急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是临床常见的并发症，既往认为AKI是一种良性可逆的临床综合征，但近来临床与实验研究皆表明该疾病与慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）密切相关^［1］。在AKI恢复的患者中，1/3患者在2~5年内将发展成CKD^［2］。众多研究表明，反复和严重的AKI更会增加CKD发病风险，最终可能进展为终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）^［3］。

目前认为AKI引起的肾纤维化可能由受损的肾小管上皮细胞与肾小管周围的成纤维细胞相互作用引起。长时间缺血或反复中毒，使肾小管上皮细胞丧失分化和再生能力，同时受损的肾小管上皮细胞分泌炎症因子和包括转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）在内的各种生长因子等，促使成纤维细胞转化为α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）阳性的肌成纤维细胞，合成大量细胞外基质等成分，并促进炎症细胞浸润，最终出现不可逆的肾纤维化^［4］。如何有效预防和延缓AKI向CKD转化是目前肾脏病研究的重点和热点。

淫羊藿苷（icariin，ICA）是中药淫羊藿（又称仙灵脾）的主要有效成分。前期研究发现淫羊藿苷对血管紧张素Ⅱ诱导的肾纤维化模型^［5］及单侧输尿管梗阻模型^［6］具有明显的保护作用。此外，淫羊藿苷对顺铂引起的AKI也有保护作用^［7］。但目前对淫羊藿苷是否能预防或延缓AKI向CKD转化尚无研究。

马兜铃酸（aristolochic acid，AA）肾病模型是一个经典的模拟药物引起人体AKI并向CKD转化（AKI-CKD）的动物模型^［8］。大剂量马兜铃酸可引起急性肾小管坏死并逐渐进展至肾间质纤维化^［9］。因此，本研究拟选用经典的马兜铃酸诱导的AKI-CKD模型^［10］，观察淫羊藿苷延缓AKI向CKD转化的保护作用并探讨其可能的机制，为临床新药开发与运用提供一定依据。

SPF级C57BL/6雄性小鼠，8周龄，体质量约20 g，购自上海吉辉实验动物责任有限公司，实验动物生产许可证编号为SCXK（沪）2018-0003；小鼠饲养于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院动物实验中心，使用许可证编号为SYXK（沪）2018-0040。正常大鼠肾小管上皮细胞株（NRK-52E）和正常大鼠肾脏成纤维细胞株（NRK-49F）购自ATCC细胞库。

马兜铃酸Ⅰ型（AA1，A5512）购自美国Sigma公司，淫羊藿苷（MB 2189-S）购自大连美仑生物技术有限公司，α-SMA抗体（ab5694）、Ⅰ型胶原蛋白抗体（collagen Ⅰ，cst72026）、F4/80抗体（ab16911）购自英国Abcam公司，活化的胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）抗体（9664）、辣根过氧化物酶（HRP）偶联的抗兔IgG（7074s），HRP偶联的抗小鼠IgG（7076s）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（3700T）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（5174）购自美国CST公司，聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，IPVH00005）购自德国Merk Millipore公司，Transwell细胞小室（3412）购自美国Corning公司，过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator activated receptor α，PPARα）抗体（MAI-822）、Lipofectamine 3000转染试剂盒（L3000150）购自美国Thermo Fisher公司，反转录试剂盒（RC112）、SYBR qPCR Master Mix（Q711）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，苏木精-伊红（H-E）染液（G1005）、Masson三色染色液（G1006）、过碘酸希夫（PAS）染液（G1008）购自武汉赛维尔生物科技有限公司，BCA蛋白定量检测试剂盒（P0009）购自上海碧云天生物技术有限公司。

实时定量PCR仪（型号ABI7900）购自美国ABI公司，荧光显微镜（型号BX51）购自日本Olympus公司，台式离心机（型号5418）购自美国Eppendorf公司，蛋白条带检测仪器（型号CHEMIDOC）购自美国Bio-Rad公司，病理烘片机（型号HI1220）购自德国Leica公司，透射电子显微镜（透射电镜，型号Talos F200X S/TEM）购自美国Thermo Fisher公司，全自动生化分析仪（型号ADVIA1800）购自德国Siemens公司。

