支气管哮喘（简称哮喘）是儿童最常见的慢性呼吸道疾病，以慢性气道炎症和气道高反应性为特征。哮喘主要临床表现为反复发作的喘息、咳嗽、气促、胸闷，常在夜间和（或）凌晨发作或加剧^［1］。2010年全国哮喘流行病学调查^［2］显示，我国主要城市14岁以下儿童哮喘累积患病率已达3.02%，较10年前和20年前分别上升了43.4%和147.9%。作为一种具有高度异质性的疾病，空气污染、呼吸道感染、年龄、过敏原、吸烟史、肥胖等多种因素均可影响哮喘的类型和严重程度，甚至诱导重症哮喘的发生^［3］。

国内外的哮喘指南和专家共识将“依从性好且吸入技术正确，经优化的高剂量吸入糖皮质激素（inhaled corticosteroid，ICS）+长效β2受体激动剂（long-acting β2-agonist，LABA）治疗后仍未控制，或需要高剂量ICS/LABA才能维持控制者”称为重症哮喘（severe asthma，SA）患者，将“经过第1级、第2级治疗能达到完全控制者”称为轻度哮喘患者，“经过第3级治疗能达到完全控制者”称为中度哮喘患者^［4］。重症哮喘患者虽只占哮喘总人数的5%~10%，但其疾病恶化风险更高，急诊就医率和住院率是轻度、中度哮喘患者的15~20倍，且具体机制尚未明确^［5-6］。

微塑料是指粒径小于5 mm的塑料颗粒，其中粒径小于100 nm的称为纳米塑料（nanoplastics，NPs）。微塑料作为细颗粒物（particulate matter 2.5，PM_2.5）的组成成分之一，在空气中广泛存在。西班牙的一项研究^［7］发现，在大气收集的PM₁₀和PM_2.5中分别检测到了2.09 ng/m³和1.81 ng/m³的聚苯乙烯微塑料（polystyrene microplastics）。在兰州、西安、北京、长春、武汉、成都、上海、广州8个城市的道路扬尘PM_2.5中均检测出不同浓度的微塑料存在^［8］。微塑料可通过气道吸入，在人体肺组织中沉积^［9］，并与肺功能下降、间质性肺炎、肺癌、支气管炎等多种呼吸系统疾病的发生密切相关，但微塑料尤其是NPs暴露对重症哮喘患者的潜在危害及其作用机制尚不明晰。因此，本研究拟通过构建重症哮喘小鼠模型，探讨NPs对重症哮喘发生发展的影响及可能机制，以期为评估NPs暴露的潜在环境风险及制定儿童哮喘防治策略提供理论依据。

肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar type Ⅱ epithelial cells，AT2 cells）MLE-12细胞系，从复旦大学生物医学研究院（Institutes of Biomedical Sciences，IBS）细胞资源中心（Fudan IBS Cell Center，FDCC）获得，并严格遵循FDCC给出的培养条件和指导方针。使用MLE-12完全培养基，细胞培养箱条件为37 ℃、5%CO₂，并保持湿润。

SPF级C57BL/6雌性小鼠，6~8周龄，购自上海斯莱克公司，实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2022-0004，使用许可证号为SYXK（沪）2022-0012。饲养于复旦大学附属儿科医院SPF级动物房，环境温度22 ℃，光照12 h/黑暗12 h，无噪声。饲以标准饲料，自由摄食和饮水。

