肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率及病死率逐年攀升^［1］。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌总量的80%~85%，主要包括肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）及肺鳞状细胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）。尽管靶向治疗、分子免疫治疗等新兴治疗手段被不断应用，但是NSCLC的高侵袭性和易转移性使得患者的5年生存率仍然不足20%^［2］。寻找与侵袭转移相关的分子靶点，对于改善NSCLC的治疗现状至关重要^［3］。

随着细胞测序技术的快速发展和广泛应用，大量的公共生物数据库相继建立，为系统地发现新的分子靶点提供了方便^［4］。本研究采用GEO数据库对NSCLC组织数据集GSE33532进行差异表达基因分析，结合GEPIA、UALCAN、KM Plotter等在线分析网站，筛选出与NSCLC患者生存、预后及淋巴结转移密切相关的候选基因G蛋白偶联受体87（G protein-coupled receptor 87，GPR87）。

GPR87属于细胞膜表面的G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR）家族，在多种恶性肿瘤中均有高表达，对细胞存活起关键作用^［5］。GPR87的高表达与NSCLC细胞增殖密切相关^［6］。组蛋白H3F3A可通过结合GPR87的启动子促进GPR87的表达，进而促进NSCLC的侵袭转移^［7］。研究^［5］发现，NSCLC中GPR87的表达与免疫浸润呈正相关，并能促进肿瘤的侵袭。肿瘤侵袭受多种细胞因子和信号通路的调控^［8］，GPR87与NSCLC侵袭具体的机制尚有待探究。

本研究拟探究GPR87的表达与SK-MES-1和A549细胞的侵袭和转移、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表达、上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和RHO/ROCK信号通路的关系，阐明GPR87在NSCLC侵袭中的作用机制，为抑制NSCLC的侵袭转移治疗提供新的靶点。

选择GEO数据库的数据集GSE33532筛选与NSCLC侵袭及转移相关的差异表达基因，使用KM plotter网站进行差异基因与患者的生存分析、GEPIA数据库分析候选基因在NSCLC中的表达、UALCANA网站分析候选基因与NSCLC的临床相关性。通过CCLE网站对已知的NSCLC细胞系的候选基因表达进行预测。

收集2018年1月—2020年8月湖北省宜昌市中心人民医院病理科的NSCLC临床样本80例及对应的临床病理资料。对80例肿瘤石蜡样本及癌旁正常组织使用GPR87抗体（1∶500；Abcam，美国）进行免疫组化分析，采用二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木精复染。评分标准由阳性染色的肿瘤细胞数量和染色强度决定。阳性细胞染色比例：≤5%为0分，6%~25%为1分，26%~50%为2分，51%~75%为3分，76%~100%为4分。染色强度：0分为无着色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为黄褐色。两者乘积等于0为阴性，1~4分为弱阳性，5~8分为中等阳性，9~12分为强阳性。结合免疫组化的结果及患者的临床病理资料（病理分型、年龄、性别、吸烟情况、分化程度、临床分期、淋巴结转移情况），分析GPR87与NSCLC的临床相关性。

人腺癌细胞系A549和人鳞癌细胞系SK-MES-1购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。A549用高糖DMEM（Gibco，美国）培养，SK-MES-1用MEM（Gibco，美国）培养，培养基中添加10%胎牛血清（Hyclone，美国）、100 U/mL青霉素/链霉素（Gibco，美国）和2 mmol/L的L-谷氨酰胺（索莱宝，北京），培养箱条件设置为37 ℃、5% CO₂。

当细胞汇合到80%后，按每孔2×10⁵个细胞接种到6孔板中，用siRNA或质粒处理。siRNA序列如表1所示。质粒pCMV-Vector-his和pCMV-GPR87-his（义翘神州，北京）。按照转染试剂（Thermo Fisher，美国）的操作说明进行转染。细胞转染4~6 h，用完全培养基培养适当时间后进行后续检测。

为评估细胞的迁移活性，经siRNA或质粒处理的细胞培养24 h后，用不含血清的培养基按每孔4×10⁵个细胞接种到Transwell小室中，小室的孔径为8 μm，下室添加完全培养基。孵育24 h后，取出小室，清除未穿孔的细胞，用多聚甲醛固定、结晶紫溶液染色，拍照，用Image J软件扫描紫色面积，重复3次，统计结果。