18只小鼠适应性饲养2周后，称重、排序，根据随机数字表随机分为3组，分别为对照组-1、马兜铃酸（AA1）组-1、马兜铃酸+淫羊藿苷（AA1+ICA）组-1，每组6只。AA1组-1每3 d腹腔注射1次马兜铃酸（3 mg/kg），共注射5次，约2周，之后停药2周。注射马兜铃酸2周为急性期，停药2周为重塑期。AA1+ICA组-1在造模前1周即予以250 mg/（kg·d）淫羊藿苷［溶于5%浓度的二甲基亚砜（DMSO）与生理盐水的混合液］，灌胃给药5周。对照组-1与AA1组-1给予5%浓度的DMSO与生理盐水的混合液灌胃。急性期2周结束时小鼠眼眶后血管丛取血，隔日再行肾活检；重塑期2周结束时（4周）处死小鼠，眼球取血，并留取肾组织。

22只小鼠适应性饲养2周，随机分为3组（方法同“1.3.1”），分别为对照组-2（6只），马兜铃酸（AA1）组-2以及马兜铃酸+淫羊藿苷（AA1+ICA）组-2各8只。对照组-2以及AA1组-2给药方法同“1.3.1”，AA1+ICA组-2在马兜铃酸给药2周结束时给予250 mg/（kg·d）淫羊藿苷，灌胃给药2周。淫羊藿苷给药2周结束时（4周）处死小鼠，眼球取血，并留取肾组织。

小鼠麻醉后，侧卧位，从脊柱左侧旁开一指的部位做切口进入，切取肾脏上极约0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm大小的肾组织后，迅速予无菌棉签压迫止血10 min，确定止血后，缝合手术切口^［11］。

大鼠肾小管上皮细胞株和肾脏成纤维细胞株予以含5%胎牛血清的DMEM培养基培养。Transwell细胞小室用于共培养实验。将细胞分为3组，即DMSO组、马兜铃酸（AA1）组、马兜铃酸+淫羊藿苷（AA1+ICA）组。将肾小管上皮细胞接种在下室（第0日），次日（第1日）AA1组的上皮细胞予以40 μmol/L马兜铃酸作用24 h，AA1+ICA组在加入40 μmol/L马兜铃酸之前，提前1 h加入10^-6 mol/L淫羊藿苷，DMSO组加入等体积的DMSO溶液。第1日，另将肾脏成纤维细胞接种在Transwell上室，次日（第2日）将上室转移到肾小管上皮细胞（下室）上方共培养24 h；在共培养前，用PBS冲洗肾脏上皮细胞表面3次，以避免药物影响肾脏成纤维细胞。第3日，收集各组细胞株，提取细胞总RNA及蛋白^［12］。

应用全自动生化分析仪检测各组小鼠血尿素氮和肌酐值。

石蜡包埋各组小鼠肾脏组织，分别行H-E染色、PAS染色、Masson染色。应用Image-pro Plus 6.0软件分析每张照片的视野，定量分析各组小鼠组织切片Masson染色的胶原纤维面积百分比。根据H-E染色的肾组织切片，对肾小管损伤进行评分，评判标准^［13］为：0分，无肾小管损伤；1分，<10%肾小管受损；2分，10%~25%肾小管受损；3分，26%~50%肾小管受损；4分，51%~75%肾小管受损；5分，>75%肾小管受损。每只小鼠观察10张切片，每张组织切片观察20个视野。

制备4 μm厚度的肾组织石蜡切片，梯度二甲苯脱腊，梯度乙醇水化，予α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白、F4/80或PPARα一抗避光4 ℃过夜，次日复温1 h后加入二抗，DAB染色。每只小鼠观察5张切片，每张组织切片观察20个视野。

将组织迅速置于2.5%戊二醛固定液中，脱水包埋，超薄切片，透射电镜观察。

采用TRIzol法，提取肾脏组织或细胞株RNA；通过反转录获得cDNA。以cDNA为模板，行实时荧光定量PCR（real-time qPCR）。反应体系（20 μL）：ddH₂O 7.2 μL，cDNA模板 2 μL，上、下游引物各0.4 μL，SYBR Green Ⅰ 10 μL。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，72 ℃ 30 s，共40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。引物由上海华津生物科技有限公司合成，序列详见表1。小鼠肾脏以次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine phosphoribosyltransferase，Hprt）基因作为内参，大鼠细胞以β-肌动蛋白基因作为内参。采用2^-ΔΔCT法计算目标基因的相对水平。

采用Western blotting检测cleaved caspase-3、α-SMA、PPARα表达情况。提取各组细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。通过SDS-PAGE、转膜、一抗二抗孵育、底物化学发光显色，采用Image J软件对条带进行定量分析。