屋尘螨（house dust mite，HDM）提取物（GREER Labora，美国），脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（Invitrogen，美国）。地塞米松（dexamethasone，DEX）、荧光蓝胺改性聚苯乙烯乳胶微球L0780（Sigma-Aldrich，美国）。荧光标记抗磷酸化γ-H2A.X抗体、抗p53抗体、抗Chk1抗体（Abcam，美国）。抗磷酸化Chk1抗体、抗磷酸化p53抗体（CST，美国）。抗GAPDH兔多克隆抗体（Sangon Biotech，中国），抗ATR多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，中国）。别藻蓝蛋白（APC）荧光抗Ly-6G/Ly-6C抗体、PerCP-Cy5.5荧光抗CD3ε单克隆抗体（Invitrogen，美国）。异硫氰酸荧光素（FITC）荧光抗CD107b抗体、藻红蛋白（PE）荧光抗CD170抗体、PerCP-Cy5.5荧光抗CD19抗体（BioLegend，美国）。抗Ly-6G抗体（Signalway Antibody，美国），抗表面活性物质相关蛋白C（surfactant-associated protein C，SFTPC）多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，中国）。苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，H-E）染色试剂盒、过碘酸希夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色试剂盒（武汉博士德，中国）。CCK-8细胞计数试剂盒（Dojindo，日本）。荧光素异硫氰酸酯/膜联蛋白Ⅴ凋亡检测试剂盒（BD，美国）。Ceralasertib（Selleck，美国）。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibco，美国）。MLE-12培养基（上海富衡，中国）。SYBR^® PrimeScript™反转录试剂盒、SYBR^® Green PCR试剂盒（TaKaRa，日本），RNA引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］。7500实时荧光定量PCR系统，FACS Calibur流式细胞仪（BD，美国）。台式高速低温离心机（Eppendorf，德国），台式高速冷冻离心机（卢湘仪离心机仪器，中国），相差倒置生物显微镜（Leica，德国）。

（1）重症哮喘小鼠模型构建

参考既往文献^［10-12］，使用HDM和LPS建立重症哮喘小鼠模型，以1×磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）作为对照。将C57BL/6小鼠随机分为4组，每组5只：空白对照组（PBS/PBS/PBS）、轻度中度哮喘组（HDM/PBS/PBS）、重症哮喘组（HDM/LPS/PBS）及重症哮喘地塞米松治疗组（HDM/LPS/DEX）。实验第1~3日，轻度中度哮喘组、重症哮喘组及地塞米松治疗组小鼠每日气道滴注50 μL的HDM溶液（1 mg/mL）致敏，空白对照组通过相同方式给予同体积PBS；第14~17日，上述3组每日气道滴注50 μL的HDM溶液（0.1 mg/mL）激发，空白对照组给予PBS；第19、20、22日，重症哮喘组及地塞米松治疗组小鼠每日气道滴注50 μL的LPS（5 μg/mL），轻度中度哮喘组及空白对照组小鼠给予等体积PBS处理，间隔6 h后，予重症哮喘地塞米松治疗组小鼠腹腔注射100 μL地塞米松溶液（125 μg/mL），其余组小鼠腹腔注射同体积PBS。若重症哮喘组小鼠的气道炎症显著强于轻度中度哮喘组，且地塞米松治疗组结果显示该组小鼠的气道炎症不能被地塞米松抑制则认为模型构建成功。

（2）暴露于聚苯乙烯纳米塑料的重症哮喘小鼠模型构建及分组

使用粒径50 nm的荧光蓝胺改性聚苯乙烯乳胶微球作为聚苯乙烯纳米塑料（polystyrene nanoplastics，PS-NPs）单体进行后续实验。在重症哮喘模型基础上，通过气道滴注的方式构建暴露于PS-NPs的重症哮喘小鼠模型。将小鼠随机分为4组，每组5只：空白对照组（PBS/PBS/PBS）、PS-NPs组（PBS/PBS/PS-NPs）、重症哮喘组（HDM/LPS/PBS）及重症哮喘+PS-NPs组（HDM/LPS/PS-NPs）。实验第1~3日和第14~17日，PS-NPs组及重症哮喘+PS-NPs组小鼠首先每日气道滴注50 μL PS-NPs（1 μg/μL），至少间隔6 h后再次滴注HDM；空白对照组及重症哮喘组小鼠不滴注PS-NPs而以同样方式给予同体积的PBS，至少间隔6 h后再次滴注HDM。第19、20、22日，重症哮喘+PS-NPs组及重症哮喘组小鼠每日气道滴注50 μL的LPS（5 μg/mL），PS-NPs组及空白对照组小鼠气道滴注同体积的PBS处理，HDM剂量同“1.2.1（1）”。

