3-(ITGAM+ITGB2)ComplementSecreted signaling16234578
Smooth muscle cellMacrophageC3ITGAM_ITGB20.0400.000C3-(ITGAM+ITGB2)ComplementSecreted signaling16234578
MacrophageMonocyteC3ITGAM_ITGB20.0050.000C3-(ITGAM+ITGB2)ComplementSecreted signaling16234578
Smooth muscle cellMonocyteC3ITGAM_ITGB20.0460.000C3-(ITGAM+ITGB2)ComplementSecreted signaling16234578
MacrophageMacrophageC3ITGAX_ITGB20.0040.000C3-(ITGAX+ITGB2)ComplementSecreted signaling16234578
Smooth muscle cellMacrophageC3ITGAX_ITGB20.0400.000C3-(ITGAX+ITGB2)ComplementSecreted signaling16234578

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图6

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图6   关键基因介导的细胞间通信

Note： A. Cellular communication network diagram mediated by CCL signaling pathway. B. Heat map of cell action types in the CCL signaling pathway. C. Bar chart of the contribution of L-R in the CCL signaling pathway. D. CCL2-ACKR1-mediated cellular communication network diagram. E. Cellular communication network diagram mediated by complement signaling pathway. F. Heat map of cellular action types in complement signaling pathways. G. Bar graph of the contribution of L-R in the complement signaling pathway. H. C3-(ITGAM+ITGB2)-mediated cellular communication network diagram. I. C3-(ITGAX+ITGB2)-mediated cellular communication network diagram.

Fig 6   Hub genes-mediated cellular communication


2.7 实验结果验证

2.7.1 AS小鼠主动脉斑块情况

H-E染色结果显示：空白组主动脉组织中无AS病理改变，动脉组织结构完整；AS模型组病理组织中可见明显斑块改变，内膜显著增厚，平滑肌细胞排列紊乱（图7）。

图7

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图7   小鼠主动脉组织H-E染色

Fig 7   H-E staining of aortic tissue of mice


2.7.2 AS模型小鼠中关键基因的mRNA表达

与空白组比较，AS模型小鼠颈动脉AS斑块组织中ITGB2和PTPRC mRNA表达水平显著下调（P<0.05），CCL2、DCN和IGF1 mRNA明显上调（P<0.05），见表3。

表3   各组小鼠关键基因mRNA表达水平 （x±s， n=3）

Tab 3  mRNA expression levels of hub genes in each group of mice （x±s， n=3）

GroupITGB2PTPRCCCL2DCNIGF1
Control1.04±0.341.00±0.061.01±0.191.01±0.151.00±0.06
AS0.45±0.11①0.21±0.01②2.19±0.57③1.57±0.11④4.24±1.14⑤

Note: ①P=0.044, ②P=0.042, ③P=0.027, ④P=0.006, ⑤P=0.008, compared with the control group.

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3 讨论

AS是一个复杂的病理过程，涉及多种细胞的多种改变，包括单核细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞，以及血小板等之间复杂的相互作用模式，可导致缺血性心脏病［17］。有研究报道，不同细胞类型可以通过L-R建立高度连接的信号网络进行通信［18］，并且这种细胞间通信对于协调多种生物学过程至关重要［19］。目前，我们对于CA过程中发生的细胞间相互作用的了解仍然有限。因此，为进一步探究在CA过程中不同细胞类型之间通过配体与受体结合而相互调控交流的信息，本研究利用CellChat进行细胞间通信分析。

首先，本研究通过scRNA-Seq技术将人CA斑块组织中11 315个细胞进行了聚类，并注释了平滑肌细胞、B细胞、软骨细胞及DC等11个细胞亚群，筛选CA中存在的70对显著的L-R，其可介导多种细胞之间的通信网络关系，包含内皮细胞与平滑肌细胞、巨噬细胞与B细胞、单核细胞与T细胞等。结果显示，平滑肌细胞的通信作用最频繁，且与巨噬细胞的细胞间通信最强。本研究与既往研究结果相一致，CA组织中的平滑肌细胞不仅可以向自身发送通信信号，还可以向其他细胞（巨噬细胞、内皮细胞等）发送通信信号。例如，TGF-β/Smad3的升高诱导平滑肌细胞分泌的血管内皮生长因子A，是其凋亡的自分泌抑制剂，继而抑制平滑肌细胞凋亡［20］。平滑肌细胞衍生的TGF-β可以促进活化的新生内膜病变样巨噬细胞的成熟［21］。此外，平滑肌细胞通过低密度脂蛋白受体相关蛋白1受体将内膜中脂质内化，获得促血栓形成表型并释放组织因子，加速疾病进展［22］。