靶向大鼠Ppara特异性干扰小RNA（small interfering RNA，siRNA）和非特异性siRNA（NC-siRNA）均购自上海吉玛基因股份有限公司。特异性siRNA分别为siRNA-1（F：GGCGAACUAUUCGG-CUAAATT；R：UUUAGCCGAAUAGUUCGCCTT）、siRNA-2（F：GACCUGGAAAGUCCCUUAUTT；R：AUAAGGGACUUUCCAGGUCTT）、siRNA-3（F：C-CCGAGAGUUCCUAAAGAATT；R：UUCUUUAGG-AACUCUCGGGTT），选出转染效率最高的siRNA用于后续实验。

取对数生长期的肾小管上皮细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养基配成单细胞悬液，计数，接种至6孔板中，于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中过夜预培养。待融合度达60%~70%，选择合适的转染浓度，按照Lipofectamine 3000试剂盒说明书转染siRNA或NC-siRNA。转染48 h后，NC-AA1组和siRNA-AA1组加入40 μmol/L AA1处理24 h；NC-AA1+ICA组和siRNA-AA1+ICA组先提前1 h加入10^-4 mol/L淫羊藿苷，然后加入40 μmol/L AA1处理细胞24 h；NC-DMSO组和siRNA-DMSO组加入等体积DMSO。

实验数据采用GraphPad Prism 6软件处理。分析定量资料是否符合正态性及方差齐性：若符合正态性和方差齐性，以x¯±s_x 表示，重复测量资料多组间比较采用重复测量方差分析，其他资料多组间比较采用单因素方差分析；若不符合正态性或方差齐性，以M（Q₁，Q₃）表示，组间比较采用Kruskal-Wallis分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

3组小鼠按图1A的方式给药。在2周急性期结束时，与对照组-1相比，AA1组-1血清尿素氮水平显著升高（P<0.05），而AA1+ICA组-1血清尿素氮水平则较AA1组-1显著降低（P<0.05）；在4周时（重塑期结束），AA1组-1的血清尿素氮水平较2周时显著下降（P<0.05），但仍显著高于对照组-1和AA1+ICA组-1（均P<0.05，图1B）；而血清肌酐水平也与血清尿素氮水平表现出相似的变化趋势，而且4周时AA1+ICA组-1的血清肌酐水平较2周时进一步下调（P<0.05，图1C）。此结果初步提示，淫羊藿苷可预防马兜铃酸引起的肾功能损伤。

为进一步明确马兜铃酸诱导AKI-CKD模型中不同阶段肾脏病理结构的变化，以及淫羊藿苷对该模型的保护作用，我们在2周急性期结束时对各组小鼠行肾穿刺病理活检（图2）。与对照组-1比较，AA1组-1可见肾小管上皮细胞大量坏死，肾间质水肿伴大量炎症细胞浸润，肾小管损伤评分明显增高（均P<0.05）。与AA1组-1比较，AA1+ICA组-1肾小管损伤明显减轻，炎症细胞浸润减少，肾损伤评分降低，但差异无统计学意义。通过Masson染色，我们观察到各组小鼠肾组织无明显胶原沉积，证实该模型在2周时处于AKI阶段。

重塑期结束（4周）时，小鼠肾组织H-E染色及PAS染色结果显示，AA1组-1肾小管萎缩，肾损伤严重，伴肾间质炎症细胞浸润。AAI+ICA组-1肾小管损伤缓解，肾小管损伤评分较AA1组-1有改善趋势，但差异无统计学意义（图3A、B）。Masson染色提示，AA1组-1肾纤维化面积显著大于对照组-1和AA1+ICA组-1（均P<0.05，图3A、C）。此结果与肾功能结果一致：4周时模型小鼠病理观察提示明显肾纤维化，而淫羊藿苷可预防模型小鼠的肾纤维化进展。

线粒体作为细胞能量代谢的重要场所，其功能异常与肾损伤密切相关，我们观察到重塑期结束时对照组-1的肾小管上皮细胞线粒体形态正常完整，而在AA1组-1小鼠肾脏可观察到线粒体形态不规则，内嵴稀疏断裂、排列紊乱、肿胀变形，膜融合，而AA1+ICA组-1以上病变减轻。结果提示，淫羊藿苷可以预防马兜铃酸诱导的AKI-CKD模型的线粒体结构损伤（图4A）。