为评估细胞的侵袭活性，将经siRNA或质粒处理的细胞培养24 h，用不含血清的培养基按8×10⁵个/孔细胞接种到Transwell小室中，小室提前24 h铺好Matrigel基质胶（BD Biosciences，美国），小室的孔径为8 μm，下室添加完全培养基。孵育24 h后，取出小室，清除未穿孔的细胞，用多聚甲醛固定、结晶紫溶液染色，拍照，用Image J软件扫描紫色面积，重复3次，统计结果。

经siRNA或质粒处理的细胞继续培养48 h，取1 mL培养上清液，使用ELISA试剂盒（博士德，武汉）检测细胞MMP7的分泌量。重复实验3次后进行数据分析。

经siRNA或质粒处理的细胞继续培养48 h，收集细胞，用Trizol（Takara，日本）提取RNA。取2 μg RNA按照反转录试剂盒（诺唯赞，南京）的操作说明反转录为40 μL cDNA，再以cDNA为模板使用SYBR qPCR Master Mix（诺唯赞，南京）进行qPCR。GPR87、MMP2、MMP7、MMP9、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、snail、twist、RHOA、RHOC、ROCK1、β-actin的引物序列（生工，上海）如表2所示。以β-actin为内参基因，用2^‑ΔΔCt法计算目的基因的mRNA表达量。

经siRNA或质粒处理的细胞培养48 h，收集细胞，用含有PMSF（博士德，武汉）的RIPA（博士德，武汉）提取总蛋白，使用BCA试剂盒（Thermo Fisher，美国）进行蛋白质定量。使用SDS-PAGE分离蛋白，接着把蛋白转移至PVDF膜（GE Amersham，美国）。用5%的脱脂牛奶（碧云天，上海）封闭PVDF膜，在4 ℃孵育一抗过夜：MMP9抗体（1∶1 000；三鹰，武汉）、vimentin抗体（1∶1 000；三鹰，武汉）、RHOA抗体（1∶1 000；三鹰，武汉）、ROCK1抗体（1∶1 000；三鹰，武汉）、β-actin抗体（1∶1 000；三鹰，武汉）、GPR87抗体（1∶1 000；Abcam，美国）、E-cadherin抗体（1∶500，Abcam，美国）。室温孵育二抗（1∶3 000；三鹰，武汉）1 h，用ECL试剂盒（Thermo Fisher，美国）进行蛋白检测，利用Image J软件对结果进行灰度扫描。

实验数据均采用SPSS 22.0统计学软件进行分析处理，每组数据均进行3次独立重复试验，用x±s表示；2组样本比较采用t检验。P<0.05表示结果具有统计学意义。

利用GEO自带的分析软件GEO2R对数据集GSE33532进行分析。该数据集包含了20个按淋巴转移和无淋巴转移分组的NSCLC样本，以高侵袭性和低侵袭性分组，设定阈值为P_adj<0.05，|logFC|>2，得到10个差异表达基因（表3）。利用KM plotter对上述10个基因进行生存分析，结果显示，10个差异基因中有2个与患者的生存率相关，即219936_s_at（GPR87）和205048_s_at（PSPH）（图1A、B）。其中GPR87的HR>1，说明GPR87的高表达与预后不良相关。生信分析结果表明GPR87是与NSCLC高侵袭性相关的候选基因。

利用UALCAN网站分析GPR87基因的表达与NSCLC的临床相关性。在GEPIA数据库中包含的483例LUAD和486例LUSC样本，均显示GPR87的mRNA相对于正常样本过表达（图1C）。在UALCAN中对GPR87和NSCLC之间的临床特征进行分析，结果显示GPR87的高表达与LUAD患者的临床分期、年龄、种族以及TP53突变状态有关，与LUSC患者的淋巴结转移状态也有关（图1D~H）。

对80例NSCLC肿瘤及其相邻正常组织进行免疫组化分析，以确定GPR87的蛋白表达。结果如图2和表4所示，肿瘤的GPR87阳性率为63.8%，相邻正常组织中均为阴性。结果表明，GPR87在NSCLC肿瘤组织中的表达高于相邻正常组织（P<0.001）。