模型构建后，予所有实验小鼠气管插管并注入4 ℃ 0.8 mL无菌PBS，回抽支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）约0.5 mL，重复1次，共收集BALF约1 mL。使用1 mL FACS buffer重悬细胞沉淀，取50 μL用于计数，剩余BALF离心，弃上清液，取细胞沉淀。加入100 μL按比例混合的PE荧光抗CD170抗体（1∶200）、FITC荧光抗CD107b抗体（1∶200）、PerCP-Cy5.5荧光抗CD19抗体（1∶250）、PerCP-Cy5.5荧光抗CD3ε单克隆抗体（1∶100）和APC荧光抗Ly-6G抗体（1∶200），4 ℃避光孵育40 min。加入1 mL FACS buffer洗涤后固定，进行流式细胞术检测。

模型构建后，分离所有实验小鼠左肺，4%多聚甲醛固定后，经常规脱水、透明，石蜡包埋切片、烘干。

（1）H-E染色

取肺组织切片，脱蜡、水化、抗原修复、洗涤后行H-E染色，评估气道炎症严重程度。炎症分级如下：0级（气管周围正常、无炎症细胞浸润），1级（仅有少量炎症细胞浸润），2级（气管周围一圈一层细胞厚的炎症细胞环），3级（2~4层细胞厚的炎症细胞环），4级（大多数支气管或血管被4层细胞厚的炎症细胞环包围）。

（2）PAS染色

取肺组织切片，脱蜡、水化等步骤同前。行PAS染色，评估气道黏液分泌情况。根据5级制评分系统（0~4分）对病理变化进行量化：0分（PAS阳性细胞<5%），1分（PAS阳性细胞5%~25%），2分（PAS阳性细胞26%~50%），3分（PAS阳性细胞51%~75%）和4分（PAS阳性细胞>75%）。

（3）免疫组织化学染色

取肺组织切片，脱蜡、洗涤等步骤同前。将玻片置于30 mg/mL H₂O₂溶液中，室温避光25 min以阻断内源性过氧化物酶，洗涤。3%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液室温封闭30 min，甩掉封闭液后滴加PBS稀释的Ki67一抗（1∶500），4 ℃孵育过夜；PBS洗涤3次，在切片上滴加相应的二抗（1∶2 000），室温避光孵育1 h；PBS洗涤3次，滴加现配的二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）辣根过氧化物酶显色液，1 min后洗涤切片并复染细胞核，脱水封片、晾干后，中性树胶封片。

每组小鼠随机选5个样本，每张切片随机选取不重叠的3个视野观察肺组织病理改变。采用图像处理软件ImageJ计算切片视野内的所有肺泡数（单位：个/mm²）和肺泡平均面积（单位：μm²）。

（4）脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法染色

取肺组织切片，脱蜡、洗涤等操作同前。甩干切片，在组织周围滴加100 μL稀释的蛋白酶K工作液（200 μg/mL），37 ℃温箱孵育22 min，洗涤3次后滴加50 μL脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）检测液，37 ºC避光孵育60 min，洗涤3次；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）复染，洗涤3次；抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。

（5）酪胺信号放大多重荧光染色

取肺组织切片，脱蜡、抗原修复等操作同前；加一抗抗SFTPC多克隆抗体（1∶1 000），加相应的二抗孵育，洗涤。第一次荧光染色：去除洗液，向组织上滴加适量1×酪胺信号放大（Tyramide signal amplification，TSA）染料工作液（1∶100 ddH₂O稀释），室温避光孵育10 min，洗涤3次；微波加热，室温冷却，洗涤3次；重新封闭，加一抗（抗p53抗体，1∶500；抗ATR多克隆抗体，1∶500）、加二抗孵育，洗涤。第二次荧光染色，操作同第一次荧光染色直至室温冷却洗涤，清洗结束DAPI染核及封片。

