虽然大脑只占体质量总量的2%，但其能量需要占总能量的20%。中枢神经系统（central nervous system，CNS）通过响应外周循环信号的变化调节能量代谢^［1］。神经胶质细胞占CNS总质量的50%以上，并参与体质量稳态和肥胖的调节^［2-3］。据报道^［4］，饮食诱导的肥胖会引起小胶质细胞激活，并且高脂饮食（high-fat diet，HFD）会导致下丘脑炎症。小胶质细胞是中枢神经系统中高度运动的免疫细胞，可持续监测大脑环境，然而支持小胶质细胞监测功能的营养代谢物质仍然未知。

作为一种非选择性阳离子通道，瞬时受体电位香草素1型（transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1）通道为感觉系统中疼痛和炎症的关键组成部分，可被辣椒素、毒液毒素以及树脂毒素激活^［5-6］。温度高于43 ℃、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、脂氧合酶产物、N-花生四烯酰多巴胺，以及单酰基甘油都可以内源性激活TRPV1通道。

TRPV1通道存在于大脑的各个组分，包括神经元和神经胶质细胞。据报道，TRPV1通道通过突触前的激活机制调节突触传递^［7-9］。神经行为研究表明，TRPV1通道与精神和神经系统疾病有关，包括癫痫、抑郁以及焦虑^［10］。此外，TRPV1通道在小胶质细胞（驻留在大脑中的免疫细胞）中发挥多种功能，如小胶质细胞死亡^［11］、吞噬作用^［12］、迁移^［13］、细胞因子产生^［14］以及活性氧的产生^［15］。此外，激活TRPV1通道可调控皮质小胶质细胞的活化，并通过增加小胶质细胞的囊泡脱落间接增强神经元谷氨酸传递。大脑中TRPV1通道是小胶质细胞和神经元之间通信的关键，可以检测潜在的有害刺激^［6］。

据报道^［16］，辣椒素可以通过诱导TRPV1通道激活增加Ca²⁺内流诱导的自噬形成，从而减少ApoE^-/-小鼠的脂质储存以及动脉粥样硬化病变。此外，据报道^［17］，辣椒素作为TRPV1通道激动剂，诱导细胞内Ca²⁺浓度升高促进沉默调节蛋白1（sirtuin1）活性从而触发白色脂肪组织的褐变，并通过增加过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ）共激活剂的表达来增强代谢活性。然而，TRPV1是否在HFD诱导的小胶质细胞活化和相关过程中发挥作用仍不确定。

Trpv1^-/-（KO）小鼠由重庆医科大学附属第一医院黄玮博士惠赠。8周龄的雄性和雌性C57BL/6J小鼠（SLAC实验室，上海）饲养在温度受控的环境中，保持12 h光照/黑暗循环。野生型（WT）和KO小鼠均提供标准食物（specific carbohydrate diet，SCD）或高脂肪食物（high-fat diet，HFD）（45%脂肪；Research diet，Rodent Chow #D12451），除非另有说明。在SCD或HFD期间的不同时间点收集小鼠脑组织。

mRNA的亲和纯化、扩增以及测序库的构建参照继往文献^［18］。样品在平台上测序，得到图像文件，并生成FASTQ格式的原始数据。在数据匹配分析中，参考基因组和基因注释文件，从基因组网站下载。参考基因组索引由Bowtie2（2.2.6）建立，过滤后的读数用TopHat2（2.0.14）映射到参考基因组上，默认错配为≤2，计算映射读数的排列区域分布。对于mRNA的分析，使用HTSEq.（0.9.1）统计，将每个基因上的阅读数值作为该基因的原始表达量进行比较；使用FPKM进行标准化表达。用DESEq.（1.30.0）分析与筛选条件有差异表达的基因：表达差异倍数|log2 fold change|>1，显著P值<0.05。使用R语言Pheatmap（1.0.8）软件包对样本的所有不同基因进行双向聚类分析。根据同一基因在不同样品中的表达水平和同一样品中不同基因的表达模式，用欧氏方法计算距离，用完全联系法进行聚类，得到热图。将所有基因映射到基因本体（Gene Ontology）数据库中的术语，并计算每个术语中差异富集的基因数量。在全基因组的基础上，通过超几何分布计算出差异富集基因的显著富集的术语。