本研究还发现，与其他细胞亚群相比，在CA的平滑肌细胞中存在206个DEGs，主要通过吞噬体、细胞黏附分子、补体及凝血级联反应等途径参与调控血管动脉硬化的病理过程。进一步筛选出5个关键基因，包括ITGB2、CCL2、PTPRC、DCN及IGF1，其中ITGB2和PTPRC为下调DEGs，CCL2、DCN、IGF1为上调DEGs。ITGB2即整合素β2，作为调节白细胞功能（如黏附和迁移）的细胞表面跨膜蛋白，其黏附作用被认为是心血管疾病的关键事件［23］。此外，ITGB2的低表达影响了AS中平滑肌细胞的迁移［24］。PTPRC是一种跨膜糖蛋白，又称CD45，通常存在于细胞表面，在先天免疫系统中起着重要的作用［25］。已有研究证实PTPRC不仅在CA斑块内的表达水平影响动脉斑块的炎症反应［26］，其在冠状动脉粥样硬化性心脏病患者外周血中的表达与支架内再狭窄密切相关［27］。CCL2又称单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1），是一种炎症介质，能够诱导趋化活性和增加钙内流［28］。有研究报道平滑肌细胞自噬能力减弱，能增强细胞中CCL2表达，继而加重血管重构及AS病变［29］。还有研究发现，平滑肌细胞衍生的CCL2不仅可以诱导血管干/祖细胞的迁移及有助于新内膜形成［30］，还可与血小板表面结合，触发单细胞阻滞作用［31］。DCN是一种细胞外基质蛋白聚糖，通过调节炎症、纤维化、细胞增殖及迁移等过程，影响AS发生和进展［32-33］。有研究通过微阵列分析发现平滑肌细胞中的DCN与AS中血管钙化相关机制有关［34］。IGF1作为一种内分泌和自分泌/旁分泌生长因子，是参与CA的胰岛素样生长因子系统的主要配体［35］。研究发现，miR-378a的上调通过靶向IGF-1能显著抑制染色体结构维持蛋白（structural maintenance of chromosome，SMC）增殖、迁移和炎症，发挥抑制AS进展的作用［36］。

这5个存在SMC中的关键基因介导的细胞间通信，主要包括2条途径。①通过CCL2-ACKR1介导CCL通路，在多个细胞间发挥了重要的通信作用。趋化因子及其受体与AS的病理过程密切相关［37］。有研究［38］发现在AS病变动脉中CCL2及其受体ACKR1表达增加最显著。平滑肌细胞释放的CCL2能促进纤维细胞的迁移［39］，而ACKR1在内皮连接处富集［40］。基于L-R的细胞-细胞相互作用分析表明，ACKR1表达的内皮细胞簇之一表现出强趋化性和弱血管生成能力，并随着疾病进展而扩大［41］。然而，目前尚无研究报道CCL2-ACRK1形成的L-R通过介导平滑肌细胞与其他细胞间通信作用发挥调节CA的作用。但本研究发现，CCL2与ACKR1复合物相结合，激活CCL通路从而加速CA斑块形成。这对进一步研究CA的病理生理过程具有重要参考价值，为靶向调控CA斑块进展提供了新的依据。②通过C3-（ITGAM+ITGB2）和C3-（ITGAX+ITGB2）介导补体通路，在平滑肌细胞与巨噬细胞、单核细胞间的通信中发挥了一定作用。补体系统在先天免疫中起着核心作用，在AS的诱导和发展中起着重要作用，包括促进单细胞募集、诱导平滑肌细胞的活化和增殖［42］、诱导内皮功能障碍、促进炎症小体活化及白细胞介素的分泌、参与血栓形成等［43］。目前，已有研究发现免疫细胞与免疫相关SMC之间存在复杂的细胞间通信网络。C3作为一种关键炎症介质，通过免疫复合物激活补体系统参与AS过程，且与平滑肌细胞的合成表型相关［44-45］。β2整合素包括整合素αMβ2（ITGAM与ITGB2复合物）和整合素αXβ2（ITGAX+ITGB2复合物），具有白细胞分布特征；其中整合素αXβ2参与DC中的抗原提呈，以及单核细胞和巨噬细胞至动脉血管硬化病变处的跨内皮迁移［46］。单核细胞/巨噬细胞通过活化的整合素αMβ2的黏附，在巨噬细胞交替活化过程中具有调节和潜在的动脉粥样硬化保护功能［47］。此外，C3通过与β2整合素受体结合，参与吞噬、细胞黏附、细胞外基质重排及迁移等作用［48］。本研究发现C3分别与αXβ2和αMβ2形成L-R参与补体通路，并在SMC与相关免疫细胞的通信网络中发挥了一定作用，为靶向调控CA病理过程提供一定的参考依据。