使用免疫荧光法标记细胞吞噬PS-NPs后的DNA损伤。从Sigma-Aldrich定制包埋有Alexa Fluor 488的50 nm胺修饰聚苯乙烯乳胶珠。将1×10⁴个MLE-12细胞接种到预先放置有爬片的24孔板中，PS-NPs刺激12 h后，PBS浸洗3次，每次5 min；室温静置固定15 min，PBS浸洗3次。随后滴加适量0.1% Triton通透10 min后，PBS浸洗10 min，重复3次。将FBS以3%浓度稀释于0.1% Triton中制备3% FBST，3% FBST室温静置封闭1 h后加入荧光标记抗磷酸化γ-H2A.X抗体（1∶200），4 ℃孵育过夜。次日，PBST漂洗细胞爬片3次，每次5 min。DAPI复染细胞后，滴加适量荧光抗淬灭剂并封片。将载玻片置于共聚焦显微镜下观察各组细胞吞噬PS-NPs情况及各组DNA损伤差异。

（1）PS-NPs抑制AT2细胞增殖

将MLE-12细胞接种于96孔板中，密度5×10³个/孔，并划分为对照组和实验组（PS-NPs组）。隔日细胞贴壁后，实验组更换为含0、5、10、20、40 μg/mL不同浓度PS-NPs的培养基，对照组更换为不含PS-NPs的培养基。分别于0、24、48 h，将对应96孔板更换含10% CCK-8试剂的培养基，置于细胞培养箱避光孵育2 h，于450 nm处酶标仪检测吸光度。

（2）ATR抑制剂对PS-NPs抑制细胞增殖的恢复作用

将分装有5 mg Ceralasertib粉末的2 mL微型离心管以4 ℃ 1 500×g离心5 min，随后每管中加入121.2 μL二甲基亚砜（DMSO）吹打振荡至完全溶解，得到100 mmol/L Ceralasertib溶液，置于-20 ℃冰箱储存。准备好接种有MLE-12细胞的96孔板，方法同“1.2.5（1）”，分为空白对照组、PS-NPs组、iATR组和PS-NPs+iATR组，隔日贴壁；在CCK-8实验前预解冻100 mmol/L Ceralasertib溶液。分别制备含有0.1 μmol/L Ceralasertib的培养基，及不含Ceralasertib但含有同等浓度DMSO的培养基；PS-NPs+iATR组及iATR组在PS-NPs暴露前，在含有0.1 μmol/L Ceralasertib的培养基中预处理2 h，其他组给予含有同等浓度DMSO的培养基作为对照；2 h后，PS-NPs+iATR组及PS-NPs组更换为含20 μg/mL PS-NPs的培养基，空白对照组、iATR组更换为不含PS-NPs的培养基，后续CCK-8孵育、检测同“1.2.5（1）”。

（1）PS-NPs诱导AT2细胞凋亡

将MLE-12细胞接种于12孔板上，密度1×10⁵个/孔，并划分为对照组和实验组（PS-NPs组）。隔日使用含有10 μg/mL PS-NPs和200 μmol/L H₂O₂的培养基处理实验组细胞，用只含200 μmol/L H₂O₂的培养基处理对照组细胞。12 h后，使用无乙二胺四乙酸（EDTA）胰酶消化制备单细胞悬液，1 500×g离心3 min，弃上清液。4 ℃预冷PBS洗涤细胞后，再次离心弃上清液，随后加入500 μL的1×binding buffer重悬细胞，再分别加5 μL的Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液混匀，室温、避光条件下孵育15 min。30 min内进行流式细胞术检测。

（2）ATR抑制剂对PS-NPs诱导细胞凋亡的恢复作用

准备好接种有MLE-12细胞的12孔板，方法同“1.2.6（1）”，分为空白对照组、PS-NPs组和iATR＋PS-NPs组，隔日贴壁；将“1.2.5（2）”中制备的100 mmol/L Ceralasertib预解冻；分别制备含有0.3 μmol/L Ceralasertib的培养基，及不含Ceralasertib但含有同等浓度DMSO的培养基；将PS-NPs+iATR组在PS-NPs暴露前，在含有0.3 μmol/L Ceralasertib的培养基中预处理2 h，其他组给予含有同等浓度DMSO的培养基作为对照；2 h后，PS-NPs+iATR组及PS-NPs组更换为含10 μg/mL PS-NPs的培养基，空白对照组、iATR组更换为不含PS-NPs的培养基，处理12 h，后续消化、染色、检测等操作同“1.2.6（1）”。