利用Q Exactive™混合四极杆-轨道阱™质谱仪进行液相色谱-质谱分析，该质谱仪配有Ion Max™源和加热电喷雾电离［heated electrospray ionization （HESI-II）probe］探针，与Dionex UltiMate™ 3000超高效液相色谱系统（Thermo Fisher Scientific，美国）联用。在分析之前，将样品重悬于100 µL水中，每个样品1 µL注入SeQuant^® ZIC^®-pHILIC 2.1 mm×150 mm（5 µm粒径）柱（EMD Millipore，美国）。缓冲液A由20 mmol/L碳酸铵和0.1%氢氧化铵组成，缓冲液B为乙腈。色谱梯度以0.15 mL/min的流速运行，具体如下：0~20 min从80%到20%B的线性梯度；20~21 min，从20%到80%B的线性梯度；21~28 min，保持在80%B。质谱仪在全扫描、极性切换模式下运行，喷雾电压设置为3.0 kV，加热毛细管保持在275 ℃，HESI-II探针保持在350 ℃。MS数据采集在70~1 000 m/z范围内进行，分辨率设置为70 000，自动增益控制目标为106，进样的最大时间为80 ms。使用Xcalibur™ QuanBrowser 2.2软件（Thermo Fisher Scientific，美国）进行相对定量，质量公差为5 ppm（1 ppm=1×10^-6），并参考内部化学标准库。

为了确定与Trpv1基因敲除相关的基因组，进行了加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）^［19］。应用WGCNA包建立共表达网络^［20］。根据功率和尺度独立性之间的关系，选择1个模块来建立所有数据集的无尺度拓扑结构。计算给定模块的模块内连通性得分以及连通性轨迹的平均值。通过Metascape（https：//metascape.org）^［21］将给定模块中的基因富集到GO以及京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）的路径中，并使用Cytoscape V3.8.0^［22］对所选网络进行可视化。

用10 μmol/L辣椒素或1 μmol/L capsazepin预处理小胶质细胞30 min，然后用250 μmol/L棕榈酸（Cat. SYSJ-KJ002，鲲创科技）处理8 h。用10 µg/mL 5, 5′, 6, 6′-四氯-1, 1′, 3, 3′-四乙基苯并咪唑-羰化碘（JC-1，碧云天）在37 ℃下监测小胶质细胞的线粒体膜电位30 min。用TCS SP8激光共聚焦扫描显微镜（Leica，德国）观察和捕捉荧光。

麻醉小鼠，从大脑中解剖出皮质，并在hank平衡盐溶液缓冲液中手动分离。用1 mg/mL的木瓜蛋白酶制备单细胞悬液。对于小胶质细胞的分离，用生物素结合的抗CD11b抗体（Cat#13-0112-82，Invitrogen）孵化细胞，然后用Dynabeads生物素黏合剂（Cat#11047，Invitrogen）分离CD11b⁺细胞。用TRIzol（Cat#R0016，Beyotime）提取总RNA。用BioDrop 评估总RNA后，用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Cat#6210A，Takara）合成 cDNA，引物序列见表1。应用LightCycler 480II （Roche）以及BeyoFastTM SYBR Green qPCR Mix （2×，High Rox）（Cat#D7265， Beyotime）在20 μL的反应中进行30 ng稀释cDNA的实时PCR。循环参数：95 ℃保持步骤，2 min；然后60个循环，95 ℃ 15 s，60 ℃ 20s，72 ℃ 30s；55 ℃ 30s，进行熔解分析，温度从60 ℃升至95 ℃。使用2^-ΔΔCp方法将基因表达量与GAPDH归一化。