当肾小管上皮细胞损伤时，肾小管的主要线粒体代谢途径——脂肪酸氧化代谢通路明显被抑制。为进一步检测线粒体脂肪酸氧化代谢通路相关基因mRNA表达变化，本研究检测了4周时各组Ppara、Cpt1a、Cpt2、Acox2 mRNA的表达水平。与对照组-1比较，AA1组-1肾脏组织Ppara和脂肪酸氧化代谢酶Cpt1a、Cpt2、Acox2的表达量均显著降低（均P<0.05）；与AA1组-1相比，AA1+ICA组-1以上基因表达量均显著上调（均P<0.05，图4B~E）。PPARα在肾脏脂肪酸氧化的调节中起关键作用，是直接转录调控细胞内脂质代谢的关键转录因子，能调控脂肪酸氧化代谢酶包括Cpt1a、Cpt2、Acox2等多个基因的表达。通过PPARα免疫组织化学（组化）染色，我们发现4周时AA1组-1小鼠PPARα阳性细胞面积较对照组-1显著减少，而AA1+ICA组-1较AA1组-1阳性面积显著增加（均P<0.05，图4F、G）。

α-SMA和Ⅰ型胶原是肾间质纤维化的标志物，为进一步明确肾脏组织的纤维化程度，我们于重塑期结束时对各组肾组织行α-SMA和Ⅰ型胶原的免疫组化染色。与对照组-1比较，AA1组-1的α-SMA和Ⅰ型胶原的阳性面积均显著增大，而AA1+ICA组-1两者的阳性面积较AA1组-1均显著减小（均P<0.05，图5A~C）。为进一步观察肾纤维化相关mRNA的水平变化，本研究检测了Tgfb1、Fn、Col1a1 mRNA的表达水平。结果显示，3个mRNA水平变化趋势与免疫组化结果基本一致（图5D~F）。

目前研究表明炎症是促成AKI向CKD转化的核心因素之一，主要表现为炎症细胞的浸润和炎症介质的分泌。肾脏的炎症效应细胞主要有巨噬细胞、T淋巴细胞等。F4/80是小鼠巨噬细胞的标志物。通过F4/80免疫组化染色，可观察各组肾脏巨噬细胞的浸润情况。结果显示，重塑期结束时，AA1组-1 F4/80阳性面积较对照组-1显著增大，而AA1+ICA组-1的F4/80阳性面积较AA1组-1显著减小（均P<0.05，图6）。

如图7A所示，在模型急性期结束即2周时给予淫羊藿苷治疗2周。在重塑期结束（4周）时，AA1+ICA组-2血清尿素氮及血清肌酐水平均与AA1组-2差异无统计学意义（图7B、C）。肾组织病理观察提示，AAI+ICA组-2肾小管损伤评分及纤维化面积均与AA1组-2差异无统计学意义（图7D、E）。纤维化相关基因Col1a1、Col3a1、Fn、vimentin、Tgfb1 mRNA的表达水平也未在AA1组-2与AAI+ICA组-2之间观察到显著差异（图7F~J）。结果提示淫羊藿苷对马兜铃酸诱导的AKI-CKD小鼠模型主要是起到预防性保护作用。

为进一步明确淫羊藿苷是否通过保护肾小管上皮细胞，抑制肾脏成纤维细胞合成细胞外基质，我们予AA1和淫羊藿苷共同干预肾脏上皮细胞株后，与肾脏成纤维细胞株共培养。结果发现，与DMSO组比较，AA1组肾小管上皮细胞的脂质代谢核心转录因子Ppara mRNA表达显著下降（P<0.05）；与AA1组比较，AA1+ICA组Ppara mRNA表达上调（P<0.05，图8A）。AA1组肾小管上皮细胞炎症及纤维化相关的Tnfa、Ctgf、Tgfb1 mRNA表达水平亦显著高于DMSO组（均P<0.05）；AA1+ICA组这3个mRNA表达水平较AA1组有下降趋势，但差异无统计学意义（图8B~D）。检测上皮细胞的凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达发现：与DMSO组比较，AA1组cleaved caspase-3表达显著升高（P<0.05）；AA1+ICA组cleaved caspase-3表达与AA1组比较显著下降（P<0.05，图8E）。同时还检测了肾脏成纤维细胞细胞外基质相关基因表达的变化：与DMSO组比较，AA1组Fn和Col1a1 mRNA表达均显著升高（均P<0.05）；AA1+ICA组Fn mRNA水平较AA1组显著降低（P<0.05），而Col1a1 mRNA表达水平下降，但差异无统计学意义（图8F、G）。Western blotting结果发现，AA1组成纤维细胞的α-SMA表达较DMSO组和AA1+ICA组均显著升高（均P<0.05，图8H）。