将MLE-12细胞接种于24孔板上，密度2×10⁴个/孔，并划分为对照组和实验组（PS-NPs组）。隔日使用含有15 μg/mL PS-NPs的培养基处理实验组细胞，用不含PS-NPs的培养基处理对照组细胞。12 h后，Trizol试剂提取总RNA，并按照反转录试剂盒说明书将其反转录为cDNA。引物序列见表1。根据说明书使用SYBR^® Green PCR试剂盒进行实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qPCR）。按照每个样本2个复孔，每孔5 μL，将反应体系加至384孔板上，在7500实时荧光定量PCR系统中进行定量检测。设置如下反应程序：95 ℃ 0 s（20 ℃/1 s）→65 ℃ 15 s（20 ℃/1 s）→95 ℃ 0 s（20 ℃/1 s），循环数为40次。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法计算各基因mRNA的相对表达水平。

将MLE-12细胞接种于6孔板上，密度5×10⁵个/孔，并划分为对照组和实验组（PS-NPs组）。隔日使用含有15 μg/mL PS-NPs的培养基处理实验组细胞，用不含PS-NPs的培养基处理对照组细胞。24 h后弃去培养基，PBS洗涤后，加入70 μL RIPA裂解液，4 ℃裂解15 min后离心，吸取上清液，并使用BCA蛋白试剂盒定量，加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，95 ℃金属浴中加热5 min。经12% SDS-PAGE凝胶电泳、半干法转PVDF膜、5% BSA封闭，洗膜，加入对应一抗（工作浓度1∶1 000），4 ℃孵育过夜，加入1∶2 000稀释的HRP标记的二抗，室温孵育2 h，滴加ECL显影液，曝光显影。采用ImageJ软件进行灰度分析。

采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析。每个结果来自3次独立的重复实验。数据采用x±s表示，采用Student t-test检验分析2组间差异，比较2组以上的差异采用ANOVA检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

相比于空白对照组，轻度中度哮喘组（HDM/PBS/PBS）在气道滴注HDM后，BALF炎症细胞总数及嗜酸性粒细胞数量明显上升（均P<0.001）；而与轻度中度哮喘组相比，重症哮喘组（HDM/LPS/PBS）BALF中炎症细胞总数及嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞数量显著增加，特别是中性粒细胞数量增加明显（均P<0.05），并且地塞米松治疗（HDM/LPS/DEX）未能降低重症哮喘小鼠的气道炎症细胞数量（图1A）。

肺组织病理切片结果显示，与空白对照组相比，轻度中度哮喘小鼠支气管及血管周围有大量的炎症细胞浸润，气道黏液分泌显著增加；与轻度中度哮喘小鼠相比，重症哮喘小鼠气道炎症更为严重，炎症细胞浸润及黏液分泌显著增加，气道周围还可见大量中性粒细胞聚集，气道炎症评分显著上升（均P<0.05），同时地塞米松治疗后炎症水平和气道黏液分泌无明显改善（图1B、C）。上述结果表明，重症哮喘小鼠模型构建成功。

BALF流式细胞术结果显示，相比于重症哮喘组，重症哮喘+PS-NPs组（HDM/LPS/PS-NPs）炎症细胞总数、嗜酸性粒细胞数、淋巴细胞数均上升，并且巨噬细胞和中性粒细胞数量增加明显（均P<0.05，图2A）。肺组织的病理切片可见，重症哮喘小鼠经PS-NPs暴露后，表现出比重症哮喘组更严重的肺组织炎症，浸润炎症细胞数量增多，管腔黏液分泌显著增加（图2B），且炎症评分差异有统计学意义（均P<0.05，图2C）。