小鼠麻醉后用0.9%的氯化钠灌注。左脑半球在4%多聚甲醛（paraformaldehyde fix solution，PFA）中固定过夜，在冷冻前分别用20%以及30%的蔗糖梯度脱水过夜。从海马的喙部前部到尾部收集左脑的20 μm冠状切片。用含10%山羊血清的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液将冷冻的组织切片封闭1 h，然后在4 ℃下用兔抗Iba1（1∶200；Wako Pure Chemical Industries，Ltd，日本）、兔抗GFAP（1∶1 000，Glostrup，丹麦）、兔抗NeuN（1∶100，Merck Millipore，美国）或小鼠抗TRPV1（1∶200，Neuromab，美国）孵育过夜。然后用0.01 mol/L PBS清洗脑片，并与相应的Alexa Flour^® 488或555结合的二抗（1∶500，Invitrogen，美国）孵化2 h。使用TCS SP8共焦激光扫描显微镜获取荧光图像。对所有样品进行预扫描，确保共聚焦设置低于饱和度。将右脑半球的皮质和海马分离出来，并在液氮中闪冻，方便后续进行其他生化分析。

Iba-1和GFAP阳性细胞的激活程度以相对荧光面积计算，与WT SCD组进行归一化，而NeuN阳性细胞则以相对荧光密度计算，与WT SCD组进行归一化^［23-25］。

用Prism软件进行统计分析。符合正态分布的连续数据以ⅹ±s表示，用Kolmogorov-Smirnov正态性检验数据的高斯分布，然后用单因素方差分析和Dunnett的事后检验进行分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

进行RNA测序（RNA-seq），以确定HFD或SCD喂养的WT和KO小鼠大脑的表型。使用加权基因共表达网络分析来识别HFD或SCD对Trpv1敲除小鼠的分子网络的影响（图1A）。在KO-HFD组中，有3个模块被确定为调控异常，其中包括2个下调模块（粉色和蓝色）和1个上调模块（黑色）（图1A）。富集分析显示：粉红色模块基因中的胆固醇生物合成、细胞蛋白质分解代谢过程、线粒体功能、自噬和内吞作用（图1B~D），黑色模块基因中的内质网中的蛋白质加工、蛋白激酶活性以及内在凋亡信号通路受损 （图1E~G）。此外，与KO组相比，KO-HFD组神经元和突触组织等突触相关通路的功能下调（图1H~J）。上述结果表明，HFD饮食下Trpv1的基因缺失导致脂质代谢、线粒体功能、内吞作用以及神经元和突触功能的失调。

为了深入了解Trpv1基因敲除对小鼠大脑表型的影响，使用液相色谱-高分辨质谱检测HFD或SCD喂养的WT和KO小鼠的脑脂质组^［26］。分析结果显示，脑脂质组主要由磷脂酰胆碱（phosphatidyl-choline，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）以及心磷脂组成。与WT组相比，WT-HFD组的PC水平下降，而PS和PG水平上升；同时，KO和KO-HFD小鼠的PC、PS以及PG水平没有明显变化（图2A）。此外，与KO小鼠相比，KO-HFD小鼠的三酰甘油（triacylglycerol，TAG）的水平明显增加（图2A）。聚合分级聚类分析显示，WT-HFD和KO-HFD小鼠的脑脂质组有显著差异（图2B）。WT-HFD小鼠的TAG亚族有明显变化，峰值为42∶4和44∶3（图2C），表明内质网和线粒体的TAG生物合成被激活^［27］。与WT小鼠相比，WT-HFD小鼠的PC、PE和PG的酰基链长度明显拉长，而KO-HFD组与KO组相比，PC和PE的酰基链长度没有明显变化（图2D~G）。磷脂的酰基链来自于脂肪酸链的延长，通过脑细胞的活性生物合成，由乙酰辅酶催化，通过单磷酸腺苷激活的蛋白激酶途径调节^［28-29］。脑脂质组分析显示，在WT-HFD小鼠中，酰基链长度的延长和甘油磷脂的代谢都增加。