为了进一步揭示GPR87与NSCLC患者临床病理特征之间的关系，我们分析了上述80例临床样本的临床病理数据（病理类型、年龄、性别、吸烟状况、分化程度、临床分期、淋巴结转移情况），如表5所示。GPR87的表达在不同临床分期（P=0.001）和淋巴结转移状态（P=0.019）之间差异有统计学意义，但在不同病理类型、年龄、性别、吸烟状况以及分化程度之间差异无统计学意义。结果表明，与低表达GPR87的患者相比，高表达GPR87的NSCLC患者临床分期更晚、更易发生淋巴结转移。

为了选择合适的细胞模型，利用CCLE网站预测GPR87在NSCLC细胞系中的表达量，发现SK-MES-1的GPR87表达量最高，A549次之（图3A）。通过RT-qPCR和Western blotting进行验证，得到了相同的结果（图3B、C）。

用不同剂量（100、200 pmol/L）的siRNA-GPR87-1和siRNA-GPR87-2转染SK-MES-1，培养48 h后检测GPR87 mRNA和蛋白的表达水平，发现100 pmol/L siRNA-GPR87-2处理组的敲低效果最好（图3D、E），故选择该处理建立敲减模型。

将pCMV-GPR87-his以不同剂量（1 μg/mL、2 μg/mL）转染A549 48 h，检测GPR87的表达水平，结果显示，1 μg/mL处理组GPR87过表达效果优于2 μg/mL处理组（图3F），故选择1 μg/mL pCMV-GPR87-his处理细胞建立过表达模型。

用siRNA-GPR87分别转染SK-MES-1和A549，结果显示，处理组的迁移（图4A）和侵袭（图4B）细胞数量均低于对照组。用pCMV-GPR87-his分别转染SK-MES-1和A549，结果显示处理组的迁移（图4C）和侵袭（图4D）细胞数量高于正常对照组。这些结果表明GPR87可能促进NSCLC细胞株的迁移和侵袭。

用siRNA-GPR87分别转染SK-MES-1和A549细胞，结果显示SK-MES-1处理组细胞培养上清液中MMP2、MMP7和MMP9 mRNA表达量显著降低（图5A）， SK-MES-1和A549处理组细胞培养上清液中MMP7的分泌量和活化MMP9蛋白的表达量均降低（图5B~D）。用pCMV-GPR87-his分别转染SK-MES-1和A549细胞，结果显示，A549处理组中MMP7和MMP9的mRNA表达上调（图5E），SK-MES-1和A549处理组细胞培养MMP7的分泌量和active-MMP9蛋白的表达量均上调（图5F~H）。提示GPR87可能上调MMPs的表达水平。

用siRNA-GPR87转染细胞SK-MES-1，结果显示处理组细胞上皮细胞标志物E-cadherin、间质细胞标志物N-cadherin、vimentin、snail、twist的mRNA水平和E-cadherin、vimentin的蛋白水平均无变化（图6A、B）。用pCMV-GPR87-his转染细胞A549，结果显示处理组细胞E-cadherin、N-cadherin、vimentin的mRNA水平和E-cadherin、vimentin的蛋白水平均无变化（图6C、D）。这些结果表明GPR87对NSCLC细胞的EMT没有影响。

用siRNA-GPR87转染SK-MES-1和A549细胞，结果显示处理组SK-MES-1的RHOA、RHOC和ROCK1 mRNA表达水平下调（图7A），SK-MES-1和A549的RHOA和ROCK1蛋白表达水平降低（图7B）。用pCMV-GPR87-his转染SK-MES-1和A549，结果显示处理组A549中RHOA、RHOC和ROCK1 mRNA表达水平上调（图7C），SK-MES-1和A549中RHOA和ROCK1蛋白表达水平升高（图7D）。提示GPR87可能激活NSCLC细胞株的RHO/ROCK信号通路。