此外，肺组织切片H-E染色发现，空白对照组肺组织病理形态无异常改变，肺泡结构完整清晰、分布均匀，肺泡腔彼此分离、大小正常、无断裂、融合，肺泡内及肺泡周围均无炎症细胞浸润；PS-NPs组肺泡腔内及肺间质中有少量炎症细胞浸润，但肺泡仍然维持正常的结构；重症哮喘组肺泡腔内及肺间质中出现大量炎症细胞浸润，肺组织充血水肿，少部分肺泡塌陷，肺泡壁断裂水肿。计算肺泡截面积和单位面积肺泡数量发现，重症哮喘组的肺泡截面积［（1 066.85±55.93）μm²］相比于空白对照组［（1 868.69±49.94）μm²］略有下降，但差异无统计学意义；而重症哮喘+PS-NPs组小鼠的肺泡结构紊乱，肺泡腔明显扩大且肺泡壁断裂，相互融合成肺大泡，相比于空白对照组［（1 868.69±49.94）μm²］及重症哮喘组［（1 066.85±55.93）μm²］，重症哮喘+PS-NPs组的平均肺泡截面积［（8 899.09±402.77）μm²］显著增加，而肺泡数量［（50.41±3.69）个/mm²］也显著少于空白对照组［（176.30±14.73）个/mm²］及重症哮喘组［（222.53±15.13）个/mm²］。这表明暴露于NPs会引起重症哮喘小鼠肺泡损伤，但不会对正常小鼠的肺泡造成显著的破坏（图3）。

已有研究^［13-15］证明，NPs能够通过气道吸入沉积在人类、大鼠或小鼠的肺部，引起气道炎症反应和肺损伤。为了进一步明确本实验所采用的PS-NPs能否被小鼠AT2细胞所摄取，我们使用包埋有荧光基团的PS-NPs对MLE-12进行处理。使用PS-NPs处理12 h后，观察到PS-NPs聚集在MLE-12的细胞核周围（图4A），表明PS-NPs可以被MLE-12摄取。

随后CCK-8实验结果显示，与对照组相比，当PS-NPs高于10 μg/mL时，细胞增殖活力随着PS-NPs暴露浓度增加而降低。在相同剂量下，PS-NPs达到20 μg/mL及以上时，干预48 h时的MLE-12细胞活力的下降相比于干预24 h时更为显著；当PS-NPs为40 μg/mL时，MLE-12的细胞活力几乎完全丧失（图4B）。以上结果证明PS-NPs能够抑制AT2细胞增殖，并表现出浓度和时间依赖性。根据这一结果，我们选择10、20 μg/mL这2个浓度进行后续实验。Annexin-Ⅴ FITC/PI双染色流式细胞术结果显示，PS-NPs组MLE-12细胞凋亡率为（56.20±3.84）%，与对照组［（23.22±2.52）%］相比，细胞凋亡率明显升高（P<0.001）（图4C、D）。

Ki67基因表达增加与细胞增殖活跃程度密切相关^［16］，Bax、Bid、Trp53基因表达增加则与细胞凋亡的发生有关^［17］。qPCR结果显示，与对照组相比，处理后的MLE-12细胞中Ki67表达水平明显下降，而Bax、Bid、Trp53表达水平明显上升。结果同样揭示了体外暴露于PS-NPs可以显著抑制细胞增殖并促进细胞凋亡（图4E）。

此外，TUNEL染色结果也证明，与空白对照组和重症哮喘组小鼠相比，PS-NPs暴露促进了重症哮喘小鼠肺组织细胞凋亡（图5）。上述结果表明，PS-NPs暴露抑制了重症哮喘小鼠AT2细胞增殖并进一步促进其凋亡，但具体机制尚不明确。