结合转录组、脂质组进行综合分析，发现WT-HFD小鼠的甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）生物合成和花生四烯酸代谢发生了明显的变化，KO-HFD小鼠的甘油磷脂代谢和GPI生物合成也发生了相应变化（图3A）。

火山图显示：与WT小鼠相比，KO小鼠的大脑中有38个基因下调，11个基因上调了4倍或更多（图3B）。在差异表达的基因中，13个GO和KEGG途径被富集（图3B）。此外，与WT-HFD小鼠相比，KO-HFD小鼠的大脑中有17个基因下调，63个基因上调4倍或更多（图3C），共有13个GO和KEGG途径被富集（图3C）。

富集在KEGG途径中的基因的平均倍数变化见图3D~I，其中包括甘油磷脂代谢（图3D）、花生四烯酸代谢（图3E）、抗原处理和表达（图3F）、GPI生物合成（图3G）、亚油酸代谢（图3H）和α-亚油酸代谢（图3I）。与WT-HFD小鼠相比，与甘油磷脂代谢有关的基因（Pla2g10，Pla2g4b，Pla2g2f，Pla2g4c，Pla2g2d，Pla2g2c，Dgkg，Dgkk，Lpin3，Plpp4和Ptdss2）在KO-HFD小鼠中普遍下调（图3D）。此外，与WT-HFD小鼠相比，与花生四烯酸、PG和白三烯的生物合成有关的基因（Pla2g10、Pla2g4b、Pla2g3、Pla2g2d、Pla2g4c、Pla2g2c、Ptgs2和Alox5）在KO-HFD小鼠中与WT-HFD小鼠相比有所下降（图3E）。与WT-HFD小鼠相比，与抗原处理和呈递有关的基因（Hspa1b、Hspa1a、Hspa2、Hspa5、Psme1、Calr、Zap70、Ptgs2、H2-Q1、H2-Q2、H2-Aa、H2-Ab1、Hspa1b和CD74）表达降低（图3F）。同时，在KO-HFD小鼠中，GPI生物合成（图3G），以及亚油酸和α-亚麻酸的代谢（图3H、I）减弱，这表明与WT-HFD小鼠相比，KO-HFD小鼠脂质代谢下调。

细胞内ATP的短缺会通过增强细胞的糖原生成和乳酸穿梭进行弥补，而不是促进葡萄糖运输、糖酵解、三羧酸（tricarboxylic acid，TCAC）循环和氧化磷酸化（图4A）。RNA-seq分析显示，Slc16a7（图4B）和Fbp1（图4C）与KO-HFD小鼠的糖原生成和乳酸穿梭的增加有关，然而与WT-HFD组相比，促进葡萄糖转运器I类成员表达有关的基因，如Slc2a2（图4D）、Hk2（图4E），以及与TCA循环和氧化磷酸化（图4F、G）表达有关的基因，在KO-HFD组中下调。这些结果表明，Trpv1基因敲除会导致葡萄糖代谢失调。

RNA-seq分析的结果显示：Trpv1基因敲除削弱了葡萄糖的转移和糖酵解，并在转录水平上下调了HFD引起的脂质代谢。

为了研究TRPV1在HFD诱导的胶质细胞激活中的作用，我们比较了WT和KO小鼠脑组织中活性的小胶质细胞和星形胶质细胞的比例（图5）。结果显示，在SCD组中，WT和KO小鼠的大脑皮质和海马组织中的Iba-1⁺小胶质细胞和GFAP⁺星形胶质细胞的免疫反应性没有差异（图5A、B）。在HFD喂养3 d后，WT小鼠的Iba-1⁺小胶质细胞和GFAP⁺星形胶质细胞的免疫反应性比SCD明显上升（图5A、B）。与WT-HFD组相比，KO-HFD组大脑皮层和海马组织中Iba-1⁺活性小胶质细胞的比例下降了约50%（图5A），而GFAP⁺星形胶质细胞没有明显差异（图5B）。