为进一步明确淫羊藿苷对肾小管上皮细胞保护作用的可能机制，采用Ppara特异性siRNA转染肾小管上皮细胞。从蛋白和mRNA水平检测发现，siRNA3可有效敲低肾小管上皮细胞中PPARα的表达（图9A、B）。与NC-AA1+ICA组比较，siRNA3-AA1+ICA组Ppara及其下游Cpt1a、Cpt2 mRNA表达水平均下降（图9C~E）。Western blotting分析发现，NC-AA1+ICA组cleaved caspase-3较NC-AA1组减少，但敲低Ppara后，siRNA3-AA1+ICA组cleaved caspase-3表达与siRNA3-AA1组无明显变化，且高于NC-AA1+ICA组（图9F）。以上结果提示，敲低肾小管上皮细胞Ppara后，淫羊藿苷对抗马兜铃酸的预防保护作用减弱。

近10年来，肾脏病研究领域越来越重视AKI与CKD及ESRD发展的密切关系^［14］。全世界每年有1 350万例AKI患者，其中每年约有170万人死亡^［15］。HORNE等^［16］开展了3年的随访观察研究，发现24.6%的AKI患者进展为CKD。因此，研发能预防和缓解AKI向CKD转化的药物具有十分重要的临床意义与社会价值。

线粒体功能障碍是引起AKI向CKD转化的重要机制之一^［17］。脂肪酸β氧化代谢通路是肾小管线粒体代谢的主要途径。研究^［18］发现肾小管上皮细胞脂肪酸氧化缺陷在肾间质纤维化的发生发展中发挥关键作用。因此针对保护线粒体功能，调节脂肪酸氧化代谢的药物可能在阻止AKI向CKD转化中发挥作用。

淫羊藿苷是中药淫羊藿的主要活性成分^［19］。近来多项研究表明淫羊藿苷可能通过线粒体发挥其保护作用。淫羊藿苷可缓解缺血再灌注引起的线粒体氧化应激损伤^［20］，并能调节线粒体跨膜电位，上调细胞质中细胞色素C含量^［21］。淫羊藿苷可通过保护线粒体抑制心肌细胞及肾脏足细胞凋亡^［22-23］。本次研究发现，在马兜铃酸诱导的经典AKI-CKD模型中，预防性给予淫羊藿苷对肾小管上皮细胞线粒体结构具有保护作用，并可上调脂肪酸氧化代谢通路表达，减少马兜铃酸引起的肾小管上皮细胞凋亡蛋白cleaved caspase-3的表达，从而改善急性期和重塑期的小鼠肾功能和肾脏病理损伤，减少巨噬细胞浸润及肾间质纤维化的发展。

PPARα是调控细胞内脂质代谢的关键转录因子，参与过氧化物酶体和线粒体中脂肪酸氧化代谢、脂肪酸摄取和胆固醇分解代谢^［24］。PPARα信号和脂肪酸氧化代谢通路障碍会加重肾纤维化^［25］。研究^{［19，26］}发现，淫羊藿苷不仅能上调PPARα信号通路，还可激活PPARα，从而调控肝脏脂质代谢基因的表达。本次研究也通过体内和体外实验观察到淫羊藿苷可上调大鼠肾小管上皮细胞Ppara表达，而敲低Ppara表达，淫羊藿苷的预防保护作用减弱，推测淫羊藿苷可能通过PPARα发挥对马兜铃酸诱导的AKI-CKD模型的保护作用。

而且此次研究发现淫羊藿苷预防性给药可以通过减轻AKI肾脏损伤，延缓或抑制AKI向CKD的转化；而在急性期结束后给药，淫羊藿苷对肾脏无明显保护作用。提示淫羊藿苷可能主要发挥预防性保护作用。

总之，此次研究初步揭示预防性给予淫羊藿苷可能通过改善线粒体脂肪酸氧化代谢通路，尤其可能通过PPARα，抑制肾小管上皮细胞凋亡，减少促炎因子和促纤维化因子的分泌，减少巨噬细胞浸润，并抑制肌成纤维细胞活化，减轻AKI肾脏损伤，抑制肾间质纤维化发生，从而发挥预防AKI向CKD转化的保护作用。