侵袭和转移是NSCLC重要的生物学特征，也是决定肿瘤预后不良的首要因素^［1］。虽然新一代靶向抗癌药物层出不穷，但这些药物主要是抑制肿瘤生长和促进细胞凋亡，对肿瘤转移的治疗极为有限^［8］。筛选与转移相关的关键分子靶点，是改善NSCLC患者不良预后的重要方向。

结合生物信息学分析方法和80例临床NSCLC患者的检测数据，显示GPR87在NSCLC中高表达，且会导致患者临床分期差、更易发生淋巴结转移，提示GPR87可能是NSCLC高侵袭性的关键基因。GPR87属于GPCR家族，该家族是最大的细胞表面分子家族，参与肿瘤生长、血管生成和转移的调控^［9-10］。在本研究中，我们发现GPR87可促进NSCLC的侵袭，这与其他GPCR家族成员的作用一致。GPR87下游参与多种信号通路，本研究通过在线网站分析相关通路，选取了MMPs、EMT以及RHO/ROCK信号通路，探讨GPR87介导的NSCLC侵袭转移机制。

MMPs是一类蛋白水解酶，在肿瘤侵袭转移过程中发挥重要作用^［11］。MMP2和MMP9是降解细胞外基质中的层粘连蛋白的明胶酶之一。MMP7也被称为基质溶解素，主要降解细胞外基质和基底膜蛋白。文献^［12］报道，在NSCLC中MMP2、MMP7和MMP9的高表达可促进转移，提示患者预后不良。本文研究了GPR87与A549和SK-MES-1中MMPs表达的关系，结果显示，敲低GPR87表达可下调细胞内MMP2、MMP7和MMP9的mRNA和MMP7、MMP9的蛋白水平，而在高表达GPR87的细胞中观察到这些指标均上调。本研究结果表明，GPR87可通过促进MMPs的表达，溶解细胞基质，增强NSCLC的侵袭能力。

EMT是指上皮细胞在形态学上向间充质细胞表型转变并获得迁移能力的过程，在多种恶性肿瘤的转移中发挥重要作用^［13-14］。当EMT被激活时，肿瘤细胞的E-cadherin表达受到抑制，导致上皮细胞典型的多边形鹅卵石形态丧失，转变为间充质细胞形态的纺锤形，同时N-cadherin、vimentin表达上调^［15］。有文献^［5，16］报道EMT的激活可导致NSCLC的转移。本研究发现，无论GPR87上调还是下调，SK-MES-1和A549细胞中EMT相关标志物的表达都没有显著变化，这表明GPR87不通过EMT途径诱导NSCLC迁移。

RHO/ROCK信号通路在细胞增殖与凋亡、细胞骨架重组与收缩、细胞变形、运动及黏附中发挥重要作用^［17］。RHOA和RHOC主要调控肌动蛋白聚合、基底膜分解和皮质收缩，ROCK1通过调节肌球蛋白磷酸化来重构肌动蛋白细胞骨架，通过迁移细胞的前缘和后缘调节细胞迁移^［18］。本研究的结果显示，当GPR87在SK-MES-1和A549中低表达时，RHOA、RHOC和ROCK1的表达量相应地降低；当GPR87高表达时，RHOA、RHOC和ROCK1的表达也相应上调。这些结果与GPR87诱导Gα12/13-RHO/ROCK依赖性细胞迁移的报道一致^［19］。该结果提示，GPR87可通过激活RHOA/ROCK1信号通路促进NSCLC细胞的迁移能力。

据报道，ROCK1的下游有许多信号分子，其中也包括MMPs。GPR87被激活后，可促进RHO/ROCK1/MMPs介导的卵巢癌细胞侵袭和迁移^［20］。在前列腺癌中，ROCK1可通过靶向LIMK1和MMP2，促进PC-3和DU145细胞的侵袭和迁移^［21］。根据本研究结果提示，GPR87可能通过激活RHOA/ROCK1信号通路，促进下游MMPs的表达，进而促进NSCLC的侵袭与转移。

综上，本研究发现：GPR87的高表达与NSCLC的侵袭和转移密切相关；在SK-MES-1和A549细胞中，GPR87可通过激活RHOA/ROCK1信号通路，促进MMPs的表达，最终促进NSCLC的侵袭与转移。