已有研究证实，空气污染物如PM_2.5^［18-19］、PM₁₀^［20］、香烟烟雾^［21-22］等均能引起上皮细胞DNA损伤从而激活毛细血管共济失调突变基因（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）/细胞周期检测点激酶2（cell cycle checkpoint kinase 2，Chk2）信号通路或ATM与Rad3相关蛋白激酶（ATM and Rad3-related kinase，ATR）/Chk1/p53信号通路，上调p53表达，引起细胞凋亡增加。γ-H2A.X为DNA损伤的标志物^［23］。因此，我们通过免疫荧光技术检测PS-NPs暴露后γ-H2A.X的免疫荧光染色，发现在MLE-12细胞内吞PS-NPs之后，γ-H2A.X染色结果呈阳性，表明PS-NPs可能通过DNA损伤介导细胞凋亡的发生（图6A）。

qPCR结果表明，给予PS-NPs干预12 h后，MLE-12细胞ATR/Chk1/p53信号通路的关键分子Atr、p53、p21、Cdk6、Ccnd1表达水平升高，且与凋亡相关的基因Bax、Bid、Bcl-2、Bax/Bcl-2表达水平上升，Ki67表达水平下降，差异具有统计学意义（均P<0.05，图6B）。Western blotting结果表明，ATR、Chk1、p53蛋白的表达水平及Chk1、p53蛋白的磷酸化水平增高，差异具有统计学意义（均P<0.05，图6C）。

小鼠肺组织中，除了AT2细胞还存在AT1细胞、血管内皮细胞等其他上皮或非上皮细胞等，而SFTPC是AT2细胞的常用标志物^［23］。为了明确PS-NPs在体内对于AT2细胞的影响，我们选择SFTPC标记AT2细胞。免疫荧光共定位结果显示，与未暴露PS-NPs的小鼠相比，PS-NPs暴露后的重症哮喘小鼠肺组织AT2细胞中ATR及p53表达水平显著增加（图7）。这证明无论在体内还是体外，PS-NPs均能诱导AT2细胞ATR/Chk1/p53信号通路相关蛋白的表达增加。

为进一步验证PS-NPs通过ATR/Chk1/p53信号通路调控AT2细胞的增殖和凋亡，我们选择Ceralasertib作为ATR激酶的特异性抑制剂重复相关实验。CCK-8实验结果表明，Ceralasertib可以明显减轻PS-NPs对

MLE-12细胞增殖的抑制（图8A）；Annexin-Ⅴ FITC/PI双染色流式细胞术结果证明，Ceralasertib可以部分逆转PS-NPs所诱导的细胞凋亡，差异均具有统计学意义（图8B、C）。

作为PM_2.5的组成成分之一，微塑料在空气中广泛存在^［7-8］，并可在人体肺组织中沉积^［9］，与肺功能下降、间质性肺炎、肺癌、支气管炎等的发生密切相关^［24］。但微塑料尤其是NPs暴露对重症哮喘患者的潜在危害及作用机制尚不明晰。本研究以气道滴注粒径50 nm的PS-NPs模拟自然环境下的NPs空气暴露，使用HDM和LPS构建重症哮喘小鼠模型。结果表明，PS-NPs能够被AT2细胞摄取，从而引起上皮细胞DNA损伤，激活ATR/Chk1/p53通路，上调p53表达，引起AT2细胞增殖减少、凋亡增加，最终导致重症哮喘加重。

NPs可能参与了重症哮喘的发生发展。气道中性粒细胞的浸润与活化被认为与重症哮喘发生密切相关^［25-27］。还有少数研究表明，吸入微塑料会增加哮喘的发病率和死亡率^{［24，28-29］}，并引起气道炎症和肺损伤^［30-31］。但始终没有研究聚焦微塑料能否引起重症哮喘中的中性粒细胞数量变化。本研究发现在暴露于PS-NPs（50 μg/d，共7 d）后，重症哮喘小鼠中性粒细胞浸润显著增加，同时气道炎症明显加重，提示NPs可能通过中性粒细胞参与重症哮喘的发生发展。此外，本研究还发现未致敏小鼠暴露于PS-NPs后，其BALF中炎症细胞数量和肺组织切片染色结果均无显著变化，推测低剂量的NPs暴露可能对没有呼吸系统疾病的人群无显著影响。