本研究的动物实验验证结果显示，与空白组比较，AS小鼠表现出明显的斑块病理改变；AS模型组中ITGB2和PTPRC mRNA表达水平显著下调，CCL2、DCN和IGF1 mRNA表达水平均明显上调，与预测的结果一致。

综上所述，在CA中平滑肌细胞可以通过CCL通路、补体系统招募内皮细胞、巨噬细胞、单核细胞，加剧动脉血管壁堵塞。本研究阐释了CA环境中不同细胞间的通信景观，有助于理解各细胞在CA病程中的通信关系，以及以平滑肌细胞为主要通信关系的关键靶点及作用机制在CA中作用。

本研究尚存在一些局限性。第一，本研究是基于公共数据库开展的研究。GEO数据库中有关CA的scRNA-Seq数据较少，且缺乏其不同病理阶段的样本数据，故而本研究纳入的样本偏少，不能观察CA早期至晚期或稳定斑块至不稳定斑块等不同病理过程的动态演变特征。第二，scRNA-Seq技术在分析单细胞的转录组方面仍面临许多挑战和局限性［49］。例如，scRNA-Seq技术无法可靠地检测低丰度转录本；丢失了细胞在组织中至关重要的空间位置信息；对样本要求比较高，样本制备的过程可能会导致细胞死亡，造成背景信号较高等。这些问题可能会导致一些基因及细胞亚群不能被有效地挖掘。第三，CellChat基于当前已证明的L-R相互作用关系，对细胞间的通信网络进行建模。因其与Seurat衔接比较好，同时又具备丰富的可视化函数，是当前研究细胞通信的热门工具。但由于L-R相互作用数据库尚不够完善，仍有较多的L-R未被发现和验证，可能会使CellChat构建的细胞通信缺失或不全面。第四，本研究对主要结果未开展生物学验证。后续还需要利用空间转录组、单细胞核转录组测序等先进的技术方法进行验证。

总之，本研究从单细胞的视角探索了CA内细胞间的全局通信景观，拓宽了其研究维度，结果发现在CA病理过程中平滑肌细胞与其他细胞亚群间存在广泛的通信关系，是主导细胞亚群；ITGB2、PTPRC、CCL2、DCN、IGF1是平滑肌细胞的关键高变异DEGs；平滑肌细胞可通过CCL2-ACKR1、C3-（ITGAM+ITGB2）和C3-（ITGAX+ITGB2）介导的CCL和补体信号通路与内皮细胞、巨噬细胞和单核细胞产生复杂的通信关系。本研究有助于以平滑肌细胞为切入点阐释CA的病理生理学机制，可为CA的精准防治提供一定的思路。

作者贡献声明

司春婴提出研究思路和框架，负责撰写论文；王建茹负责实验设计；王建茹、李晓辉参与数据统计和修改论文；王永霞和关怀敏指导研究实施。

AUTHOR's CONTRIBUTIONS

SI Chunying proposed research ideas and framework, and wrote the paper. WANG Jianru was responsible for the experiment design.WANG Jianru and LI Xiaohui participated in data statistics and paper revision. WANG Yongxia and GUAN Huaimin guided the research and implementation.

利益冲突声明

所有作者声明不存在利益冲突。

COMPETING INTERESTS

All authors disclose no relevant conflict of interests.

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