脂质组和转录组的分析表明，TRPV1通道参与了HFD引起的脂质代谢和神经炎症。因此，为了确定哪些细胞类型有助于TRPV1表达的增加，我们进行了进一步的分析。在喂食HFD 3 d的小鼠脑部切片上进行TRPV1与不同细胞特异性标记物的联合免疫染色。在SCD小鼠中，TRPV1仅在Iba1⁺小胶质细胞中轻微表达（图6A），但在一些活跃的Iba1⁺小胶质细胞中强烈表达（图6A）。除了在活跃的小胶质细胞中检测到的强表达外，TRPV1还在喂养SCD或HFD 3 d的小鼠的一些GFAP⁺星形胶质细胞中表达（图6B）。在喂食SCD或HFD的小鼠脑片中，TRPV1和NeuN⁺神经元的共定位是罕见的（图6C）。

从WT和KO小鼠的脑组织中分离出小胶质细胞。与KO-HFD小鼠相比，7d HFD WT小鼠的小胶质细胞中的Trpv1 mRNA的表达量明显增加（图7A）。在HFD 喂养3d或7d的小鼠中，线粒体功能中起关键作用的解偶联蛋白2（Ucp2）的mRNA表达明显增加，并在HFD喂养8周内恢复到喂养SCD小鼠的水平，而KO小鼠在喂养或不喂养HFD时没有变化（图7B）。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，Tnf-α）和白细胞介素-1β（interleukin-1β，Il-1β）的mRNA水平在HFD喂养7d的小鼠中也显著增加，然后在HFD喂养8周的WT小鼠中又恢复到正常水平（图7C、D）。然而，在HFD喂养或不喂养的KO小鼠中，Tnf-α和Il-1β的 mRNA水平没有明显变化（图7C、D）。这些数据表明Trpv1敲除减弱了HFD诱导的小胶质细胞激活。

在250 μmol/L棕榈酸刺激小胶质细胞8 h后，使用阳离子羰花青染料JC-1作为线粒体功能的指标评估线粒体的膜电位。TRPV1激动剂辣椒素减弱了棕榈酸诱导的线粒体膜电位的去极化，但TRPV1拮抗剂辣椒西平没有作用（图7E、F）。

为了揭示参与甘油磷脂代谢的信号通路，进行了脂质组和转录组的联合分析。图7G展示了参与甘油磷脂代谢途径的相关基因。甘油磷脂代谢途径中相关基因的表达改变可能是引起甘油磷脂含量升高的原因。在HFD喂养的WT小鼠中，脂质代谢加速，其中包括PS和PG的增加，以及Alox5的表达上调，而TRPV1的缺失减弱了这一过程。在WT小鼠中，PS在内质网的线粒体相关膜中合成，然后转运到线粒体，在线粒体内膜上脱羧为PE，由PS脱羧酶催化，该酶由Pisd编码。Pisd在WT-HFD小鼠中下调，但在KO-HFD小鼠中上调（图7G）^［30］。与WT小鼠相比，WT-HFD小鼠的PS增加，而KO-HFD和KO小鼠之间没有差异。PS的上调与MAM激活有关。研究^［31-32］证明，MAM的激活和Pisd的下调与线粒体的激活相关。Alox5的上调会导致白三烯的产生，白三烯已被发现参与周围神经炎症（图7G）^［33］。

WGCNA显示，Trpv1敲除与HFD喂养的小鼠大脑中脂质代谢、线粒体功能、内吞作用以及神经元和突触功能失调有关。脂质组学分析显示，HFD喂养的Trpv1基因敲除小鼠大脑中脂质堆积。在转录水平上，HFD喂养的Trpv1敲除小鼠与葡萄糖转移和糖酵解的减少、脂质代谢的下调和小胶质细胞激活的减弱相关。相反，TRPV1激动剂辣椒素减弱了棕榈酸刺激的线粒体膜电位去极化。