研究表明，AT2细胞能够通过细胞自噬、Ras基因家族同源物A（ras homolog gene family member A，RhoA）/溶质转运蛋白家族26成员4（solute carrier family 26 member 4，SLC26A4）轴等抑制由过敏原诱导的哮喘气道炎症^［32-33］，对于哮喘的疾病进展有保护作用。因此我们猜测PS-NPs暴露造成了AT2细胞数量的损失，进而加重重症哮喘。CCK-8实验证实，PS-NPs显著抑制MLE-12细胞系的细胞增殖；我们还通过Annexin Ⅴ-FITC/PI双染色法、qPCR实验、TUNEL染色实验证明PS-NPs在体内或体外均可促进细胞凋亡。为进一步探究PS-NPs的作用机制，我们查阅文献得知其他空气污染物，如PM_2.5^［18-19］、PM₁₀^［20］、香烟烟雾^［21-22］、柴油机尾气颗粒物^［34］等，均能引起上皮细胞DNA损伤从而启动DNA损伤修复反应（DNA damage response，DDR），激活ATR/Chk1/p53或ATM/Chk2/p53通路，从而引起细胞凋亡增加^［23］。我们首先通过γ-H2A.X免疫荧光染色证明了PS-NPs诱导DNA损伤。接着，通过qPCR及Western blotting证明了PS-NPs在体外激活ATR/Chk1/p53信号通路。为进一步明确PS-NPs在体内对AT2细胞的影响，我们使用SFTPC标记AT2细胞。免疫荧光共定位结果显示，与未暴露PS-NPs的小鼠相比，PS-NPs暴露后的重症哮喘小鼠肺组织中AT2细胞的ATR及p53表达水平显著增加，确定了PS-NPs在体内同样诱导AT2细胞ATR/Chk1/p53信号通路的上调。而ATR抑制剂Ceralasertib能够恢复AT2细胞的增殖能力，减少PS-NPs诱导的细胞凋亡。结合以上实验结果可以推测，PS-NPs暴露能够造成AT2细胞DNA损伤，激活ATR/Chk1/p53信号通路，进而调控AT2细胞的增殖和凋亡，引起重症哮喘气道炎症加重和肺泡结构破坏。

与其他空气污染物的研究相比，本研究未能探究所采用的NPs在不同剂量下的作用差异。在前期摸索阶段，除暴露于PS-NPs（50 μg/d，共7 d）的重症哮喘组之外，本研究还设置了暴露于其他剂量PS-NPs（100 μg/d，共7 d或10 μg/d，共7 d）的重症哮喘组。然而，结果发现暴露于PS-NPs（100 μg/d，共7 d）后该组小鼠体质量明显降低，饮食及活动减少；且在HDM致敏阶段，10只小鼠已死亡2只；在HDM激发阶段，1只小鼠在给予100 μg PS-NPs后当场死亡，1只小鼠在给予HDM后当场死亡，另有2只小鼠当日给药后依然存活，但分别在第17、18日清晨检查鼠笼时发现死亡。剩余4只小鼠在LPS给药阶段中死亡2只，仅存活2只。因此该组实验数据已不能采用。在对幸存2只小鼠取肺组织切片后，我们观察到其肺部严重的纤维化和肺大泡形成，经课题组讨论认为100 μg剂量的PS-NPs毒性过强而放弃。在尝试更低剂量的PS-NPs（10 μg/d，共7 d）暴露后，亦发现该组的重症哮喘小鼠与未经PS-NPs暴露的重症哮喘小鼠仅表现出微弱的炎症增强趋势，但结果不具有统计学差异，因而放弃了在后续实验中继续设置其他的PS-NPs暴露剂量，此为本研究的不足之处。

综上所述，本研究揭示NPs可通过ATR/Chk1/p53途径调控AT2细胞的DNA损伤、增殖与凋亡，进而导致重症哮喘炎症细胞浸润增加和管腔黏液分泌显著增加。研究结果为阐明NPs诱导重症哮喘加重的分子机制提供基础，为后续研究指明方向。