辣椒素诱导的TRPV1激活增加了ATP结合盒转运蛋白A1（ABCA1）的表达，同时通过Ca²⁺、钙神经蛋白和蛋白激酶A依赖的机制减少了HFD喂养的ApoE^-/-小鼠血管平滑肌细胞中脂质的表达^［34］。TRPV1的激活增加了UCP2的表达，降低了WT小鼠的血清三酰甘油和肝脏脂肪水平，而KO小鼠则没有^［35］。在巨噬细胞衍生的泡沫细胞中，TRPV1激动剂通过肝脏X受体α依赖性转录上调ABCA1和ABCG1水平，促进胆固醇外流，从而减弱动脉粥样硬化的发展^［36］。在本研究中，脑脂质组分析显示，WT小鼠的脂质代谢加速，而KO小鼠喂食HFD则没有（图2）。

TRPV1激活可以增加葡萄糖转运体4的表达水平和葡萄糖的摄取，从而降低血糖水平^［37］。此外，TRPV1还能调节饮食引起的肥胖、胰岛炎症、胰岛素抵抗和瘦素抵抗，从而在葡萄糖代谢中发挥重要作用^［38-39］。

作为脑部免疫细胞，小胶质细胞可以被激活并进行表型转换，包括释放炎症因子和在同质化破坏过程中的形态变化^［40］。小胶质细胞的激活参与了许多生理和病理功能，包括吞噬和细胞因子的释放^［41］。本研究中，HFD喂养7 d诱导皮质小胶质细胞的表型转换，其特点是产生促炎症细胞因子（图7）。TRPV1通道已被广泛认为是感觉系统中疼痛和炎症的一个关键组成部分。HFD诱导的下丘脑神经炎症与下丘脑的小胶质细胞激活相吻合，其特点是炎症信号和小胶质细胞的形状变化。这些事件发生在体质量变化之前，表明小胶质细胞的激活可能是代谢变化的上游事件。

根据RNA-seq数据，HFD会导致WT小鼠的急性神经炎症，而Trpv1的敲除会导致炎症减轻。此外，HFD可导致中枢神经系统中与抗原处理和表达有关的基因下调（图3F），正如最近在外周组织中的报道^［42-44］。除此之外，Trpv1敲除缓解HFD诱导的中枢神经系统的糖代谢和脂质代谢过程，其中脂质代谢过程的改变也在脂质组水平上观察到（图2）。

用辣椒素干预的小胶质细胞导致裂解的caspase-3表达增强，线粒体释放的细胞色素c增加。在体内，在黑质内注射辣椒素通过TRPV1产生小胶质损伤^［11］。线粒体TRPV1调控小胶质细胞迁移。TRPV1的激活引发线粒体内Ca²⁺和线粒体去极化的增加，从而导致小胶质细胞的趋化活性和线粒体产生的活性氧增强^［13］。据报道，TRPV1刺激控制小胶质细胞的激活，并通过增加小胶质细胞的细胞外脱落小泡，间接增强神经元的谷氨酸传递^［6］。

研究^［4］发现，高脂血症可导致中枢神经系统的小胶质细胞激活。而YOSHIDA等^［45］发现TRPV1在促炎症信号通路中起着关键作用，因为TRPV1缺失的小鼠对高脂血症刺激的促炎症反应减弱了。这些发现表明，TRPV1在几种神经免疫性疾病的小胶质细胞和星形胶质细胞的激活中起着重要作用^{［14，46-49］}。作为对TRPV1信号转导缺陷的回应，大脑中的细胞保持耐受状态，对病原体的免疫反应下降。因此，Trpv1的敲除可能减弱HFD诱导的神经炎症，特别是在小胶质细胞中，正如本研究所证实的Trpv1在转录水平上对神经炎症的影响。